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方法文章

培养 秀丽隐杆线虫 在无菌液体培养基中培养及通过微粒轰击法创建转基因蠕虫

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DOI：

10.3791/51796

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2014年8月2日

 ,  ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

通讯作者： Iqbal Hamza <hamza@umd.edu>

本文内容

摘要

C. elegans 通常在接种了 E. coli 的固体琼脂平板或液体培养基中培养。为了防止细菌代谢产物对毒理学和营养学研究造成干扰，我们采用了一种无菌液体培养基 CeHR，用于大量培养并同步化线虫，以满足多种下游应用的需求。

摘要

在本实验方案中，我们介绍了制备改良型 C. elegans 习服与繁殖培养基（mCeHR）所需的材料及操作步骤。此外，还描述了将生长在E. coli上的C. elegans暴露并适应无菌液体培养基的步骤。最后，通过利用无菌C. elegans开展的下游实验展示了该方法的优势。通过在含不同血红素浓度的无菌液体培养基中培养N2野生型线虫，展示了分析和确定C. elegans 营养需求的能力。该方法可推广应用于其他营养物质，以确定线虫生长和发育的最适浓度，或评估药物处理的毒理学效应。通过定性显微观察以及定量统计在不同血红素浓度下生长的线虫数量，确定了不同血红素浓度对野生型线虫生长的影响。此外，还可利用表达荧光传感器的线虫来检测特定营养物质浓度变化所引起的影响，该传感器可响应目标营养物质的变化。此外，通过该方法可轻松获得大量线虫，用于通过微粒轰击法创制转基因C. elegans。

引言

土壤线虫， 秀丽隐杆线虫，是一种在遗传学至毒理学等多个研究领域中广泛使用的强大模式生物。由于其体长约1毫米、繁殖周期仅需四天、易于培养且子代数量众多，这些线虫已被广泛应用于多种遗传学和药理学筛选研究中1,2研究人员利用这种蠕虫来鉴定在脊椎动物系统中保守的分子和信号通路，这些通路包括细胞死亡信号、衰老与代谢通路，以及神经系统。3-6。此外，透明度的 秀丽隐杆线虫 可利用荧光蛋白报告基因生成转基因品系，通过直接观察荧光信号来分析基因表达模式和蛋白质定位。

在许多研究中，这种线虫通常在固体琼脂培养基表面培养，使用线虫生长培养基（NGM）平板，或在液体培养基中接种大肠杆菌（Escherichia coli）作为食物来源7,8。这些细菌性食物来源可能因细菌副产物的干扰而影响生化和毒理学研究的结果解读。为避免这些混杂效应，可将秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养于无菌的液体培养基中，该培养基不含细菌作为食物来源。利用该培养基，我们成功培养了数百万条高度同步化的线虫，适用于多种标准的C. elegans实验方案，包括对暴露于不同血红素浓度下的C. elegans中差异表达基因进行微阵列分析，以及通过基因轰击法产生转基因线虫。该培养基为化学成分明确的培养基，是在Eric Clegg博士最初提出的配方基础上改良而来9。利用这种mCeHR培养基，我们已成功鉴定出参与血红素稳态调控的基因，即血红素响应基因（hrgs）10，而此类基因的发现若在常规使用接种大肠杆菌（E. coli）的NGM琼脂平板的培养条件下则无法实现。

在本方案中，我们描述了引入和维持的步骤 秀丽隐杆线虫 培养于 大肠杆菌 到无菌的 mCeHR 培养基中，并利用该方法获得大量线虫用于制备转基因个体 秀丽隐杆线虫 通过微粒轰击法转化细胞系。我们还展示了利用无菌培养基确定营养需求的研究。 秀丽隐杆线虫 以血红素为例。这些研究表明，使用 mCeHR 培养基可实现大量细胞的快速生长 秀丽隐杆线虫 适用于线虫研究人员使用的多种下游应用。

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方案

1. 线虫品系

  1. 获取 秀丽隐杆线虫 野生型 布里斯托尔 N2品系来自 秀丽隐杆线虫 遗传学中心（CGC）（http://www.cbs.umn.edu/cgc）并在接种有细菌的NGM平板上培养 E. coli 菌株 OP507注意：转基因线虫品系 IQ6011（Phrg-1::GFP) 的使用是按照先前所述方法构建的11. IQ6011 可向通讯作者索取。

2. 改良秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养与繁殖培养基（mCeHR）的制备

按照以下方法制备 mCeHR 液体培养基12。该无菌液体培养基可使线虫在无需额外食物来源的情况下生长。所有无菌液体培养基及无菌线虫的操作均须在严格无菌条件下进行，例如使用层流罩。

