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用于骨骼肌疾病的开放场活动监测系统的行为与运动功能测量

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DOI：

10.3791/51785

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2014年9月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genetic Medicine Research, Children's National Medical Center, 2Department of Integrative Systems Biology, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

本文内容

摘要

旷场活动水平用于评估运动和行为活动水平。本方案为神经肌肉疾病临床前试验提供了一个设计完善、标准化的操作流程。

摘要

开放场活动监测系统可全面评估小鼠的运动和行为活动水平。该工具可用于评估神经肌肉疾病动物模型中的运动功能障碍，以及可能改善运动能力和/或肌肉功能的治疗药物的疗效。开放场活动测量所提供的指标不同于通常通过抓力测量来评估的肌肉力量。此外，结合其他结局指标使用时，该方法还可反映药物对其他身体系统的影响。同时，诸如总移动距离等指标可对应于临床试验中的6分钟步行测试这一结局指标。然而，开放场活动监测也存在显著挑战：开放场活动测量结果会因动物品系、年龄、性别和昼夜节律的不同而变化。此外，室温、湿度、光照、噪音甚至气味都可能影响评估结果。总体而言，本文提供了一套经过充分验证且标准化的开放场活动标准操作程序（SOP），适用于神经肌肉疾病动物模型的临床前试验。我们讨论了重要注意事项、典型结果、数据分析方法，并详细阐述了开放场测试的优缺点。此外，我们还就临床前试验中使用开放场活动监测时的最佳实验设计提供了建议。

引言

动物模型在研究疾病机制方面具有重要作用，但其在预测临床试验治疗效果方面的实用性经常受到质疑1-3。每年都有大量“前景良好”的临床前研究发表，然而，当这些干预措施进入临床试验阶段时，仅有极少数显示出积极结果。这些差异通常归因于发表偏倚、过于乐观的结论，以及设计和实施不严谨的临床前研究，从而导致结果不可重复1-3。

随着神经肌肉疾病药物研发的不断进步，人们对设计严谨的临床前试验需求日益增加。尤其需要能够以标准化和盲法方式进行、并具有经过验证、可重复且可转化结局指标的严格方法学。作为先天性肌肉疾病联盟（Congenital Muscle Disease Consortium）的成员，为了开展更为严谨的临床前研究，我们在此分享开放场活动检测的标准操作程序（SOP）。该SOP此前已通过验证4，并作为TREAT-NMD针对杜氏肌营养不良症（DMD）动物模型的SOPs的一部分公开发表5。我们已应用此方法在多种神经肌肉疾病动物模型中对药物的治疗效果进行表型分析和药效评估，其中包括先天性肌营养不良症（CMD）的动物模型——Lama2dy-2J/J（Dy2J）小鼠6,7。本文即改编自我们此前发表的TREAT-NMD SOP5。

开放场活动监测系统可全面评估小鼠的运动和行为活动水平，这些指标可与运动功能相关联。该测试还广泛用于评估类似焦虑和探索性行为。 8-10特别是，敞箱实验是评估神经肌肉疾病动物模型中运动功能障碍的有效工具。11,12 以及可能改善运动能力 和/或 运动功能的治疗药物的疗效 6,7,13,14开放场地活动评估提供了一种不同于肌肉力量的测量方法（肌肉力量通常通过握力测定），并可揭示药物对其他身体系统的影响 即 中枢神经系统）以及5此外，旷场活动度指标中的总移动距离与6分钟步行试验相对应，后者是临床试验中用于评估次最大运动表现的结局指标。 和生活质量15,16总体而言，这使得旷场活动测试成为临床前试验中有益的次要或辅助性结局指标。然而，旷场活动监测系统也存在显著的挑战。该测试属于行为学检测，结果可能具有较大变异性，因为它受到多种外部因素的影响。例如，该行为可受探索驱动力的影响（即 认知、焦虑、疾病、昼夜节律、环境因素、遗传背景，以及运动输出10因此，必须在受控环境下以标准化的方式进行该检测。本文详细介绍我们实验室的开放场活动检测标准操作流程（SOP），提供逐步操作步骤，并进一步讨论控制环境条件的重要注意事项，以帮助减少变异；同时详述典型实验结果、数据分析方法，以及该评估方法的优势与局限性。

