小鼠B淋巴细胞染色体畸变的PNA-FISH快速分析

摘要

DNA修复通路对于维持基因组完整性以及防止突变和癌症的发生至关重要。本实验方案的目标是通过直接观察小鼠B细胞有丝分裂中期 spreads 中的染色体畸变，利用荧光方法定量基因组不稳定性。 原位 端粒DNA重复序列的荧光原位杂交（FISH）

摘要

DNA修复缺陷会导致基因组不稳定性增加，这是引发肿瘤发生的突变的根本原因。通过分析不同类型细胞中染色体畸变的频率和类型，可揭示DNA修复通路中的缺陷。哺乳动物DNA修复生物学的研究在很大程度上得益于特定基因敲除小鼠模型的建立。本实验方案的目标是定量评估小鼠B淋巴细胞中的基因组不稳定性。利用PNA-FISH探针（肽核酸-荧光原位杂交）对端粒进行标记， 原位 杂交）有助于快速分析中期染色体铺展中的基因组不稳定性。相较于成纤维细胞，B细胞具有特定优势，因其具有正常的倍性且有较高的有丝分裂指数。因此，B细胞的短期培养能够对一种原代细胞群体中的基因组不稳定性进行精确测量，这类细胞群体所携带的继发性基因突变可能少于转化的成纤维细胞或患者细胞系中通常所见。

引言

癌症是由影响调控正常细胞生长基因的突变累积所导致的。突变是由于DNA损伤引起基因组结构和序列改变的结果。DNA损伤可通过多种过程发生，包括电离辐射等外源性因素，以及正常细胞代谢的副产物，例如核苷酸碱基的自发脱氨基作用，或与活性氧物质接触所造成的损伤¹。

尽管哺乳动物细胞具有一系列能够逆转DNA损伤或在断裂位点恢复序列的修复活性，突变仍会在细胞的整个生命周期中不断积累。此外，DNA损伤还可能导致细胞衰老以及干细胞潜能的丧失，这两个过程均与衰老相关疾病有关²。因此，理解DNA损伤的修复机制对于应对公共卫生领域的两个重大问题至关重要。越来越多的证据表明，哺乳动物的DNA修复通路可能促进癌细胞基因组的演化^3,4，这使得在分子水平上深入理解抑制突变的相关过程变得更加迫切。

直接观察染色体畸变是评估特定细胞类型基因组不稳定性程度的一种强大且定量的方法。可通过光镜或荧光显微镜检测处于中期的细胞所分离出的凝缩染色体。此类细胞遗传学方法已应用数十年，可用于揭示易位或与DNA修复功能丧失相关的特定类型染色体畸变。该实验方案具有多种潜在拓展性：染色体可用探针标记以进行光谱核型分析（SKY）或多色荧光原位杂交 原位 杂交（mFISH）以鉴定易位^5,6这些技术还可用于确定染色体易位的频率以及复杂染色体易位的结构，从而提供超出本实验方案所能获得的额外信息。此外，可设计并使用序列特异性探针，以检测特定基因组位点上DNA断裂的发生频率。⁷.

在本实验方案中，我们描述了如何从B淋巴细胞制备中期染色体铺片。使用一种荧光标记的肽核酸（PNA）探针识别端粒重复序列，该探针可高效地标记中期染色体铺片中的端粒。本方案具有多项优势：B细胞可被诱导以高有丝分裂指数增殖，从而能够稳定地制备高质量的染色体铺片；此外，来自基因修饰小鼠的B细胞更少携带可能干扰特定基因对基因组稳定性贡献分析的继发性遗传突变。PNA-FISH方法可在一天内完成，并能更准确地统计染色体断裂情况。通过采用该方法，特别是结合本方案中所述的特定设备，可制备出高度一致且高质量的染色体铺片，并快速分析基因组不稳定的频率和类型。

方案

该实验程序已获得新泽西州立罗格斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。小鼠的处理遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》。科研人员应咨询本国及本机构的动物管理组织，以获取已确立并获批准的指导原则。