  1. 从杂货店获取超高温灭菌的脱脂牛奶。使用冷藏产品，而非室温保存的产品。在用于 mCeHR 培养基之前，将牛奶划线接种于脑心浸出液（BHI）琼脂平板上，在 30 °C 和 37 °C 下分别孵育 3 天，以检测无菌性。将牛奶转移至 50 ml 无菌离心管中，并在 -80 °C 下保存。
  2. 按以下顺序和用量分别配制各组分，以制备 1 L 的 mCeHR（表 1A）：10 ml 2 mM 柠檬酸胆碱二酸、10 ml 维生素与生长因子混合液（配方见 表 1B）、10 ml 2.4 mM myo-肌醇、10 ml 2 mM 氯化血红素、250 ml 去离子水。施加负压，通过 0.22 μm 滤器过滤。
  3. 加入 20 ml 核酸混合液（配方见 表 1C）、100 ml 矿物质混合液（配方见 表 1D）、20 ml 170 mg/ml 酪蛋白水解物、20 ml 必需氨基酸混合液、10 ml 非必需氨基酸混合液、20 ml 450 mM KH2PO4、50 ml 1.45 M D-葡萄糖、10 ml 1 M HEPES 钠 盐、250 ml 去离子水。
  4. 施加负压过滤灭菌各组分。取下滤器后，加入 1 ml 5 mg/ml 胆固醇溶液。确保培养基的 pH 值约为 6–6.5。注意：该溶液可在 -80 °C 下保存长达一年。
  5. 使用前，在 mCeHR 培养基中加入 20%（v/v）超高温灭菌的有机脱脂牛奶。开启和分装牛奶时，必须严格采用无菌操作技术（例如在超净工作台内进行）。将培养基储存于 4 °C。

3. 准备秀丽隐杆线虫（C. elegans）以用于无菌mCeHR液体培养基中的培养

  1. 在十个 60 mm NGM 平板上培养线虫，直至出现大量怀卵线虫且平板上 OP50 E. coli 细菌残留极少。
  2. 用 5 ml M9 缓冲液（配方见表 1F）冲洗每个平板上的线虫，并将冲洗液收集至一个 50 ml 的锥形管中。
  3. 将锥形管静置 5 到 10 分钟 ，使线虫沉降，然后小心移除含有 E. coli 的上清液。
  4. 重复步骤 3.2 和 3.3 两次，以尽可能去除残留细菌，然后再继续后续操作。
  5. 将线虫重悬于 0.1 N NaCl 溶液中，体积应为 3 的倍数，例如 1.5 ml、3 ml 或 6 ml，确保在管中可清晰观察到单个线虫。
  6. 按照 1:2:6 的比例向线虫悬液中加入 5 N NaOH 和 5% 次氯酸钠（漂白剂）溶液进行漂白处理。例如，1 ml 5 N NaOH : 2 ml 5% 次氯酸钠 : 6 ml 线虫悬液。在加入线虫悬液前，先将 NaOH 与漂白剂混合。
  7. 剧烈涡旋震荡溶液，直至怀卵线虫完全溶解，悬液中仅可见卵（约需 5 至 10 分钟）。使用 10X 物镜的相差显微镜监测该过程。
  8. 线虫完全溶解后，立即在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 45 秒，使卵沉淀。弃去上清液，并用 10 ml 无菌水将沉淀清洗两次，每次均在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 45 秒。
  9. 漂白处理后，将卵沉淀转移至含有 10 ml mCeHR 培养基的 25 cm2 组织培养瓶中，培养基中添加 100 μg/ml 四环素。操作过程中需采用无菌技术。如需要，可额外添加抗生素（如 250 μg/ml 萘啶酸），以防止无菌液体培养物中细菌生长。
  10. 将液体培养物置于摇床培养箱中，在 20 °C、约 70 rpm 条件下培养。
  11. 每日观察线虫，记录其发育阶段和生长速度。
    注意：线虫在初始阶段生长较慢，需 7 至 10 天才能达到怀卵阶段。然而，随着线虫逐渐适应液体培养环境，野生型（N2）线虫的世代时间将缩短至约 4 天。
  12. 当线虫在液体培养基中发育至怀卵阶段后，将线虫培养物转移至锥形管中，并在 4 °C 条件下使用水平转子以 800 × g 离心 5 分钟 ，使线虫沉淀。
  13. 弃去上清液，用等体积的 0.1 M NaCl 轻柔重悬线虫沉淀。例如，若线虫在 10 ml mCeHR 培养基中培养，则使用 10 ml 0.1 M NaCl。将重悬液置于冰上静置 5 分钟 ，使线虫沉降。
  14. 按照上述步骤 3.5–3.8 所述方法进行漂白处理，并将线虫在无菌液体培养基中继续培养至第二代。如有必要，可再次添加抗生素以抑制细菌生长。
  15. 再次让线虫发育至怀卵阶段，然后按照步骤 3.12 和 3.13 所述方法将线虫沉淀并重悬于 0.1 M NaCl 中，再按步骤 3.5–3.8 所述方法再次漂白，以获得同步化的群体。此后，在无抗生素的液体培养基中培养 L1 幼虫。