方案

注意：旷场活动监测系统使用一个旷场有机玻璃箱，箱体周围等距分布着光电发射器和接收器（图1）。这些光电发射器和接收器形成一个由不可见的红外光束构成的x-y平面网格。当动物被放入箱内后，其移动会导致光束被阻断。系统还配备有垂直传感器，用于评估动物的垂直活动水平（即直立行为）。分析仪记录光束阻断信息并快速进行分析，计算机软件随后在预设的时间段内计算出多种活动参数，包括：水平活动量（单位）、垂直活动量（单位）、总移动距离（cm）、运动时间（sec）和静止时间（sec）5。

注意：通常情况下，测试房间应控制温度和湿度，并保持均匀照明。测试装置应在房间内均匀分布，避免置于直射光、阴暗角落或阴影区域。所有仪器的适应环境过程及测试操作均应每天在同一时间进行。例如，且在早晨由相同的操作人员完成。这些操作人员应对其所处理动物的处理分组和基因型（如可能）保持盲态。

以下方案已在儿童国家医疗中心动物护理和使用委员会（IACUC）的指导和批准下实施。

1. 仪器适应

  1. 将小鼠连同其饲养笼一起放入测试房间，适应约10分钟。适应期间离开房间。
  2. 返回测试房间并打开活动记录箱。尽管此时不采集数据，此操作可进一步模拟实际测试环境。
  3. 轻柔地将每只小鼠从其饲养笼中取出，并立即放入测试箱中。若活动箱内有中心隔板将箱体分为四个象限（图1），则将每只小鼠放入一个空的象限中。
  4. 所有动物均放入测试箱后，为每个测试箱盖上盖子。在此适应期间离开房间。
  5. 60分钟后返回房间，取下每个测试箱的盖子，并轻柔地将每只小鼠放回其相应的饲养笼中。
  6. 使用消毒剂和纸巾清洁每个测试箱，确保箱内无任何残留颗粒。
    注意：若每天进行多个测试批次，每批次之间必须彻底清洁每个测试箱。
  7. 连续4天重复步骤1至6。
    注意：在首次数据采集前一周进行适应性训练。若在研究过程中对动物进行多次测试，仅在第一次测试前进行适应性训练，以避免习惯化效应。此外，每次测试时应随机分配动物至不同的测试箱，并在整个研究期间记录各动物的箱位分配情况。

2. 数据采集

  1. 将小鼠连同其饲养笼一起放入测试房间，适应环境10-30分钟。在此期间离开房间。
  2. 经过10-30分钟适应后，返回测试房间。打开活动记录箱，并启动连接该设备的计算机上的配套软件。如果记录箱配有象限分隔板，请此时插入分隔板。
    注意：若测试箱内含有象限分隔板，则在数据采集期间可同时放置两只动物。一只动物置于前左象限，另一只置于后右象限（图1）。
    注意：在数据采集期间，不得在四个象限中均放置动物，也不得将动物放置在同一行或同一列。此类布局会干扰红外光束的x-y网格，导致动物运动被错误测量。
  3. 在计算机软件中设置预光束检测功能。此设置可在实验装置完成后、将动物放入测试箱之前运行预光束检测（见下文）。
    注意：运行预光束检测时，计算机软件将评估x-y方向红外光束的功能状态。例如，可判断光电发射器和接收器是否被遮挡，从而无法准确检测箱内动物的运动。
  4. 在计算机软件中设定主要数据采集参数，采集六个10分钟时间段的数据（即总共采集60分钟数据），然后输入相应的日期、文件名和小鼠ID编号。
  5. 所有参数设置完成后，运行预光束检测。若某测试箱未能通过检测，最可能的原因是中心象限分隔板或测试箱未正确对齐。若出现此情况，请重新调整中心象限分隔板和测试箱，直至传感器不再被遮挡且系统显示测试箱已准备就绪。若问题仍未解决，请参考仪器使用手册。
  6. 当所有测试箱均准备就绪后，轻柔地将小鼠从其饲养笼中取出，并立即放入测试箱中。记录小鼠ID，并确保其与计算机中输入的信息一致。
  7. 当所有动物均正确放入测试箱后，为每个测试箱盖上盖子，然后在计算机软件中选择相应命令以开始数据采集。此时，分析仪和软件将根据设定的采集参数开始记录活动水平。
  8. 在剩余测试期间离开测试房间。
  9. 测试期结束后（即60分钟后），立即返回测试房间。保存数据，然后将每只动物放回其各自的饲养笼中。
  10. 使用消毒剂和纸巾清洁所有设备。
    注意：若每天进行多个测试批次，每次测试之间必须彻底清洁每个测试箱。
  11. 将数据导出至电子表格，然后退出软件程序。
  12. 检查数据以确认其已被成功记录。若数据未被记录，或动物在整个数据采集期间始终处于静止不动状态，则需额外增加一天的数据采集。
    注意：若动物在整个60分钟测试期间完全不动，则被视为“睡眠”状态。
  13. 连续4天重复步骤2.1-2.12。
    注意：若在研究过程中需在多个时间点对动物进行测试，为避免习惯化效应，开放场活动测量每月不得超过一次。此外，每次测试应随机分配动物至不同的测试箱，并在整个研究期间记录各动物的箱体分配情况。