开始之前，准备好表1中列出的溶液。

1. B细胞的分离与激活

使用 CO₂ 处死小鼠，随后进行颈椎脱位。将小鼠置于体侧向左的位置，用70%乙醇喷洒小鼠直至毛发湿润。解剖取出脾脏，并置于含2 ml洗涤缓冲液的35 mm组织培养皿中。在超净工作台内，用5 ml注射器的平头端轻轻研磨组织培养皿中的脾脏，使其分散。

1. 将70 μm尼龙滤网插入50 ml离心管中，并将2 ml洗涤缓冲液中的脾脏样本转移至尼龙滤网上。使用注射器的平头端轻轻研磨滤网中的脾脏组织以使其充分分散。
2. 用8 ml洗涤缓冲液冲洗注射器背面和35 mm培养皿，并将液体通过70 μm尼龙滤网过滤。在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。
3. 吸除并弃去上清液，将沉淀重悬于3 ml ACK裂解缓冲液中。轻轻吹打数次以分散细胞团块，室温孵育5分钟。加入10 ml洗涤缓冲液，再次在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。
4. 吸除并弃去上清液，通过轻弹管底使沉淀松散，随后加入1 ml洗涤缓冲液并用移液器吹打混匀。加入50 μl抗CD43 MACS磁珠，冰上孵育30分钟。加入10 ml洗涤缓冲液，轻轻混匀后在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。再次加入10 ml洗涤缓冲液，轻轻混匀，于4 °C条件下以300 × g离心10分钟。
5. 将Mini-MACS柱置于MACS磁铁上以组装分离装置，在柱下方放置一个标记好的15 ml尖底离心管。向柱中加入1 ml洗涤缓冲液，使其自然流过并收集至15 ml管中。
6. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml洗涤缓冲液中。待洗涤缓冲液完全流尽后，将细胞悬液加载至Mini-MACS柱中。
7. 待样品完全通过色谱柱后，加入1 ml洗涤缓冲液洗涤柱子。同时，向15 ml收集管中的流出液直接加入7 ml洗涤缓冲液。
8. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。根据需要取足够体积的细胞悬液，使每孔含有5,000,000个细胞，并转移至50 ml离心管中。在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。在B细胞培养基中添加LPS（1:500）和IL-4（1:1,000）。
9. 吸除上清液，加入适量已补充因子的B细胞培养基，调整细胞终浓度为1,000,000个细胞/ml。
10. 将细胞以每孔5 ml、浓度为1,000,000个细胞/ml接种于6孔板中，置于37 °C、5% CO₂的加湿细胞培养箱中培养。

2. B细胞固定

1. 向含有 5 ml B 细胞的培养孔中加入 50 μl 秋水仙胺（终浓度为 100 ng/ml），在 37 °C 下孵育 1 小时。将 75 mM KCl 溶液在 37 °C 水浴中预热。将 B 细胞转移至已标记的 15 ml 离心管中。用胶带覆盖标签，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
2. 吸除上清液，保留 1 ml 液体于管中，通过移液重悬沉淀。逐滴加入 5 ml 预热的 KCl 溶液，同时轻敲或脉冲式涡旋振荡。
3. 加入 10 ml KCl 溶液，通过倒置混匀。在 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。加入 5 滴新鲜固定液，通过倒置混匀。在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。吸除上清液，保留 1 ml 液体于管中，通过反复吹打重悬沉淀。
4. 逐滴加入 5 ml 新鲜固定液，同时轻敲或脉冲式涡旋振荡。再加入 10 ml 固定液，在室温下孵育 30 分钟。
5. 在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。吸除上清液，保留 1 ml 液体于管中，通过移液重悬沉淀。加入 14 ml 新鲜固定液，在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
6. 重复步骤 2.7 两次。
7. 加入 14 ml 新鲜固定液。用 Parafilm 封口膜密封管盖，并在 -20 °C 下过夜保存。