4. 从液体培养物中同步线虫

  1. 按照上述步骤 3.12 和 3.13 所述，将线虫离心成团并重悬于 0.1 M NaCl 溶液中。按照上述步骤 3.5–3.8 所述进行漂白处理。
  2. 将卵团重悬于 10 ml M9 缓冲液中，并在 20 °C 下于旋转摇床上过夜孵化幼虫。注意：卵将孵化为 L1 幼虫，但不会进一步发育，从而使线虫同步于 L1 阶段。
  3. 为维持和传代培养线虫，将 L1 幼虫在 800 × g 下离心 5 分钟，随后重悬于 10 ml mCeHR 培养基中，并转移至 25 cm2 的培养瓶。将培养瓶置于 20 °C 下在旋转摇床上培养。为确保线虫获得充足营养，维持密度不超过 3,000 条线虫/ml/cm2。
    注意：在此阶段，若在超净台中采用无菌操作技术进行操作，则无需添加抗生素即可维持无菌条件。应每天检查线虫以监测其生长情况。

5. 用于无菌培养基培养的线虫冻融方法

  1. 将无菌异步培养的线虫或同步化的L1幼虫在液氮中冷冻。以800 × g离心5分钟收集线虫，然后重悬于S缓冲液（6.45 mM KHPO₄）中4，43.55 mM KHPO4，146.25 mM NaCl），每管使用0.5 ml。向每管中加入等体积含30% v/v甘油的S缓冲液，将线虫转移至-80 °C保存，随后长期储存于液氮中2. 冻存约 1 x 106 每管每毫升虫数
  2. 将冻存管在37 °C孵育约2分钟，直至冰几乎完全融化，以解冻线虫。在超净工作台中，将线虫转移至含有mCeHR的无菌烧瓶中，并置于20 °C培养。

6. 确定血红素浓度对mCeHR生长和繁殖的影响

  1. 使用无菌 mCeHR 培养基检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）的营养依赖性生长。为确定血红素浓度对线虫生长和发育的影响，使用同步化的无菌 N2 线虫或其他目标品系。按照上述第 4 节所述方法同步化 L1 幼虫。
  2. 次日，离心收集并计数同步化的 L1 幼虫，用无菌培养基稀释至每 μl 含 1 条线虫。用 0.3 M NH4OH 配制 10 mM 氯化血红素，并用浓盐酸调节 pH 至 8。
  3. 向 24 孔板中每孔加入 800 μl mCeHR 培养基。每孔加入 100 μl 培养基，含 100 条线虫。在每孔中加入氯化血红素，终浓度分别为 0 μM、1.5 μM 至 1,000 μM，每组设三个重复。确保所有孔中 NH4OH 的终浓度均为 0.3 M。加样前轻轻重悬线虫，以保证每孔准确加入 100 条 L1 幼虫。
  4. 每天观察线虫生长情况，记录各孔中不同浓度下的生长表现。培养 9 天后计数每孔线虫数量，并绘制对应于各血红素浓度的线虫数/ml 曲线（图 1）。

7. 血红素浓度对血红素感应线虫的影响

  1. 孵育同步化的L1期血红素感应线虫（Phrg-1::gfp) 在含有 4 μM、8 μM、10 μM 和 20 μM 血红素的 mCeHR 中
  2. 使用荧光共聚焦显微镜对线虫进行成像，48 小时 孵育后（图2).

