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方法文章

一种用于研究肌肉骨骼疾病中骨丢失的新型 in vivo 基因转导技术及基于细胞的 in vitro 检测方法

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DOI：

10.3791/51810

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2014年6月8日

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1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

本文内容

摘要

前体细胞向破骨细胞的分化受到细胞因子和生长因子的调控。本文介绍一种用于破骨细胞分化的新型基因转导技术 体内 以及将前体细胞分化为破骨细胞的细胞培养方案 体外 描述了研究细胞因子对破骨细胞生成影响的方法。

摘要

破骨细胞的分化与活化在肌肉骨骼系统疾病的发生发展中起着关键作用，因为这些细胞主要负责骨吸收。破骨细胞可通过诱导生成 体外 在特定细胞因子存在下，由单核细胞/巨噬细胞前体细胞分化而来，这些细胞因子可促进其存活与分化。此处，两者均 体内 和 体外 展示了可用于研究不同细胞因子在破骨细胞分化、信号传导及活化过程中作用的技术。微型环状DNA递送基因转移系统为建立骨质疏松相关模型提供了一种替代方法，特别适用于研究多种药理学抑制剂的效力。 体内同样地， 体外 在特定细胞因子存在下，从人类前体细胞培养破骨细胞的培养方案，使科学家能够研究人类细胞中的破骨细胞生成过程，以推动转化医学应用。这些技术相结合，有望加速针对破骨细胞的特异性治疗药物的发现进程，从而惠及全球数以百万计的骨质疏松症和关节炎患者。

引言

肌肉骨骼疾病影响着美国数百万人，对国家和地方卫生系统造成严重后果1。这些疾病的特点是骨和关节功能丧失，需要进行广泛治疗并经历漫长的恢复期。通常在骨质疏松症和关节炎中可观察到破骨细胞数量和/或活性的相对增加，破骨细胞是专门负责骨吸收的细胞2。在生理条件下，成骨细胞产生的核因子κ-B配体受体激活剂（RANKL）可调控破骨细胞的数量和活性。成骨细胞同时也产生RANKL的诱饵受体——骨保护素（OPG）3。体内动物模型中，通过系统性过表达sRANKL或敲除OPG的方法在骨质疏松研究中具有重要价值；然而，这些方法需要构建转基因小鼠4,5。本文介绍一种用于研究肌肉骨骼相关疾病的新颖替代方法，即过表达sRANKL。具体而言，采用微环（MC）DNA技术和水动力递送方法，在体内实现sRANKL基因转移，并系统性过表达小鼠sRANKL6。

该方法还可与其他骨质疏松症的体内模型相互补充，例如卵巢切除术后通过激素调节破骨细胞7，以及通过低钙饮食进行饮食干预8。这些模型对于研究肌肉骨骼相关疾病的不同方面非常有用，但需要手术操作，且可能耗时长达数月，并伴随显著的成本9。卵巢切除（OVX）啮齿类动物模型是一种实验性动物模型，通过切除卵巢导致雌激素缺乏，从而模拟人类绝经后骨质疏松症10。人类绝经后骨质疏松症是一种因雌激素缺乏而导致骨折风险增加的疾病，仅在美国就影响约八百万女性。尽管OVX模型适用于研究绝经后骨质疏松症，但在广泛研究骨质疏松症方面其优势有限。雌激素通过诱导破骨细胞凋亡并抑制成骨细胞凋亡来抑制骨丢失，因此在雌激素缺乏时，可观察到破骨细胞活性增强10-12。同时可观察到有利于骨吸收的RANKL-OPG比例失衡13。然而，体内雌激素缺乏还伴随转化生长因子β（TGF β）水平降低，以及白细胞介素-7（IL-7）、TNF、IL-1和IL-6水平升高14,15。由于这些细胞因子已知具有独立于RANKL通路的骨重塑调节功能，因此无法将任何破骨细胞活化单纯归因于RANKL-RANK轴。本文所述模型使研究人员能够在不伴随促炎性细胞因子的情况下，研究体内RANKL-RANK轴在破骨细胞生成和骨丢失中的作用，相较于OVX啮齿类动物模型具有优势。