3. 中期染色体铺片的制备

1. 将可控环境室设置为22.9 °C和52%湿度。
2. 在4 °C下以300 × g离心固定后的B细胞10分钟。吸除固定液，保留70 μl于管中，通过移液重悬细胞。
3. 将标记好的载玻片以35°角放置于湿盒中。每张载玻片上滴加35 μl重悬的B细胞，每个样本滴加两张载玻片。在湿盒中静置干燥30分钟，然后将载玻片放入载玻片盒中，并在37 °C下保存。

4. 端粒PNA荧光原位杂交

1. 探针制备
   1. 将去离子甲酰胺预热至 37 °C。取 2 μl 端粒 PNA 探针与 7 μl 预热的去离子甲酰胺混合，于 37 °C 振荡孵育 1 小时。
   2. 将 FISH 主混合液预热至 37 °C。向步骤 4.1.1 的混合物中加入 7 μl 预热的 FISH 主混合液，于 37 °C 孵育 1–3 小时。
   3. 在 80 °C 下变性探针混合物 8 分钟。随后于 37 °C 预退火 1 小时。
2. 染色体玻片预处理
   1. 将含有 50 ml 0.01 M HCl 的玻璃玻片染色缸置于水浴中，预热至 37 °C。
   2. 将玻片放入另一含有 2x SSC 的玻璃玻片染色缸中，室温下处理 5 分钟。
   3. 向已预热的玻璃玻片染色缸中加入 2 μl 胃蛋白酶储备液，通过倒置混匀。将玻片转移至该染色缸中，于 37 °C 孵育 90 秒。
   4. 将玻片在另一含有 1x PBS 的玻璃玻片染色缸中洗涤 2 次，每次 5 分钟，室温振荡。随后在含有 1x PBS/MgCl₂ 的染色缸中室温振荡洗涤 5 分钟。
   5. 将玻片转移至含有新鲜配制的 1% 甲醛/1x PBS/MgCl₂ 的玻璃玻片染色缸中，室温处理 10 分钟。
   6. 将玻片在另一含有 1x PBS 的玻璃玻片染色缸中室温振荡洗涤 5 分钟。
   7. 准备乙醇脱水系列：分别准备含有 70%、90% 和 100% 乙醇的独立玻璃玻片染色缸。
   8. 将玻片依次转移至各染色缸中，每缸 3 分钟，顺序为 70% 乙醇、90% 乙醇，最后为 100% 乙醇。使用完毕后将乙醇染色缸置于 -20 °C 保存。
   9. 轻拍玻片以去除多余乙醇，并将玻片以 35° 角倾斜放置，使其自然晾干。干燥后，使用金刚石笔在玻片背面标记出 18 × 18 mm 的杂交区域。
3. FISH 实验中的玻片变性
   1. 在 24 × 60 mm 盖玻片上加入 120 μl 70% 去离子甲酰胺/2X SSC。将玻片与盖玻片接触，于 80 °C 热板上变性 90 秒。
   2. 迅速而小心地滑落盖玻片，将玻片依次浸入冰浴的 70% 乙醇、90% 乙醇和 100% 乙醇中，每种乙醇中各 3 分钟。随后让玻片自然晾干。
   3. 准备一个湿盒：使用带紧密盖子的塑料盒，并在内部铺上湿润的纸巾。纸巾应保持潮湿，但不得过量浸水。
   4. 在湿盒中，将步骤 4.1.3 中预退火的探针混合物加至玻片的标记区域，覆盖 18 × 18 mm 盖玻片，于 37 °C 孵育 1 小时。
4. 孵育后洗涤
   1. 将 50% 甲酰胺/2x SSC、1x SSC 和 4x SSC/0.1% Tween-20 置于 45 °C 水浴中预热。
   2. 小心移除盖玻片，将玻片在预热的 50% 甲酰胺/2x SSC 中避光振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟。随后在预热的 1x SSC 中振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟。最后在预热的 4x SSC/0.1% Tween-20 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
   3. 在避光的玻璃玻片染色缸中用 DAPI 染色 3 分钟。
   4. 将玻片在 2x SSC 中振荡洗涤 5 分钟。加入 35 μl Mowiol 封片介质，覆盖 24 × 60 mm 盖玻片，于 4 °C 保存玻片。