3. 数据分析

  1. 计算每只小鼠及其分组的平均水平活动量（单位）、垂直活动量（单位）、总移动距离（cm）、运动时间（sec）和静止时间（sec）。计算机软件会计算并报告每只小鼠在数据采集期间（即 60 分钟）的总水平活动量（单位）、垂直活动量（单位）、总移动距离（cm）、运动时间（sec）和静止时间（sec）。根据连续 4 天的数据采集结果，计算上述各项参数的平均值。
  2. 在进行任何统计分析之前，使用 Shapiro-Wilk 检验评估数据的正态性，并使用 Grubb’s 检验检测异常值。剔除具有显著性的异常值（p <0.05）。
  3. 对于符合正态分布的数据，根据处理组的总数，采用独立样本 t 检验或单因素方差分析（ANOVA）及事后检验（post-hoc test），并对 p 值进行多重比较校正，以比较组间均值差异。
  4. 对于不符合正态分布的数据，根据处理组的总数，采用 Wilcoxon 秩和检验或 Kruskal-Wallis 检验及秩和检验，比较组间中位数差异，并对所得 p 值进行多重比较校正。

结果

在分析开放场地活动数据时，我们重点关注少数几个可评估活动水平的测量指标，这些指标通常反映动物的运动功能。这些参数包括：水平活动、垂直活动、运动时间、静止时间以及总移动距离。通常情况下，肌肉功能下降的动物活动较少，行走活动能力较低。这通常表现为水平活动、垂直活动、总移动距离和运动时间减少，而静止时间增加5,6,12,17。相反，肌肉功能未受损的动物，或接受治疗后减缓了肌肉病理恶化进程的动物，则更可能表现出较高的活动水平6,7,14,17。

为了展示在神经肌肉疾病动物模型中使用本方案所获得的典型结果，我们提供了此前在Dy2J先天性肌营养不良（CMD）动物模型中开展的一项纵向研究的数据6。简言之，Dy2J模型携带截短形式的LAMA2基因，导致后肢瘫痪、脱髓鞘以及骨骼肌营养不良性改变。这些小鼠表现出的肌肉病理变化会影响其活动水平。例如，在整个研究期间，与同龄同性别BL/6野生型对照组相比，Dy2J小鼠的水平活动水平较低，移动距离也较短（图2）；然而，这些差异并不总是具有统计学意义。差异无统计学意义最可能的原因是样本量较小，以及BL6组内数据变异较大。组内变异在开放场活动数据中较为常见；但这些数据特别缺乏足够的检验效能，无法确定各组之间是否存在统计学差异。通常应使用n = 10–12的样本量才能检测到具有统计学意义的差异5,17。例如，在SJL研究中采用较大样本量时（见图3B、3D和3E中的第二个BL6柱状图），各组之间的显著差异即可被观察到。Dy2J动物还表现出垂直活动水平完全丧失，这与其后肢瘫痪相对应，进而导致无法直立（图2B）6。最后，值得注意的是活动水平存在性别差异。例如，雌性小鼠通常比雄性更活跃，表现出更高的水平活动、垂直活动以及总移动距离（图2）；但这些差异同样无统计学意义。

