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肩胛间棕色脂肪组织的切伦科夫发光成像

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DOI：

10.3791/51790

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2014年10月7日

 ,  ,  , 
1Molecular Imaging Laboratory, MGH/MIT/HMS Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School, 2Center for Drug Discovery, School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, 3Perkin Elmer

本文内容

摘要

在本视频报告中，我们展示了切伦科夫发光成像（CLI）技术在小鼠肩胛间棕色脂肪组织中的应用，涵盖其在激活状态和抑制状态下的成像结果。

摘要

棕色脂肪组织（BAT），通常被称为“有益脂肪”，在哺乳动物的产热过程中发挥着关键作用。这种特殊组织与新陈代谢和能量消耗密切相关，其功能障碍是导致肥胖和糖尿病的重要因素之一。与以往观点相反，近期的PET/CT成像研究表明，人类成年人体内仍然存在棕色脂肪组织。PET成像明确显示，在特定条件下，BAT对18F-FDG具有显著的高摄取。在本视频报告中，我们展示了利用18F-FDG进行切伦科夫发光成像（CLI），可用于在小型动物体内对棕色脂肪组织进行光学成像。腹腔注射去甲肾上腺素（NE）和冷刺激可诱导BAT激活，而长时间麻醉则会抑制BAT活性。通过多滤光片切伦科夫发光成像，实现了光谱解混和三维成像重建。我们的研究结果表明，使用18F-FDG的CLI技术是一种在小型动物中成像BAT的实用方法，该技术可作为BAT研究的一种经济、快速且可行的替代成像工具。

引言

棕色脂肪组织（BAT）是哺乳动物中一种特殊的产热组织，其主要功能之一是通过将大量化学/食物能量以热能形式耗散，从而维持机体的能量平衡1。BAT最显著的特征包括高表达解偶联蛋白1（UCP-1）、富含多个小脂滴、单个细胞内含有大量线粒体，以及组织中高度血管化2-5。这些独特特征与该组织在代谢和能量消耗中的重要作用密切相关。过去曾认为BAT在成人中已不存在，且无显著生理功能1，但近年来的PET/CT影像学研究已明确证实，BAT在成人中仍然存在2,3,6-9。多项研究已建立BAT质量与体重指数（BMI）之间的负相关关系，近期研究还表明，体育锻炼可增加BAT的质量。这些结果强烈提示，BAT功能障碍与肥胖症和糖尿病的病理过程密切相关2,6,10,11。此外，越来越多的证据表明，BAT的功能还与神经退行性疾病和癌症等多种其他病理状态密切相关3,7,12,13。

棕色脂肪组织（BAT）的激活是一种增强产热的过程，可在多种条件下实现，例如寒冷暴露、运动、药物处理以及基因操作1,14,15。其中，寒冷暴露和去甲肾上腺素处理是最常用的BAT激活方法。寒冷可通过皮肤中的温度感受器等多种机制被感知，进而刺激交感神经，促使去甲肾上腺素（NE）释放至BAT。释放的NE可触发解偶联蛋白-1（UCP-1）启动产热过程，以维持正常的体温。在此条件下，葡萄糖的摄取也随之增加，为BAT中增强的代谢活动提供更多碳源1,16,17。在人体研究中，使用18F-FDG的正电子发射断层成像（PET）已证实，在寒冷条件下标记葡萄糖的摄取量增加6。

从光学成像的角度来看，棕色脂肪组织（BAT）是一个理想的成像靶点。小鼠肩胛间BAT具有独特的位置，远离肝脏、心脏和胃等较大器官，因此这些大器官带来的信号干扰可忽略不计（图1a）。同时，肩胛间BAT位置较浅，有利于检测相机捕获更多信号。此外，BAT是一种结构致密的器官，能够将光信号局限在特定区域。另外，BAT独特的三角形物理形态也使其易于与其他组织区分开来（图1a）。

切伦科夫发光成像（CLI），一种新出现的分子影像技术 18-26，利用了由发光反应产生的光信号 + 和 - 放射性核素（如 18F 和 131I 在培养基中。带电粒子（例如 + 和 -在介质中传播时会使分子极化 18-20，当极化分子弛豫回到平衡状态时会发射出发光/光。这种发射出的发光称为切伦科夫发光（CL）。CL的独特光谱特性包括其在整个紫外（UV）到可见光谱范围内的宽谱分布 18-20，以及强度与波长平方（λ2）。发射光的紫外和可见光范围均可用于不同应用。切伦科夫发光的紫外部分已被应用于 体内 笼锁型荧光素的光激活 21，而较长波长发射的光可用于 体内 光学成像 18,27-31.