此外， 体外 破骨细胞生成技术是研究破骨细胞活化以开发肌肉骨骼疾病潜在治疗方法的重要工具。先前的研究还表明，将小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs）与小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和小鼠可溶性RANKL（sRANKL）共同培养，可诱导破骨细胞分化。3,16,17从小鼠骨髓及人外周血单个核细胞（PBMCs）生成多核破骨样细胞的实验方案 体外18 成熟终末分化且功能完全的破骨细胞的鉴定所需依赖的细胞实验方法也简要进行了描述。这些 体外 技术补充了该新方法 体内 方法共同构成了研究破骨细胞分化与活化的强大工具。利用这些系统，科研人员能够生成破骨细胞 体内 和 体外 并定义其增殖和活化所需的刺激因素与信号通路，同时评估药理学和生物学抑制剂的效果。

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方案

1. sRANKL 质粒 DNA 的水动力递送

  1. 通过小鼠尾静脉进行水动力递送
    1. 在尾静脉注射前称量小鼠体重。将sRANKL或绿色荧光蛋白（GFP）MC溶于林格氏液中（预热至37 °C），总体积约为小鼠体重的10%。
    2. 注射前将小鼠置于笼中加热约10分钟，以扩张血管并使侧静脉（LVs）可见。密切监测小鼠，避免脱水和过热。
    3. 一旦侧静脉扩张且清晰可见，立即将小鼠转移至固定器中，并将塞子推入足够深度以限制其活动。监测小鼠呼吸等正常活动，必要时调整固定器塞子位置。
    4. 用酒精棉片对尾尖3/4处的注射区域进行消毒。使用27–30 G针头进行尾静脉注射。一手牢固握住尾巴，将针头插入尾静脉，推动注射器并在5–7秒内完成注射。
    5. 从尾静脉拔出针头，并用棉球按压注射部位以止血。监测小鼠15–30分钟，待呼吸频率恢复至正常水平后，将其送回动物房。
  2. 基因转移后系统性小鼠sRANKL表达的确认及血清TRACP5b定量检测
    1. 将小鼠置于笼中加热5–10分钟，以扩张血管并使侧静脉（LVs）可见。密切监测小鼠，避免脱水和过热。
    2. 用刀片在距尾尖约1/4处的尾部做一小切口。
    3. 在血清分离管中收集约100 μl血液。
    4. 将血清分离管在室温下孵育30分钟。
    5. 以10,000 × g离心5分钟，收集血清。将血清储存于-80 °C以备后续分析。
    6. 使用 commercially available试剂盒对血清样本进行sRANKL ELISA和小鼠血清TRACP5b检测。

2. 体外 从小鼠BMMs生成破骨细胞

  1. 骨髓来源巨噬细胞的分离与培养
    1. 胫骨和股骨的分离：使用CO₂处死供体小鼠2，用70%乙醇消毒腿部。从耻骨向跟骨解剖，完整取出股骨和胫骨。
    2. 小心去除皮肤和肌肉，避免损伤骨骼。将处理后的股骨和胫骨放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
    3. 去除骨髓：剪除股骨和胫骨一端的骨尖，使用装有25 G针头的1 ml注射器（内含含1%青霉素/链霉素的α-MEM，即破骨细胞培养基/OCM），将骨髓冲洗至50 ml离心管中。
    4. 处理骨髓：将骨髓悬液通过70 μm尼龙细胞滤器混合并转移至新的50 ml离心管中。以300 x g离心细胞，随后重悬于含1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清的α-MEM培养基中（破骨细胞培养基/OCM (+)）。
  2. 巨噬细胞培养
    1. 使用血细胞计数板或自动细胞计数器进行细胞计数。
    2. 接种 1 × 106 每孔细胞数为 6 孔板或 3 x 105 将细胞接种于放置在96孔板中的玻璃盖玻片（5 mm）或牙本质片上，于37 °C孵育。
    3. 吸除含有非贴壁细胞的全部培养基，加入新鲜的含25 ng/ml小鼠M-CSF的OCM (+) 培养基，于37 °C培养48小时。
    4. 吸除所有培养基，加入含有25 ng/ml小鼠M-CSF和30 ng/ml小鼠sRANKL的新鲜OCM (+) 培养基，在37 °C培养以启动破骨细胞生成。根据需要每3天更换一次培养基。
    5. 培养细胞约6-8天，以形成具有骨吸收能力的大型多核细胞。一旦出现多核细胞，即使用 commercially available kit 进行TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色；待细胞完全成熟后，进行功能检测。使用鬼笔环肽染色在盖玻片上观察F-actin环结构，并通过扫描电子显微镜（SEM）观察附着于牙本质切片上的细胞，方法如前所述。19.