我们还提供了来自其他神经肌肉疾病动物模型的几项既往研究的数据，以强调影响活动水平的若干其他因素（图3）。例如，活动水平因遗传背景而异10。与同龄、同性别匹配的BL6野生型小鼠相比，BL10野生型小鼠表现出更高的水平活动、垂直活动以及更大的总移动距离（图3）。这一观察结果值得注意，因为在研究中若使用了不恰当的对照品系，可能导致数据无法使用。其次，活动水平因疾病模型和表型而异（图3）。例如，SJL小鼠是肢带型肌营养不良症-2B型（LGMD-2B）的动物模型，其水平活动和总移动距离最低，其次为Dy2J小鼠和mdx小鼠，后者是杜氏肌营养不良症的动物模型（图3A、3C）。然而，由于后肢瘫痪，Dy2J小鼠的垂直活动水平最低（图3B）。还需注意的是，mdx表型中较高的活动水平很可能归因于BL10背景品系本身较高的活动水平。最后，该图强调了检测时动物年龄及疾病病理状态的重要性。例如，在30周龄时，mdx小鼠与其同龄、同性别匹配的BL10野生型对照小鼠之间的活动水平无显著差异（图3）。但在6周龄时，即mdx小鼠模型坏死相高峰期，mdx小鼠的垂直活动和水平活动均显著降低。总移动距离也有所下降，但差异未达显著性（图3）4。

DNA分离实验的电泳槽装置；可见四个编号区域。
图1. 开放旷场活动实验装置。 两种带有中央象限分隔器和顶盖的开放旷场装置。若配有可拆卸的中央象限分隔器，在测试期间应仅将动物放置于每个箱子的左前象限（1, 3）和右后象限（2, 4），以获得有效的测量结果。

雄性和雌性活动分析图、年龄与活动关系、实验结果。
图 2. 开放场地活动数据。 Dy2J（灰色线，n = 3）与年龄和性别匹配的BL6对照品系（黑色线，n = 3）小鼠在14、19、23、25和30周龄时典型的开放场地活动数据（A - F）。A）雄性水平活动（任意单位），B）雌性水平活动（任意单位），C）雄性垂直活动（任意单位），D）雌性垂直活动（任意单位），E）雄性总移动距离（cm），F）雌性总移动距离（cm）。数据连续收集4天，按每只小鼠及每组取平均值。同一小鼠在每个时间点均进行测试。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。数据先前已发表6。在每个时间点，采用独立样本t检验比较Dy2J与BL6小鼠。P值 <0.05被认为具有显著性差异。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。

小鼠活动量与移动距离的柱状图，显示年龄和基因型对运动行为的影响。
图3.多种品系小鼠的旷场活动数据。 来自不同年龄的雄性BL10（6周龄，n = 8；25–30周龄，n = 10）、mdx（6周龄，n = 9；25–30周龄，n = 15）、BL6（Dy2J小鼠的对照组，n = 3；SJL小鼠的对照组，n = 13）、Dy2J（n = 3）和SJL（n = 13）小鼠的典型行为活动数据。A) 6周龄和25–30周龄BL10与mdx小鼠的水平活动（任意单位）数据，B) 25–30周龄BL6、Dy2J和SJL小鼠的水平活动（任意单位）数据，C) 6周龄和25–30周龄BL10与mdx小鼠的垂直活动（任意单位）数据，D) 25–30周龄BL6、Dy2J和SJL小鼠的垂直活动（任意单位）数据，E) 6周龄和25–30周龄BL10与mdx小鼠的总移动距离（cm）数据，以及F) 25–30周龄BL6、Dy2J和SJL小鼠的总移动距离（cm）数据。Dy2J：以BL6为背景的伴laminin α2基因突变的先天性肌营养不良（CMD）动物模型；SJL：肢带型肌营养不良2B型（LGMD-2B）动物模型；mdx：以BL10为背景的杜氏肌营养不良（DMD）动物模型。SJL小鼠无dysferlin充足的对照组。数据以均值±标准误（SEM）表示。B、C和D中的数据此前已发表6,17。数据不符合正态分布，因此采用Wilcoxon秩和检验进行比较。显著性水平设定为p < 0.05。对每个参数进行了以下比较：a) 6周龄BL10与mdx小鼠，p < 0.05；b) 25–30周龄BL10与mdx小鼠，无显著性差异；c) 25–30周龄Dy2J小鼠与匹配的BL6对照品系小鼠，p < 0.05；d) 25–30周龄SJL小鼠与匹配的BL6对照品系小鼠，p < 0.001；e) 25–30周龄BL10小鼠与25周龄作为Dy2J小鼠对照组的BL6小鼠，p < 0.01；f) 25–30周龄BL10小鼠与25–30周龄作为SJL小鼠对照组的BL6小鼠，p < 0.001。