对于小动物研究，使用光学成像系统进行切伦科夫发光成像（CLI）比正电子发射断层扫描（PET）更快且更具成本效益。此外，若配备高通量成像系统，CLI还可用于高通量筛选。该技术的优缺点已在多篇综述中进行了讨论25,32,33。多个研究团队已对CLI的三维断层成像进行了深入研究28,34-37，并且CLI在小鼠体内的内窥镜成像和术中成像应用也已成功实现30,38。此外，Spinelli 和 Thorek 等已证明CLI成像可应用于人体受试者，因此该技术在临床应用方面也具有潜力39,40。

在人类棕色脂肪组织（BAT）的重新发现过程中，正电子发射断层扫描（PET）图像明确显示，在特定条件下有大量18F-FDG在BAT中聚集2,3,6。此外，对小鼠进行的PET成像也无可争议地表明，BAT可通过18F-FDG显影4142。在本报告中，我们展示了如何利用18F-FDG发射的切伦科夫发光，结合光学成像系统对小型动物体内的BAT进行成像。该方法为小型动物BAT成像提供了一种快速、廉价且便捷的技术手段。此技术可作为18F-FDG PET成像的替代方法，尤其适用于不具备PET设备的实验室。

方案

注意：所有动物实验均应在经批准的机构方案和动物护理指南下进行。

1. 在体 内 CLI成像BAT 18F-FDG

1.1 背景成像：

  1. 在注射18F-FDG前，将四只裸鼠放入已连接异氟烷与氧气混合气体的诱导室中，持续5分钟以诱导麻醉。随后将四只麻醉后的裸鼠放入成像设备中。
  2. 使用以下参数采集背景图像：滤光片开启，f = 1，bin = 8，视野（FOV）= D，曝光时间 = 120 秒，载物台温度 = 37 °C。

1.2 BAT成像与 18F-FDG

  1. 通过尾静脉向麻醉小鼠静脉注射 280 µCi 的 18F-FDG PBS 溶液。注射后，将小鼠放回配备食物和饮水的笼中。
    注意：必须通过静脉注射 18F-FDG，才能在棕色脂肪组织（BAT）区域获得良好的对比度；若采用腹腔注射相同剂量的 18F-FDG，则仅能观察到非常微弱的对比信号。
  2. 在注射 18F-FDG 后的 30、60 和 120 分钟，使用与背景成像（步骤 1.1.2）相同的参数采集 CLI 图像。每次成像前，预留 5 分钟时间重新诱导麻醉。
  3. 为量化信噪比（S/N），使用成像软件界面在肩胛间棕色脂肪组织（BAT）及其邻近区域（参考区域）分别绘制两个大小相同的椭圆形感兴趣区域（ROI）（图 1b）。

1.3 CLI 源的验证：

  1. 麻醉四只小鼠，并通过静脉注射 280 µCi 的 18F-FDG。
  2. 在注射 18F-FDG 60 分钟后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（200 mg/kg，IP）处死小鼠。小心剥离肩胛间区域的皮肤。使用与上述（1.1.2）相同的参数，同时对所有小鼠进行成像（图 2a）。
  3. 仔细分离肩胛间白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT），然后使用相同参数对解剖后的小鼠进行成像（图 2b）。
  4. 根据化学发光成像（CLI）结果，使用两个感兴趣区域（ROI）并通过以下公式计算 BAT 的贡献率：R(BAT) = (CLIa-CLIb)(BAT)/(CLIa-CLIb)(BAT-removed)，其中 ROIa 对应肩胛间区域，ROIb 对应参考区域（图 2b）。

2. BAT 成像应用

2.1 使用去甲肾上腺素监测激活状态

  1. 将裸鼠分为两组（每组 n = 4）。
  2. 对其中一组小鼠腹腔注射去甲肾上腺素（NE）（50 µl，10 mM）。另一组作为非激活对照组。30 分钟后，用异氟烷麻醉两组小鼠 5 分钟，然后每只小鼠静脉注射 18F-FDG（220 µCi）。
    注意：腹腔注射 NE 应在 18F-FDG 注射前 30 分钟进行，以避免小鼠受到强烈刺激。
  3. 在注射 18F-FDG 后 60 分钟，使用与上述方案相同的参数对小鼠进行成像。

