黑腹果蝇Drosophila melanogaster幼虫盘的解剖与免疫染色

摘要

成体结构 果蝇 来源于一种称为成虫盘的囊状结构。对这些成虫盘的分析有助于深入了解多种发育过程，包括组织决定、区室边界建立、细胞增殖、细胞命运特化以及平面细胞极性。本实验方案用于制备适用于光学/荧光显微镜观察的成虫盘。

摘要

在果蝇Drosophila melanogaster的胚后发育过程中，很大一部分发生在一组囊状结构——成虫盘（imaginal discs）中。这些成虫盘发育为成体果蝇体内绝大多数的成体结构。本文描述了一种经过优化的实验方案，用于回收这些成虫盘并使其适用于抗体、转录报告基因和蛋白质捕获标记的分析。该方案最适合用于成虫盘等较薄的组织，但也可稍作修改后用于较厚的组织，如幼虫大脑和成体卵巢。书面协议及配套视频将指导读者/观看者完成三龄幼虫的解剖、组织固定以及成虫盘的抗体处理。该方案也可用于解剖较年轻的的一龄和二龄幼虫的成虫盘。本方案的优点在于步骤相对简短，并且已针对解剖后组织的高质量保存进行了优化。另一个优点是所采用的固定程序与绝大多数识别Drosophila蛋白的抗体具有良好兼容性。根据我们的经验，仅有极少数敏感抗体不适用于此固定方法。在此类情况下，补救措施似乎是改用其他固定液配方，同时继续遵循我们在解剖步骤和抗体孵育方面所设定的操作规范。

引言

一个多世纪以来，果蝇（Drosophila melanogaster）一直是研究发育、行为和生理学的首选模式系统。果蝇的发育可分为两个主要阶段：胚胎期和胚后期，其中后一阶段的大部分过程发生在称为成虫盘的单层上皮组织中^1-3。 成虫盘的示意图最早由奥古斯特·魏斯曼（August Weismann）于1864年发表，作为其关于昆虫发育的综合性专著的一部分¹。这些成虫盘在胚胎发生期间开始发育，在幼虫阶段进行模式形成，在蛹早期经历大规模组织溶解后仍能存活，并最终形成成体果蝇中大部分的成体结构^1-14。在幼虫发育过程中，每个成虫盘需做出多个关键决定，包括细胞命运、形状和大小。在第一和第二龄幼虫阶段，成虫盘需确定基本命运、建立区室边界、获得正确的形态并产生所需数量的细胞^15-16。在第三龄幼虫及早期前蛹阶段，成虫盘继续进行细胞分裂，同时细胞逐步确定其终末命运，完成模式构建¹⁶。

在果蝇（Drosophila）发育生物学的早期研究中，成虫盘几乎仅在正常发育背景下进行研究，仅在少数功能缺失或功能获得性突变体能够存活的情况下才被分析。利用X射线诱导有丝分裂重组的方法，使得在幼虫和成体组织中的细胞克隆内分析致死性突变成为可能。随着转基因技术的引入，该方法得到改进，可用于在幼虫和成体组织中分析功能缺失和功能获得性突变。此外，用于描述野生型和突变型组织分子图谱的抗体、转录报告基因以及蛋白质捕获工具的数量也在持续增长。利用这些分子标记物来分析功能缺失和功能获得性突变的细胞克隆，使得实时理解突变细胞在发育过程中如何偏离其野生型同类变得日益可行。为了充分有效地利用这些工具和试剂，获得高质量的成虫盘样本以供观察、拍照和分析至关重要。本论文的目标是提供一种优化的方案，用于分离和制备眼-触角成虫盘复合体（图 1A）。该方法也可成功用于分离多种其他类型的成虫盘，包括发育为翅、平衡棒、T1-T3足以及生殖器的成虫盘（图 1B-E）。此操作流程经过少量修改后，已用于果蝇（Drosophila）成虫盘的分离近八十年之久。