8. 利用mCeHR通过微粒轰击法产生转基因C. elegans 

注意：使用在mCeHR培养基中培养的unc-119(ed3)线虫进行微粒轰击的制备与操作步骤详见图313。

  1. 线虫准备
    1. 在轰击前一周，将约 1 × 106 条不同步的 unc-119(ed3) 线虫转移至含有 90 ml mCeHR 培养基的 175 cm2 培养瓶中。将培养瓶置于 20 °C、约 70 rpm 的摇床上培养（图 3-1）。
      注意：一周后，线虫密度应显著增加，出现大量成年 gravid 线虫。微粒轰击需要约 3 × 107 条线虫。
    2. 将接种了 JM109 E. coli 的 10 cm NGM 平板置于冰上预冷。
    3. 将无菌线虫转移至两个 50 ml 圆锥形离心管中，在 800 × g 条件下离心 2 分钟。吸除上清液，并在每管中加入 50 ml M9 缓冲液重悬线虫（图 3-2）。
    4. 将成年线虫在冰上静置 10 至 15 分钟 ，使其自然沉降。
      注意：此时应获得约 2 ml 的线虫沉淀，其中成年线虫比例应>90%。该 2 ml 沉淀约含 5 × 106 条线虫，足够进行一次微粒轰击。
    5. 用 2 ml 线虫沉淀均匀涂布于预冷的、接种 JM109 的 NGM 平板表面。待液体完全吸收后，将平板继续在冰上放置 30 分钟 ，再进行后续操作（图 3-3）。
  2. 金颗粒的制备
    1. 称取 30 mg 金颗粒加入硅化处理的微量离心管中，加入 1 ml 70% 乙醇，涡旋振荡 5 分钟。
    2. 静置 15 分钟后，在 6,000 × g 条件下离心 10 秒使金颗粒沉淀。用移液枪头小心接触管壁远离金颗粒的一侧，吸除上清液。
    3. 用 1 ml 无菌水洗涤金颗粒，涡旋 1 分钟 ，并在 6,000 × g 条件下短暂离心 10 秒。重复洗涤两次后，将金颗粒重悬于 0.5 ml 无菌的 50% 甘油溶液中。
      注意：金颗粒终浓度为 60 mg/ml，可在 4 °C 保存 1 至 2 个月。
  3. 制备 DNA-金颗粒混合物
    1. 在硅化处理的 1.5 ml 微量离心管中，加入 10 μg 目标质粒 DNA 和 10 μg unc-119 救援质粒 DNA。加入 50 μl 去离子水和 100 μl 充分重悬的金颗粒溶液，涡旋 1 分钟。
    2. 加入 150 μl 2.5 M CaCl2，再次涡旋 1 分钟。向该溶液中加入 60 μl 0.1 M 亚精胺，涡旋 3 至 5 分钟。
    3. 在 6,000 × g 条件下瞬时离心 10 秒，吸除上清液，加入 300 μl 70% 乙醇。充分涡旋 1 分钟，在 6,000 × g 条件下瞬时离心，吸除上清液，再用 170 μl 100% 乙醇重悬。剧烈涡旋 5 至 10 分钟 ，再次瞬时离心并吸除上清液。
  4. 轰击（图 3-3）
    注意：本方案使用材料/设备表中指定的粒子递送系统。请遵循所用粒子递送仪器的操作说明。
    1. 在 15 cm 培养皿中放入一张纸巾。用镊子将七个宏载体依次浸入 100% 乙醇中，取出后平放在纸巾上晾干。
    2. 用 70% 乙醇彻底清洁基因枪室、宏载体架和靶板。每次轰击前均需清洁并高压灭菌阻断筛。
    3. 用镊子将宏载体装入支架中，并使用 seating tool 将其压紧固定。
    4. 将 20 μl DNA 包被的金颗粒溶液均匀涂布于每个宏载体中心，待其完全干燥。
    5. 用乙醇清洁压力分配器的两个部件，并与经乙醇清洁的破裂盘组装。将组装好的压力分配器和破裂盘旋入轰击室中。
    6. 将高压灭菌后的阻断筛与宏载体架组装，并将装置放置于指定金属架上并锁紧。
    7. 将组装好的宏载体装置插入基因枪室中压力分配器下方的指定插槽，并与压力分配器对齐。
    8. 用胶带将含有线虫的敞口 NGM 平板固定在靶板架上，关闭轰击室门。
    9. 进行轰击时，调节压力至足以击破破裂盘的水平。开启真空至 28 英寸汞柱压力，然后按下发射按钮直至破裂盘破裂。
    10. 释放真空，取出 NGM 平板。将线虫从平板上洗下，并重新分配至二十个接种 JM109 E. coli 的 10 cm NGM 平板中（图 3-4）。
    11. 将线虫在 25 °C 培养 10 至 14 天，直至平板上食物耗尽。能够从 unc-119 缺陷中被拯救的线虫将表现出正常运动能力，此时可进行识别。从不同的平板中挑选至少 10 条“野生型”线虫进行进一步分析，这些代表独立的转基因品系（图 3-5）。