2.2 监测冷暴露条件下的激活状态

  1. 在低温房间内使用直肠温度计测量小鼠的体温，温度应约为 30 °C。
  2. 在注射 18F-FDG 后 60 分钟，采用与上述方案相同的成像参数对小鼠进行成像。以在室温（25 °C）下饲养的小鼠作为对照组，并使用相同的参数进行成像。
  3. 进行冷暴露实验时，在注射 18F-FDG 前将小鼠置于低温房间（4 °C）中 4 小时，并在每次成像结束后以及从麻醉中恢复后，将小鼠重新放回低温房间。
  4. 参数同上。

2.3 在长时间麻醉下监测棕色脂肪组织的失活

  1. 对于长时间麻醉（60 - 70 分钟），通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮/赛拉嗪，并在室温下维持麻醉状态 60 - 70 分钟。
  2. 小鼠麻醉后，经尾静脉静脉注射 18F-FDG（220 µCi）。
  3. 在注射 18F-FDG 后 60 分钟，采用与上述方案相同的参数对小鼠进行成像。

3. 光谱解混与多光谱切伦科夫发光断层成像研究

  1. 将小鼠麻醉5分钟，然后静脉注射300 µCi 18F-FDG。18F-FDG注射60分钟后，从动物背部采集多光谱图像，参数如下：f = 1，bin = 16，每个滤光片采集时间为300秒，发射滤光片波长分别为580、600、620、640、660和680 nm。
  2. 使用Living Imaging 4.3.1软件进行光谱解混，选择两个组分（棕色脂肪组织[BAT]和非特异性信号）并采用自动解混方法（图4）。
  3. 根据Kuo et al.28,43报道的方法进行3D重建。将切伦科夫发射光谱纳入漫射光传播模型，在残差的NNLS（非负最小二乘法）优化中应用Tikhonov正则化，并基于结构光成像生成表面断层图像（用于3D图像共配准）（图5）。
    注意：进行多光谱CLI光谱解混与断层成像时，至少需要5张不同滤光片下的图像。

结果

在图1中，肩胛间棕色脂肪组织（图1a）在所有时间点（30、60、120分钟）均被清晰显示，且棕色脂肪组织与参考区域之间的对比可明显观察到（图1b）。值得注意的是，棕色脂肪组织影像的轮廓与其实际形态高度一致，呈三角形。注射后30、60和120分钟，棕色脂肪组织与参考区域的信号强度比值分别为2.37倍、2.49倍和2.53倍（图1a）。

通过逐步解剖实验发现，肩胛间区域85%的信号来源于棕色脂肪组织（图2）。然而，在棕色脂肪组织上缘附近仍存在部分残留信号，可能来源于棕色脂肪组织的残余组织以及邻近的血管和肌肉等其他组织。

已有报道称，通过去甲肾上腺素（NE）处理或冷暴露可实现棕色脂肪组织（BAT）的激活3,6。首先，我们在同一组小鼠中观察了NE对BAT激活的影响，分别在短时间（5分钟）异氟烷麻醉下有或无NE处理的条件下进行检测。结果显示，经NE处理后的CLI信号显著高于未处理组（1.23倍）（图3a）。

在人体研究中，PET成像显示，与处于室温环境下的受试者相比，暴露于寒冷环境中的受试者在棕色脂肪组织（BAT）中表现出更高的18F-FDG摄取量6。在本项小鼠研究中，经寒冷暴露处理的动物其BAT中的18F-FDG摄取量增加了39%（图3b）。

在小鼠中，不同麻醉方案会影响棕色脂肪组织（BAT）的活性3,41。例如，使用氯胺酮麻醉一小时后，BAT中的18F-FDG摄取会显著降低41。比较同一组小鼠在短时间麻醉（5分钟异氟烷）和长时间麻醉（70分钟氯胺酮/赛拉嗪）条件下18F-FDG的摄取情况，发现使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉组的BAT中18F-FDG摄取减少了54%（图3c）。

