创伤性脑损伤的可控皮层冲击模型

摘要

创伤性脑损伤（TBI）仍然是一个严重的健康问题。通过使用控制性皮质冲击手术模型，可以开展针对TBI的影响及潜在治疗方法的研究。

摘要

每年有超过一百万美国人遭受创伤性脑损伤（TBI）。结合全球TBI的发生率，其对身体、情绪、社会和经济方面的影响令人震惊。因此，有必要进一步研究TBI的影响及有效的治疗方法。控制性皮质冲击（CCI）模型可诱导从轻度到重度的创伤性脑损伤。该方法使用刚性冲击器，以精确控制的速度向开颅术后暴露的完整硬脑膜传递机械能量，从而在设定参数下实现预定的变形深度。尽管存在其他TBI模型，如自由落体撞击和液体冲击模型，但CCI模型更为精确、易于控制，且最重要的是，所产生的创伤性脑损伤与人类患者所见的损伤更为相似。然而，目前尚无任何TBI模型能够完全复制人类患者中观察到的病理变化。CCI模型可用于研究TBI的短期和长期影响，例如神经元死亡、记忆缺陷和脑水肿，以及潜在的TBI治疗手段。

引言

创伤性脑损伤（TBI）是指由外力引起的脑功能改变或存在其他脑部病理学证据¹。TBI 仍是全球范围内严重的健康问题，尤其是在美国。根据美国疾病控制与预防中心的数据，美国每年至少发生 170 万例 TBI，占所有与损伤相关死亡的 30.5%。仅在 2000 年，美国 TBI 的直接医疗费用和间接费用总计估计达 765 亿美元。尽管过去几十年在技术和治疗方面取得的进展改善了 TBI 患者的生活质量和生存时间，但目前尚无有效的药物或预防性治疗方法。由于 TBI 具有复杂且广泛的影响，包括组织损伤、细胞死亡和轴突退变，因此没有两种损伤是完全相同的；因此，目前尚无任何动物 TBI 模型能够准确再现人类 TBI 的所有方面。然而，动物模型确实能够产生几乎一致的损伤，有助于研究 TBI 的各种影响，从而进一步理解 TBI 的临床表现。

控制性皮层冲击（CCI）模型利用冲击系统对动物暴露的硬脑膜施加物理冲击，可诱导出从轻度到重度的创伤性脑损伤（TBI），其程度与人类所经历的损伤相似。该损伤模型最初在雪貂中建立²，随后被改进用于大鼠^3,4、小鼠^5-7和绵羊⁸。自首次建立以来，损伤部位已被设置于中线部位^2,9或外侧皮层¹⁰。CCI 提供了一种简便且精确的方法，用于研究创伤性脑损伤的效应及其潜在治疗方法。

除了CCI模型外，液体打击和重物坠落模型也常用于制备创伤性脑损伤（TBI）。然而，这些模型存在局限性，包括对损伤参数的控制较弱、产生在人类TBI中未见的组织病理学改变，以及小鼠意外死亡的发生率更高^3,5,10。冲击波模型也被用于制备TBI。尽管冲击波模型无法复制机械撞击后所见的组织病理学改变，但该模型能够准确模拟军事人员所经历的TBI¹¹。由于能够精确控制变形参数（如撞击时间、速度和深度），可控性皮质撞击模型更易于操控⁵。这种精确性使得在整组动物中复制几乎相同的损伤成为可能。最重要的是，CCI模型能够再现人类TBI中所见的损伤特征¹²。然而，目前尚无一种动物模型能够完全成功地复制TBI后观察到的全部病理变化谱系。仍需进一步研究以全面揭示TBI后发生的急性和慢性变化。

创伤性脑损伤（TBI）后会出现两种类型的损伤：原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤发生在撞击瞬间，对治疗干预不敏感；然而，继发性损伤在初始损伤之后持续存在，可通过治疗手段进行干预¹³。控制性皮质冲击模型可产生原发性损伤，从而允许研究人员研究TBI的影响以及针对继发性损伤可能长期效应的潜在治疗方法。利用CCI模型开展的潜在研究领域包括神经元死亡、脑水肿、神经发生、血管效应、组织病理学改变、记忆缺陷等^3,13-16。

方案

动物护理
雄性C57 BL/6小鼠群养，维持在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，可自由获取食物和水。ad libitum。本方案所用动物年龄为10至12周。所有操作均根据印第安纳大学动物护理与使用委员会批准的方案进行。

1. 手术准备

1. 使用氯胺酮/赛拉嗪 混合物（87.7 mg/ml 氯胺酮和 12.3 mg/ml 赛拉嗪） 对小鼠进行麻醉，并通过腹腔注射 给予（1 ml/kg）。
2. 剃除小鼠两耳之间的头部毛发。
3. 在小鼠眼睛上涂抹凡士林 以防止手术期间眼睛干涩。
4. 用10%碘液清洁剃毛区域，然后用70%乙醇擦去碘液。
5. 使用耳杆和门齿固定板将小鼠头部固定于立体定位仪上，确保脑组织稳定。