如上所述，由于大多数基因在发育的多个阶段以及多种组织中均有表达，因此通常难以研究无效突变体对整个眼睛的影响，因为动物在到达三龄幼虫阶段之前便已死亡。目前已有四种方法使对视网膜等较成熟组织的研究变得更加可行。第一种是Flippase（FLP）/Flippase Recombination Target（FRT）方法，可在整体为野生型的组织中产生突变细胞克隆^17-19。在此方法中，突变组织通过缺乏绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）等可视标记物来识别，并可与周围表达GFP的野生型组织进行比较（图 2D）。第二种是“flp-out”方法，即在一群细胞中诱导转基因表达²⁰。在此情况下，细胞克隆通过GFP的存在来识别，并与周围缺乏GFP报告基因的野生型组织进行比较（图 2E）。第三种是可抑制性细胞标记嵌合体分析（Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker, MARCM）技术，该技术结合了FLP/FRT突变克隆与flp-out表达系统的要素²¹。通过该方法，可在一群同时对某一遗传位点呈突变状态的细胞中表达转基因。与flp-out克隆类似，MARCM克隆通过GFP的存在来识别，并与周围缺乏GFP标记的野生型组织进行比较（图 2F）。最后一种方法是利用特定的启动子-GAL4构建体，在成虫盘组织中表达基因或RNAi构建体。这四种方法提高了人们对成虫盘研究的兴趣，因为突变或过表达的克隆或表达模式可直接与邻近的野生型组织进行比较。本实验方案所描述的方法旨在帮助研究黑腹果蝇（Drosophila）成体组织胚后发育的研究人员，特别是研究眼-触角成虫盘来源组织的研究者，能够获得高质量的组织用于分析。尽管个别研究者对该方法进行了细微调整，但其核心步骤（本文所述内容）基本保持不变。由于获取高质量组织对于成虫盘研究至关重要，我们希望本书面实验方案及配套视频能成为有价值的教育资源。

方案

1. 幼虫的制备

1. 在35 mm培养皿中加入解剖缓冲液。
2. 将幼虫放入培养皿中，使其游动数分钟（自清洁步骤）。
3. 将幼虫转移至硅胶解剖板上的一团解剖缓冲液中。该液滴应位于解剖板的一侧边缘。解剖板由倒入玻璃培养皿中并固化的硅胶溶液构成。
4. 使用巴斯德吸管，在解剖板中央放置较大体积的解剖缓冲液。
5. 使用#5镊子，将一只已清洁的单个幼虫从小液滴转移至中央较大的解剖缓冲液中。

2. 幼虫的粗解剖

1. 当幼虫仍处于大量解剖缓冲液中时，用镊子夹住幼虫。用一对镊子夹住口钩，同时用另一对镊子固定幼虫身体（在体长约1/3处轻柔夹住），使其保持静止。
2. 稳稳握住夹住口钩附近表皮的那对镊子，同时用第二对镊子迅速将身体其余部分拉离。
3. 当幼虫开始撕裂时，会感到轻微的张力释放。此时松开镊子，使幼虫的“内脏”自然流出。这有助于保持成虫盘的正常形态，防止其发生变形。
4. 用一对镊子再次夹住口钩，以固定幼虫前端。使用另一对镊子移除包括内部脏器在内的幼虫下半部（约占整体的2/3）。注意：剩余结构应包含口钩、眼-触角成虫盘、脑半球、腹神经节、唾液腺、部分足成虫盘以及覆盖其上的表皮。
5. 用镊子小心去除覆盖的表皮、唾液腺、足成虫盘及其他组织。注意：最终仅应保留口钩、眼-触角成虫盘、脑半球和腹神经节（图 3）。
6. 重复步骤2.1–2.5，继续处理其他幼虫，持续15–20分钟。注意：在解剖缓冲液中存放时间过长的成虫盘容易降解，最终将难以获得理想的显微拍摄样本。因此，所有解剖得到的组织在最多20分钟后应立即转移至PLP固定液中（见下文）。