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结果

在无菌液体培养基中培养C. elegans有助于确定线虫所需的营养成分，同时避免了大肠杆菌（E. coli）产生的次级代谢产物的干扰。野生型N2线虫在mCeHR培养基中经过三代即可适应，其生长情况与在NGM细菌平板上培养的线虫相当。事实上，这些线虫在4天内即达到产卵期，而生长在OP50细菌上的线虫则需3.5天。

使用mCeHR的一个优势体现在对这些线虫精确营养需求的研究中14。在图1中，线虫在添加了递增浓度血红素（最高达1 mM）的mCeHR培养基中培养。观察发现，当血红素浓度低于4 μM时，线虫生长明显延迟，仅能发育至L4幼虫阶段，但在mCeHR中培养9天后无法进入产卵阶段。当血红素浓度为10 μM和20 μM时，线虫在4天内即可发育至产卵阶段，并产生大量后代。当线虫在含20 μM血红素的mCeHR中培养时，后代数量达到最大。在100 μM和500 μM血红素浓度下，线虫仍能继续发育并产生后代，但与在20 μM血红素（最佳浓度）下培养的线虫相比，其幼虫后代数量显著减少。当血红素浓度达到或超...

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讨论

在本方案中，我们介绍了一种改良的无菌液体培养基mCeHR，可实现快速生长 秀丽隐杆线虫 大量产虫，具有多种优势，例如在无污染条件下培养线虫 E. coli 或细菌代谢产物，并可在营养学和毒理学研究中加以利用。其在营养学和毒理学研究中的应用 E. coli 在这些研究中使用其他细菌存在若干缺点。例如，细菌的生长可能在不同条件下发生变化，且细菌可能代谢正在检测的分子，从而干扰结果的解读。因此，开发一种成分明确的培养基来开展这些研究具有显著优势。

尽管先前的研究已在液体培养基中培养 C. elegans15，但在秀丽隐杆线虫维持培养基（CeMM）中生长的线虫表现出明显的世代时间延迟16，这与我们在 mCeHR 培养基中观察到的情况不同。我们的主要目标是利用 C. elegans 研究营养稳态，特别关注血红素和金属代谢。基于这一目标，我们课题组开发的 mCeHR 及其改良版本成功实现了该目的，并直接促成了多个维持线虫血红素稳态所需基因的发现，这些发现最终也适...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益或利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院资助，资助编号为DK85035和DK074797（I.H）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MgCl2•6H2O西格玛M-2393
柠檬酸钠西格玛S-4641
一水柠檬酸钾西格玛P-1722
CuCl2•2H2O费舍尔C455-500
MnCl2•4H2O费舍尔M87-100
ZnCl2西格玛Z-0152
Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O西格玛F-1018
CaCl2•2H2O费舍尔C70-500
5'-单磷酸腺苷，钠盐西格玛A-1752
5'-胞苷酸西格玛C-1006
2'-和3'-单磷酸鸟苷西格玛G-8002
5'-尿苷酸，二钠盐西格玛U-6375
胸腺嘧啶西格玛T0376
N-乙酰葡萄糖胺西格玛A3286
DL-丙氨酸费舍尔S25648 
对氨基苯甲酸西格玛A-9878
生物素西格玛B-4639
氰钴胺（B-12）西格玛V-2876
亚叶酸钙西格玛F-7878
烟酸西格玛N-0761
烟酰胺西格玛N-3376
泛酸硫辛胺西格玛P-2125
泛酸钙西格玛P-6292
蝶酰谷氨酸（叶酸）ACRCS21663-0100
5'-磷酸吡哆醛西格玛P-3657
盐酸吡哆胺西格玛P-9158
盐酸吡哆醇西格玛P-6280
核黄素5-PO4(Na)西格玛R-7774
盐酸硫胺素西格玛T-1270
DL-6,8-硫辛酸西格玛T-1395
KH2PO4西格玛P-5379
二酸柠檬酸胆碱西格玛C-2004
myo-肌醇西格玛I-5125
D-葡萄糖西格玛G-7520
乳清蛋白酶水解物西格玛L-9010
脑心浸液BD211065
氯化血红素Frontier ScientificH651-9
HEPES，钠盐西格玛H-3784
胆固醇J.T. BakerF676-05
MEM非必需氨基酸英潍捷基11140-076
MEM氨基酸溶液英潍捷基11130-051
萘啶酸钠西格玛N4382
盐酸四环素MP Biomedicals2194542
基因枪递送系统伯乐165-2257
金颗粒（金粉）  Ferro Electronic Material Systems6420 2504, JZP01010KM
或
金颗粒 1.0 μm伯乐 165-2263

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