众所周知，含血红素的蛋白质（如血液中的血红蛋白和线粒体中的细胞色素c）可导致显著的光吸收，因此预期棕色脂肪组织（BAT）中丰富的血管1会改变化学发光成像（CLI）的光谱，且来自BAT区域的光谱形状将与其他区域不同。可以设想，光谱分离技术可使我们区分这两种CLI光谱。从图4a可见，在组分#1的非混合图像（Unmix #1）中未突出显示任何特定区域，其对应的光谱（图4d中的蓝色曲线）与18F在纯介质中的发射光谱非常相似，其中CLI强度与波长的平方成反比18,20。该数据表明，Unmix #1代表了一种非特异性的CLI信号，可能来源于非常浅层的深度，例如皮肤中18F-FDG的积聚。非混合组分#2光谱的峰值（红线）约为640 nm，提示该信号来源于BAT。有趣的是，与波长小于640 nm的CLI强度显著衰减相反，当波长达到峰值后，强度未出现明显下降（图4中的红线），表明较长波长的发射光具有更好的组织穿透能力。

采用多光谱切伦科夫发光断层成像（msCLT）进行三维重建。msCLT 之前已由 Kuo et al. 28,43 报道，其基于使用多个窄带通滤光片（>5 个滤光片）获取的一组二维平面图像构建而成。重建的三维图像与由结构光生成的表面断层图像进行共定位配准，结果显示大部分 CLI 信号来源于肩胛间棕色脂肪组织（BAT）（图 5）。值得注意的是，冠状面图像（图 5a）清晰地勾勒出 BAT 的两个叶状结构，其形态与 图 5e 中所示 BAT 的三角形轮廓非常相似。

利用光子测量进行组织的活体成像；示意图显示随时间变化的辐亮度分析。
图1：（a）小鼠肩胛间棕色脂肪组织（BAT）的三角形轮廓（蓝色箭头）；（左）BAT被白色脂肪组织覆盖，（右）BAT暴露可见。（b）小鼠静脉注射18F-FDG（280 µCi）后30分钟和60分钟的CLI成像。图像清晰勾勒出BAT的轮廓。（c）对肩胛间BAT区域及参考区域的CLI信号进行定量分析。转载自参考文献42。请点击此处查看该图的放大版本。

Bioluminescence imaging results; left: radiance in mice; right: bar graph, BAT activity comparison.
图2： (a小鼠在去除BAT前（左）和去除后（右）的代表性图像。b) 定量分析表明 >85% 的 CLI 来源于 BAT。引自参考文献 42。 请点击此处以查看此图的放大版本。

生物发光成像结果；辐射强度柱状图；麻醉对小鼠的影响；实验数据。
图3：（a）在短时间异氟烷麻醉下，经去甲肾上腺素（NE）刺激（左）与未刺激（右）小鼠的BAT代表性CLI图像。（b）来自（a）中两组的CLI信号定量分析（每组n = 4）。（c）在短时间异氟烷麻醉下，经冷刺激（左）与未刺激（右）小鼠的BAT代表性CLI图像。（d）来自（e）中两组的CLI信号定量分析（每组n = 3 - 4）。（e）在18F-FDG注射后60 min，分别接受短时间异氟烷麻醉（5 min）（左）与氯胺酮/赛拉嗪麻醉（70 min）（右）的小鼠BAT代表性CLI图像。（f）来自（g）中两组的CLI信号定量分析（每组n = 4）。转载自参考文献42。请点击此处查看此图的高清版本。

体内光谱分析；发射映射、辐射成像、强度图；荧光研究。
图 4： 非特异性化学发光成像（CLI）与棕色脂肪组织（BAT）CLI 的光谱解混。 （a）解混 #1 显示，来自 18F-FDG 的非特异性 CLI 信号分布于全身（该图像的解混光谱见（d）中的蓝色曲线）。 （b）解混 #2 表明，肩胛间区域的大部分 CLI 信号来源于棕色脂肪组织（BAT）（其解混光谱见（d）中的红色曲线）。CLI 发射峰位于约 640 nm 处。 （c）解混 #1 与 #2 的合并图像。 （d）解混 #1 与 #2 的 CLI 光谱。转载自参考文献 42。 请点击此处查看该图的高清版本。

大鼠PET/CT成像；横截面显示示踪剂分布；冠状面、矢状面、横断面视图。
图5： 多光谱切伦科夫发光断层成像。（a - d）图像的三维重建。在冠状面（a）、矢状面（b）和横断面（c）视图以及三维图像（d）中均可观察到肩胛间棕色脂肪组织（BAT）；（e）显示实际的BAT形态（蓝色箭头），与重建图像相吻合。转载并改编自参考文献42。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