3. 使用抗体对组织进行固定和染色

1. 使用P-200移液器将解剖的组织转移至含有冷的多聚甲醛-赖氨酸-过碘酸盐（PLP）固定液的表面皿中。转移的解剖缓冲液体积应限制在50 µl以内，以尽量减少对PLP的稀释。务必用剃刀片切去吸头尖端，使开口足够大以容纳解剖组织。使用一对镊子或钨针确保解剖组织完全浸没在固定液中，以保证充分固定。将解剖组织在冷PLP固定液中孵育45分钟。此孵育可在室温下静置进行。
2. 使用P-200移液器和另一个切去尖端的黄色吸头，将解剖组织转移至洗涤缓冲液（室温）中，孵育45分钟。转移的PLP液体积应限制在50 µl以内，以尽量减少对洗涤缓冲液的稀释。注意：所有解剖组织必须完全浸没。
3. 将20–30组解剖组织转移至1.5 ml微量离心管中。注意：若管内合并过多眼-触角盘复合体，可能导致管底组织无法充分接触抗体。为获得最佳结果，单个离心管中不应超过20–30个眼-触角盘复合体。解剖组织将沉降至微量离心管底部。因此，在后续步骤中应使用移液器移除并更换洗涤缓冲液、封闭液和抗体溶液。
4. 移除洗涤缓冲液，加入100 µl封闭液：含10%正常山羊血清的洗涤缓冲液。在室温下置于旋转仪上轻柔旋转孵育10分钟。
5. 移除封闭液，加入100 µl已用10%正常山羊血清适当稀释的一抗溶液。在室温下轻柔旋转孵育16小时。
6. 移除一抗溶液，加入750 µl洗涤缓冲液。将离心管置于摇摆混合器（nutator）上，在室温下摇动10分钟。注意：一抗溶液可保存（4 °C储存）并后续重复使用。多次重复使用抗体有助于降低非特异性结合。
7. 让组织沉降至管底，然后移除洗涤缓冲液，加入100 µl已用10%正常血清适当稀释的二抗溶液。在室温下轻柔旋转孵育2–4小时。
8. 移除二抗溶液，加入500 µl洗涤缓冲液。让组织沉降至管底。
9. 使用P-200移液器和切去尖端的黄色吸头，将所有解剖组织转移至解剖皿中预先放置的洗涤缓冲液池中。在进行下一步精细解剖的同时，组织将在洗涤缓冲液中继续孵育，以帮助去除多余的二抗。

4. 复眼-触角盘复合体的精细解剖及载玻片封片

1. 用一对镊子夹住口钩处的角质层，使复合体的腹面朝下。用第二对镊子插入脑与眼盘之间的空隙（图 3，红色箭头），夹紧后迅速将脑从口钩处拉离，以去除两个脑叶。
2. 在持续夹住口钩的同时，尽可能靠近眼-触角盘触角部分与口钩的连接处将组织剪断（图 3，蓝色箭头）。注意：眼-触角盘复合体应完全去除所有附属组织（图 1A）。重复操作直至获取所有需要用于制片的组织。本方案也可用于分离翅、平衡棒、腿和生殖原基盘组织（图 1B-E）。
3. 在解剖皿中相距约3英寸处放置两小片大小与盖玻片相当的滤纸。将一张载玻片置于解剖皿上，使滤纸分别位于载玻片两端下方，以防止载玻片粘附在解剖皿的硅胶底面上。
4. 使用P-20移液器配合未剪切的枪头，向载玻片中央加入9 µl抗荧光淬灭剂，以防止组织在荧光显微镜观察过程中发生荧光淬灭。
5. 用同一支未剪切的枪头收集所有眼-触角盘，并将其加入抗淬灭剂液滴中。尽量减少携带的洗涤缓冲液体积，控制在10 µl或以下。
6. 用一对镊子在抗淬灭剂液滴内将眼-触角盘分开并铺展开。让组织在抗淬灭剂中孵育数分钟。注意：随着组织吸收抗淬灭剂，盘会逐渐变透明。
7. 用细毛刷轻轻将盖玻片覆盖在样本上，以避免产生气泡。
8. 将制好的载玻片存放在-20 °C环境中，待后续使用光学显微镜或荧光显微镜观察眼-触角盘或其他原基盘组织。