3. 体外 从人外周血单个核细胞（PBMCs）生成破骨细胞

  1. 人外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
    1. 将10 ml预热的Histopaque-1077加入50 ml离心管中。
    2. 将从血库获得的白细胞滤器用无菌PBS冲洗，收集液体至50 ml离心管中（血液与PBS按1:1比例混合）。缓慢地将稀释后的血液叠加于Histopaque溶液上层，确保血液与Histopaque溶液不发生混合。
    3. 在18 °C条件下，以1000 × g离心20分钟。离心后，小心分离含有白细胞的白色絮状层（buffy coat），并转移至新的50 ml离心管中。
    4. 用PBS稀释细胞，再以650 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。
    5. 弃去上清液，将细胞重悬于OCM (-)培养基中，并使用细胞计数仪进行细胞计数。
  2. PBMCs的接种与培养
    1. 将细胞重悬于OCM (+)培养基中，按8 × 106 个细胞/ml每孔接种于6孔板，或按1 × 106 个细胞/ml每孔接种于96孔板。根据需要，将细胞接种于用于免疫荧光成像的玻璃盖玻片（5 mm）上，以及适用于骨吸收实验的骨片上，具体方法如前所述20。
    2. 每2–3天更换一次培养基，并根据需要补充人源M-CSF。在第5天进入分化阶段时，在OCM (+)培养基中加入30 ng/ml人源sRANKL和25 ng/ml人源M-CSF，以启动破骨细胞生成。
    3. 继续培养细胞约14至21天，以形成大型多核细胞。一旦出现多核细胞，即可对其进行TRAP染色标记；当细胞完全成熟后，可进行功能学检测。使用鬼笔环肽（phalloidin）染色可在盖玻片上观察F-actin环结构。通过扫描电镜（SEM）可观察贴附于牙本质切片上的细胞形态。

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结果

此处介绍一种用于破骨细胞分化的新型基因转导技术 体内 以及将前体细胞诱导分化为破骨细胞的细胞培养方案 体外 描述了一种用于研究细胞因子对破骨细胞生成影响的方法。在 图1，展示了将GFP和小鼠sRANKL MC成功转染至小鼠体内的代表性结果。在 图2，通过明场显微镜观察小鼠骨髓或人外周血单个核细胞前体细胞向破骨细胞分化的代表性图像如图所示。 图3，展示了通过三种独立方法表征小鼠骨髓来源破骨细胞的代表性图像。小鼠sRANKL的存在激活了TRAP的表达（图3A 和 B）以及F-actin环的形成（图3C 和 D）。扫描电子显微镜（SEM）显示，小鼠sRANKL可诱导形成具有骨吸收能力的多核巨细胞（图3E 和 F). 图4，对人外周血单个核细胞（PBMC）来源的破骨细胞采用相...

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讨论

肌肉骨骼疾病是导致发病率和残疾的主要原因，包含150多种疾病和综合征，目前影响约9000万美国人。关节炎症和骨破坏是肌肉骨骼疾病的主要特征，包括关节炎和骨质疏松症。骨质疏松症是一种削弱骨完整性的疾病，常导致骨折。关节炎是一种慢性、致残性疾病，其特征是关节发炎，导致关节肿胀、压痛和僵硬，限制正常活动，甚至导致残疾。尽管各种肌肉骨骼疾病的发病机制差异显著，但骨破坏是其共同的核心特征。肌肉骨骼疾病中的骨破坏主要由骨吸收与骨形成之间的失衡引起。 关键词：肌肉骨骼疾病，关节炎，骨质疏松症，骨破坏，骨吸收，骨形成，炎症，关节，骨折，骨完整性21,22一种治疗策略是尝试阻断这些细胞破坏骨组织的能力23此处概述的技术和步骤可用于研究破骨细胞 体内 和 体外

本文所述的体内模型采用微环（minicircles），即一种去除细菌骨架的小型附加体DNA载体（约4 kb），也可作为转基因载体24。与常规细菌质粒相比，微环表达转基因的水平高出10至1,000倍，且表达可持续数月之久。微环...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）研究基金 R01 AR062173 和 SHC 250862（资助对象：IEA）的支持。ES 获得了 NIH T32 CTSC 博士前 fellowship 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
α-MEMLife Technologies 12561-056
人M-CSFMiltenyi Biotec130-096-492
小鼠M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
人RANK配体 - 可溶性Miltenyi Biotec130-094-631
小鼠RANK配体 - 可溶性Miltenyi Biotec130-094-076
小鼠尾静脉固定器BraintreeTV-150 STD
小鼠TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA试剂盒 R&D systemsMTR00
酸性磷酸酶（白细胞）（TRAP）试剂盒Sigma387A
小鼠TRAP检测 immunodiagnostic systemsSB-TR103

参考文献

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