关于棕色脂肪组织（BAT）的研究已进行了数十年。过去，人们认为BAT在人类成年期并无显著的生理学意义1。然而，近年来通过18F-FDG进行的大规模临床PET成像及其他研究证实，BAT在成年人的上胸部、颈部及其他部位仍然存在2,3。最近的研究强烈表明，BAT在肥胖症和糖尿病中发挥着重要作用2,6。其他研究还指出，BAT在衰老过程中也具有重要功能12，且其活性可通过运动加以增强10,44。

在临床人体研究和临床前研究中，均采用PET成像 18F-FDG 是研究 BAT 最常用的方法。然而，对于临床前动物研究而言，PET 通常比光学成像昂贵得多。在本方案中，我们展示了使用 CLI 与 18F-FDG 可用于小动物棕色脂肪组织的光学成像。与其他光学成像技术类似，切伦科夫发光成像（CLI）的固有局限性在于组织穿透深度有限，且对深层目标的灵敏度较低。 25,32然而，最近Spinelli 等 证明在10 mm组织深度下仍可观察到良好的CLI信号 32P 28,43，以及 Thorek 等. 表明在患者淋巴结中可实现16 mm的穿透深度 18F-FDG 注射 39,40与PET成像相比，CLI可使用成本相对较低的成像系统进行。最近，Thorek 等 证明了使用化学发光免疫分析法（CLI）在极低样本量下仍可实现显著的高灵敏度 18F-FDG 在患者淋巴结中聚集（约 2Ci） 39,40. 体外 测试结果表明，溶液中0.01 Ci 90Y的CLI信号可被检测到 25,32,33此外，化学发光成像还具有高空间分辨率的潜力，并可实现高通量筛选。同时，化学发光成像技术易于学习和操作。

在实验过程中，我们发现使用18F-FDG对棕色脂肪组织（BAT）进行成像时，其对比度与注射方式密切相关。静脉注射18F-FDG可为肩胛间棕色脂肪组织提供优异的对比度，而相同剂量的18F-FDG经腹腔注射后，仅在棕色脂肪组织区域显示出较弱的对比度。

光谱解混是一种用于分离两组信号的非常实用的技术，已广泛应用于荧光成像中。众所周知，18F-FDG 的摄取并不具有高度靶向特异性，而不同的靶标/组织具有不同的光衰减特性。我们发现 BAT 的 CLI 光谱峰值位于约 640 nm 处，该数据反映了 BAT 的实际生物学背景。本方案的三维重建具有很强的可操作性，因为它可以基于不同波长的光扩散特性，利用 commercially available 的光学成像系统完成。采用该方法，我们可以避免使用需要多角度成像以实现三维重建的专用成像系统。

对于光谱解混和三维重建，BAT 中每幅图像至少需要获得 600 个光子计数。为此，每幅图像需要采用较大的 binning 值（bin = 16）、较小的光圈（f = 1）以及较长的采集时间（5 分钟）。

总之，利用棕色脂肪组织（BAT）独特的解剖位置和形态，以及其显著高的摄取能力 18F-FDG 在 BAT 中的成像，我们展示了如何通过光学成像技术对小型动物中的 BAT 进行成像 18采用CLI技术进行F-FDG成像。该方法可可靠地用于棕色脂肪组织（BAT）的成像及BAT激活的监测。此外，我们还证明光谱解混和三维重建具有可行性，且可实现三维体积定量，为未来研究提供了可能。

披露

本视频文章的出版由 Perkin Elmer 公司支持。

致谢

作者感谢Perkin Elmer公司对本出版物的支持。我们还感谢理学学士Alana Ross对手稿的校对。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
光学成像系统Perkin ElmerIVIS Spectrum 是一种光学成像系统，配备高灵敏度相机用于切伦科夫发光成像。部分仪器信息如下：CCD 传感器：背照式薄层、背照式
CCD 尺寸：2.7 cm x 2.7 cm
像素：2048 × 2048
量子效率：85%
最小可检测光子数：70 光子/秒/球面度/平方厘米 2
暗电流： &<100 电子/秒/平方厘米 2
镜头：f 0.95 50 mm
CCD 冷却：冷却至 90 度。 
1818F-FDGIBA Molecular
去甲肾上腺素SigmaN5785-250MG
氯胺酮/赛拉嗪西格玛K113-10ML

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