结果

上述方法可稳定地制备出高质量的分析用材料 原位 探针、转录报告基因、蛋白质捕获工具和抗体。在 图1 我们展示了通过该方法常规获得的眼-触角、生殖器、翅、平衡棒和腿成虫盘。这些成虫盘经鬼笔环肽偶联荧光染料处理，后者可结合F-肌动蛋白，从而标记每个细胞的轮廓。若组织固定得当，眼成虫盘中的形态发生沟、生殖器、触角和腿成虫盘中同心组织褶皱的边缘，以及翅和平衡棒成虫盘的背腹轴均会呈现清晰的边界。若组织固定良好，则抗体、荧光蛋白和 原位 探针也将显示出清晰的图案。以下是几个示例。 图2上方三个图显示了用不同抗体染色的组织切片，下方三个图显示了利用GFP标记细胞群体的组织切片。

眼-触角成虫盘最显著的特征之一是形态发生沟（图1A），其在组织中表现为沿背腹轴延伸的一道凹陷^{1, 22}。在三龄幼虫期之前，发育中的眼区所有细胞均未形成模式、未分化，且在形态上彼此无法区分。在三龄幼虫期开始时，形态发生沟从眼区的后缘启动，并向前推进至眼-触角边界

讨论

尽管本方案主要侧重于眼-触角盘的分离及后续处理，但也可用于分离和分析翅、平衡棒、足和生殖盘（图 4）。与其他盘（如眼-触角盘）相比，分离这些盘所需的唯一修改在于粗解剖方法（方案第2节）。第一胸节足（T1）成对位于幼虫前端，可按照眼-触角盘分离方案进行回收。然而，第二胸节足（T2）盘附着于体壁。为分离这些盘，应使用一对镊子夹住口钩（如上所述），同时用另一对镊子夹住动物腹侧体壁（确保夹取位置距口钩约1/3体长处），然后通过撕开腹侧体壁的方式将幼虫剖开，T2足将保留在体壁上。第三胸节（T3）足与翅和平衡棒盘共同组成一个复合体，该复合体也附着于体壁。此时可选择将盘复合体和T2足从体壁上分离，也可在后续固定/抗体孵育步骤中保持体壁-盘复合体完整，并在精细解剖阶段（方案第4节）再分离各盘。对于生殖盘的回收，建议用一对镊子夹住幼虫中段，再用另一对镊子从腹侧中段开始向后端剥离体壁。推荐使用镊子清除所有多余组织，然后用P-200移液器配合切去末端的黄色枪头，将生殖盘转移至固定液中。

该方法最适合厚度有限的组织，例如成虫盘，且当所用抗体具有高滴度和高特异性时...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5 KG	用于制作解剖板的基底
Pryex 玻璃培养皿 150 x 20 mm	Dow Corning	3160-152CO	用其盖子作为解剖板
#5 解剖镊	Ted Pella	525	镊子必须保持非常锋利
9 孔表面皿	Various Vendors		用于固定成虫盘复合体
50 ml 锥形烧瓶	Various Vendors
小型搅拌子	Various Vendors		尺寸需足够小以放入锥形烧瓶中
50 ml 离心管	Various Vendors
1.5 ml 微量离心管	Various Vendors		根据应用选择透明或避光管
微量离心管架	Various Vendors
台式旋转混合仪	Various Vendors		低速设置下 100 μl 体积不应产生飞溅
多聚甲醛	Macron Chemicals	2-26555-1	用作固定剂
磷酸二氢钠	Sigma Chemical Co	S-3139	用于配制解剖和洗涤缓冲液
磷酸氢二钠	Sigma Chemical Co	71636	用于配制解剖和洗涤缓冲液
赖氨酸	Acros Organics	125221000	用于固定液溶液中
高碘酸钠	Sigma Chemical Co	S-1878	用于固定液溶液中
吐温 X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	用于穿孔处理成虫盘
氢氧化钠	EM Science	SX0593-3	用于溶解多聚甲醛
100% 正常山羊血清	Jackson Laboratories	005-000-121	用作封闭溶液
一抗	Various Vendors		按生产商说明用 10% 山羊血清稀释
二抗	Various Vendors		按生产商说明用 10% 山羊血清稀释
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	防止样品荧光淬灭
显微镜载玻片	Fischer Scientific	48312-003
玻璃盖玻片 18 x 18 mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe 擦镜纸	Various Vendors		防止载玻片粘附于硅胶基底
Panit 000 号画笔	Various Vendors		用于轻柔地将盖玻片覆盖在样品上