2. 开颅术

1. 使用剪刀在头部正中做一纵向切口。用止血钳将皮肤向左侧牵开并固定。
2. 用棉签清除骨面上的血液和组织，暴露颅骨。让暴露的颅骨干燥1分钟。
3. 用镊子施加压力，确保颅骨保持不动。确定解剖标志：人字缝（后部）和冠状缝（前部）。在人字缝与冠状缝的中点处画一个直径4 mm、距中线0.5 mm的圆圈。
4. 使用钻头沿标记的圆圈进行切割。轻轻吹去骨屑。切勿将颅骨完全钻透，以免损伤硬脑膜。
5. 用镊子移除骨片，暴露硬脑膜。

3. 撞击法

撞击系统包括一个用于设定撞击参数的控制箱、一个执行撞击的致动器，以及一个用于固定致动器和小鼠头部以进行撞击的立体定位框架。

1. 手术前将致动器的速度预设为 3 m/sec。
2. 预设不同的形变深度以诱导不同严重程度的损伤。形变深度为 0.0–0.2 mm、0.5–1.0 mm 和 1.2–2.0 mm 时，分别对应轻度、中度和重度创伤性脑损伤（TBI）。本方案描述了如何使用 3 m/sec 的速度实现形变深度为 1 mm 的中重度脑损伤。
3. 将致动器安装至立体定位架上的支架，并使用微操纵器移动致动器，使其圆形平头端（直径 3 mm）固定于暴露颅骨区域的中心位置，然后调整其角度，使致动器尖端与撞击部位表面平行。
4. 通过在伸展模型中下移致动器，使其尖端接触撞击部位表面，以此建立零点，随后将立体定位控制面板上的 Z 轴通道设为零。
5. 在回缩撞击头的同时，同步将致动器下移 1 mm。
6. 按下撞击按钮，对损伤部位进行撞击，实现 1 mm 的形变深度。

4. 损伤部位闭合

1. 使用棉签清除撞击后残留的血液，但不要触碰受伤区域。
2. 将小鼠放置在加热垫上以维持体温。
3. 待出血停止后，缝合伤口。将动物放回洁净的笼子中，并在加热垫上过夜恢复。
4. 术后连续2天，每8-12小时皮下注射一次 Buprenorphine 0.05-0.10 mg/kg 。

结果

控制性皮层冲击模型可产生从轻度到重度不同程度的创伤性脑损伤（TBI）。冲击后，冲击部位颅骨的肿胀程度、出血情况以及颅骨变形程度可反映由冲击速度和变形深度参数所导致的损伤严重性。轻度TBI表现为冲击部位颅骨肿胀，并因硬脑膜轻微破裂而出现少量出血。中度TBI则因冲击时硬脑膜破裂，表现出更明显的颅骨肿胀和出血增加（图1）。中度与重度TBI之间的区别在活体上可能难以分辨，需通过显微镜观察固定后的组织才能明确（图2）；然而，重度TBI有时在冲击后即可表现出更显著的形态扭曲和颅骨肿胀。CCI模型可用于研究TBI多个方面的效应，包括组织变形（图2）、神经元死亡以及组织病理学变化。

讨论

使用电子磁力冲击系统成功制备稳定一致的创伤性脑损伤（TBI）模型以产生颅脑撞击伤（CCI）最关键的步骤包括：1）将小鼠头部稳定固定于立体定位仪框架中；2）在不同小鼠之间制备相同大小的骨窗，并在去骨瓣过程中去除颅骨的同时避免损伤其下方的硬脑膜；3）在冲击前将冲击头准确置于骨窗中央位置，并建立零点定位。

在进行撞击前，必须将小鼠头部非常牢固地固定在立体定位仪框架中。固定不牢会导致损伤程度出现较大变异。为确保固定稳定，可在小鼠头部固定于立体定位仪框架后，使用镊子对颅骨施加压力，并确认颅骨保持不动。需采取预防措施，避免暴露的颅骨发生感染。在暴露颅骨后，进入控制性皮质撞击手术中最困难的步骤：在不损伤下方硬脑膜的前提下，于颅骨上钻出一个环形切口。

钻头尖端的最佳尺寸为0.5 mm。合适的转速为10,000-20,000 rpm；然而，使用更高的转速有助于钻出更理想的骨窗。钻孔过程中会产生热量，可能损伤脑组织，尤其是在颅骨与硬脑膜紧密贴附的幼年小鼠中。为防止脑组织受损，钻孔时应向颅骨表面滴加生理盐水。滴加生理盐水后，需使用解剖显微...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7.5% 聚维酮碘	Purdue product L.P.		外科刷洗
棉签	Henry Schein	100-6015	清除血液和碎屑
剪刀	Fine Science Tools	14084-08	手术
镊子	Fine Science Tools	11293-00	手术
止血钳	Fine Science Tools	13021-12	手术
可充电无线微型钻机	Stoelting	58610	与钻头配合使用以制作骨窗
微型钻机用钻头	Fine Science Tools	19007-05
单股缝合线	Ethicon	G697	缝合
叔戊醇	Sigma	152463-250ML	配制 2.5% Avertin
2,2,2-三溴乙醇	Sigma	T48402-25G	配制 2.5% Avertin