讨论

旷场活动度测量是一种体内检测方法，可用于评估神经肌肉疾病动物模型中的疾病进展和药物疗效6,7,11-14。如图2所示，该方法可评估活动水平，通常反映运动功能。这与肌肉力量的测量不同，因此在临床前药物研究中，可作为理想的次要或辅助性结局指标。此外，该方法具有临床相关性15，且为非侵入性检测，可在研究过程中多次重复进行。然而，行为和运动活动也受到其他因素的影响（例如实验人员操作、环境条件和认知功能），从而导致旷场活动数据出现变异。本文旨在提供一种经过充分验证且标准化的操作方案，以减少变异，使不同实验室之间的结果具有可比性，从而推动本领域的转化研究进展。

该检测方法的一个主要缺点是其变异性较高，并受多种外部因素影响。然而，我们在制定实验方案时已充分考虑了这一点。我们评估了多种测试方案，其数据采集持续时间从1至5天不等。最终确定，在数据采集前进行仪器适应性训练，使动物熟悉测试舱环境，并进行为期4天的数据采集，可显著降低结果数据的变异程度5。该方案最初设计用于评估mdx小鼠模型的行为和运动活动水平；但最近也已在Dy2J动物模型中得到验证6。建议在将该方案用于临床前试验之前，先在实验室内部针对每种动物模型进行标准化。

旷场活动能力因遗传背景17、性别18-20、年龄18和昼夜节律21而异。因此，必须在同一时间段内对相同年龄、性别和遗传背景的动物进行评估。在实验设计阶段，应仔细考虑在哪些年龄点评估旷场活动水平。每种动物模型都有其独特的疾病进展过程以及运动和行为表型，其严重程度随年龄而变化6,15 （图2 和 图3）。因此，确定具有临床和病理学意义的时间点来评估旷场活动指标至关重要。每个处理组所需动物总数因动物模型、年龄和性别不同而异，因此在实验设计阶段还应进行相应的样本量计算，以确定每个处理组为检测到统计学显著差异所需的动物总数。这些计算还应考虑研究中使用的其他结局指标（例如，握力测量或组织学分析）。根据我们的功效计算，通常每个处理组使用10–12只动物。此外，应特别注意研究中所使用的对照品系。在临床前研究中，常存在使用不恰当对照品系的倾向。例如，BL6小鼠常被用作mdx小鼠的对照品系；然而，mdx小鼠的遗传背景为BL10。如图3所示，BL10小鼠的活动性明显高于BL6小鼠，这使得mdx小鼠与BL6小鼠的数据无法直接比较。在使用mdx小鼠进行临床前研究时，应选用BL10小鼠作为对照品系。此外，若研究使用Dy2J小鼠，则应使用BL6小鼠作为对照品系。

微小的环境变化也可能显著影响动物的活动水平，这些因素包括光照、温度、湿度、气味、噪音以及人类活动4,15。因此，每天应在温度和湿度受控、采用非直射光源的房间内，并在相同时间进行实验，这一点非常重要5。测试箱应在房间内均匀分布，避免置于直射光下或阴影区、黑暗角落5。每天应将动物随机分配至各个测试箱，以减少房间内不同位置环境条件差异带来的影响，并在数据采集前让动物在测试房间内适应10–30分钟。务必在整个研究过程中记录每只动物所使用的测试箱编号，以确保不同处理组间箱体/环境因素的影响得到均衡分布。将动物放入测试箱以及在研究过程中接触动物的操作人员应尽可能对处理分组和动物品系保持盲法。在许多情况下，目标基因型动物与对照组存在明显差异，难以实现完全盲法操作；然而，操作人员在处理组与未处理组之间应始终保持盲法。此外，数据采集期间所有人员应离开房间，以减少室内噪音和干扰，且每次数据采集结束后应对所有测试箱进行彻底清洁。这些措施将显著降低数据的变异性。需要注意的是，动物也极易产生适应性15。因此，建议每天完成60分钟数据采集后立即将动物移出测试箱，且开放场活动水平的评估每月不应超过一次。