5. 染色体的显微镜分析

1. 使用标准的落射荧光显微镜分析中期染色体玻片。为获得最佳结果，建议采用配备自动载物台的成像平台，例如 MetaSystems Metafer 平台。针对每个中期分裂相，分别采集一幅 DAPI 荧光图像以显示染色体，以及一幅来自端粒探针的荧光信号图像。例如，Cy3- 其他荧光染料也可用且效果同样好。
2. 使用图像分析程序对图像进行叠加并分析。

结果

来自一个细胞的中期染色体应形成一个包含40条染色体的独立簇（若使用小鼠细胞）（图1A）。每条染色体的一端都有一个着丝粒，在图像中显示为浅蓝色球体。在正常染色体中，每条染色单体末端可见两个端粒信号，每个着丝粒旁也有两个信号。载玻片上也会存在间期细胞核，表现为蓝色球体，带有红色端粒信号，但无凝缩的染色体（例如见图1B）。在量化基因组不稳定性时，可忽略间期细胞核。

可以观察到多种不同类型的染色体畸变。染色单体断裂是指构成每条中期染色体的两条姐妹染色单体中的一条发生断裂。当观察者发现某条染色单体出现不连续，或染色体一端缺失单个端粒信号时，即可记为染色单体断裂（见图1B中的示例）。染色体断裂通过观察染色体一端是否缺失端粒信号来识别（见图1C中的示例）。在某些情况下，可在同一中期分裂相中观察到染色体断裂端形成的带有端粒信号的片段（如图1C所示）；而在其他情况下，断裂的染色体末端可能不可见。

讨论

虽然活化的B淋巴细胞特别适合制备有丝分裂染色体铺片，但其他类型的细胞也可使用。T淋巴细胞具有与B细胞相似的许多优点，因为它们可从脾脏或淋巴结中纯化，并且在含有适当有丝分裂原的培养基中受到刺激后具有较高的有丝分裂指数⁸。胚胎干细胞（ES细胞）也适用于中期染色体分析⁹。如果这些细胞不可获得，可使用成纤维细胞，但建议在固定前用秋水仙胺进行较长时间的处理（例如，以10 ng/ml的终浓度秋水仙胺处理16小时），以捕获更多的细胞于中期阶段。

我们发现，在受控湿度环境中滴加固定染色体，例如使用Thermotron CDS-5细胞遗传学干燥舱，可显著提高中期染色体展片制备的一致性；但根据实验室环境的湿度和温度条件，在实验台操作也可获得良好结果。为获得可靠的数据，建议每份样本至少分析100个中期分裂相的染色体畸变。由于在各通道中手动逐个成像每个中期分裂相的过程较为繁琐，我们采用Metasystems Metafer4全自动显微镜系统采集中期分裂相，该系统能够快速定位并准确扫描大量中期染色体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50% 硫酸葡聚糖	Intergen	S4030
去离子甲酰胺	Ambion	9342
胃蛋白酶 (5 g)	Sigma	P 6887
FCS	Gemini	100-106
LPS (100 mg)	Sigma	L2630
IL-4 (5 μg)	Sigma	I1020
PNA 端粒探针	PNA Bio Inc	F1002	(CCCTAACCCTAACCCTAA)
秋水仙胺	Roche	295892
Mowiol 4-88	Sigma	81381-50g
CD43 (ly-48_) 微珠	Miltenyl Biotec.	130-049-801
DAPI	Sigma	32670-5MG
Eclipse E800	Nikon
AxioImager.Z2	Zeiss
CDS-5 细胞遗传学干燥室	Thermotron