总移动距离和总运动时间的测量通常是开放旷场活动中最敏感的指标5。在Dy2J模型中，垂直活动的测量通常是最敏感的开放旷场活动指标（图3）；然而，在体型较小的动物中，准确捕捉垂直活动数据可能较为困难。例如，体型较小的动物可能发生直立行为，但由于垂直传感器的高度限制，传感器可能无法检测到该动作。因此，我们建议测试动物的年龄不应早于5周龄。此外，动物也可能在整个数据采集过程中处于睡眠状态。若出现这种情况，应增加一天的数据采集时间。最后，旷场箱中象限分隔板的对齐不良或传感器被遮挡，也可能导致数据不准确。因此，在测试前必须进行传感器预检，并在每次数据采集结束后仔细审查所有数据。

分析旷场活动数据时也应谨慎。旷场活动数据往往呈非正态分布，并可能含有离群值4。在进行任何统计分析之前，我们的生物统计学家强烈建议先对数据进行正态性检验和离群值检测。如果数据呈非正态分布，在比较均值时应考虑使用非参数检验方法。此外，所有数据应由对处理分组情况设盲的研究人员进行分析。

总体而言，开放场地活动检测具有以下主要优势：a）它能够全面评估动物的运动功能和行为活动，这两者与运动功能密切相关，但并非总是完全一致；b）该检测操作简便；c）检测过程中无需对动物进行人为干预；d）它是一种非侵入性检测方法，可在研究期间多次重复进行；e）执行该检测无需特殊培训；f）可同时检测多只动物；g）它是一项具有临床相关性的结局评估指标5,16。然而，在测试治疗药物时需注意，其他因素可能影响动物的行为，从而影响开放场地活动的测量结果。药物可能对中枢神经系统（CNS）或其他全身系统产生作用，且动物行为也可能受到应激环境的影响。因此，很难判断运动或行为活动水平的变化究竟是源于肌肉功能或肌力的改变，还是药物副作用所致。因此，还应同时开展其他功能性、组织学或分子水平的检测。该标准化方案也已成功应用于其他肌肉疾病的研究4,17；然而，如图3所示，应首先开展预实验，以评估该检测方法在特定动物模型中的敏感性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本出版物由治愈先天性肌营养不良症组织（Cure CMD）、法国肌营养不良协会（AFM）、美国肌营养不良协会转化研究基金、美国国立卫生研究院（1K26RR032082、1P50AR060836-01、1U54HD071601、2R24HD050846-06）、美国国防部（W81XWH-11-1-0330、W81XWH-11-1-0782、W81XWH-10-1-0659、W81XWH-11-1-0809、W81XWH-09-1-0599）以及来自家长项目肌营养不良组织（Parent Project Muscular Dystrophy，PPMD）的一项试点基金资助。

本文是先天性肌肉疾病领域常用方法系列标准操作规程（SOP）中的其中一篇。该文反映了2013年4月在美国华盛顿特区举行的先天性肌肉疾病联盟研讨会期间，由该领域20多位专家讨论并确立的相关成果。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
VersaMax 开场活动监测系统，配备丙烯酸测试室及 X、Y、Z 轴传感器AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA已停产
Fusion 开场活动监测系统，配备丙烯酸测试室及 X、Y、Z 轴传感器Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA目前市场上推荐使用的系统
计算机Dell, Inc. 
材料
Virkon-S 广谱消毒剂（过一硫酸氢钾/氯化钠）Pharmacal Research Laboratories, Inc.
小鼠
B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J)Jackson Lab000524
C57BL/6J (BL6)Jackson Lab000664
SJL/J (SJL)Jackson Lab000686
C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx)Jackson Lab001801
C57BL/10ScSnJ (BL10)Jackson Lab000476

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