一种用于研究肌肉骨骼疾病中骨丢失的新型 in vivo 基因转导技术及基于细胞的 in vitro 检测方法

摘要

前体细胞向破骨细胞的分化受到细胞因子和生长因子的调控。本文介绍一种用于破骨细胞分化的新型基因转导技术 体内 以及将前体细胞分化为破骨细胞的细胞培养方案 体外 描述了研究细胞因子对破骨细胞生成影响的方法。

摘要

破骨细胞的分化与活化在肌肉骨骼系统疾病的发生发展中起着关键作用，因为这些细胞主要负责骨吸收。破骨细胞可通过诱导生成 体外 在特定细胞因子存在下，由单核细胞/巨噬细胞前体细胞分化而来，这些细胞因子可促进其存活与分化。此处，两者均 体内 和 体外 展示了可用于研究不同细胞因子在破骨细胞分化、信号传导及活化过程中作用的技术。微型环状DNA递送基因转移系统为建立骨质疏松相关模型提供了一种替代方法，特别适用于研究多种药理学抑制剂的效力。 体内同样地， 体外 在特定细胞因子存在下，从人类前体细胞培养破骨细胞的培养方案，使科学家能够研究人类细胞中的破骨细胞生成过程，以推动转化医学应用。这些技术相结合，有望加速针对破骨细胞的特异性治疗药物的发现进程，从而惠及全球数以百万计的骨质疏松症和关节炎患者。

引言

肌肉骨骼疾病影响着美国数百万人，对国家和地方卫生系统造成严重后果¹。这些疾病的特点是骨和关节功能丧失，需要进行广泛治疗并经历漫长的恢复期。通常在骨质疏松症和关节炎中可观察到破骨细胞数量和/或活性的相对增加，破骨细胞是专门负责骨吸收的细胞²。在生理条件下，成骨细胞产生的核因子κ-B配体受体激活剂（RANKL）可调控破骨细胞的数量和活性。成骨细胞同时也产生RANKL的诱饵受体——骨保护素（OPG）³。体内动物模型中，通过系统性过表达sRANKL或敲除OPG的方法在骨质疏松研究中具有重要价值；然而，这些方法需要构建转基因小鼠^4,5。本文介绍一种用于研究肌肉骨骼相关疾病的新颖替代方法，即过表达sRANKL。具体而言，采用微环（MC）DNA技术和水动力递送方法，在体内实现sRANKL基因转移，并系统性过表达小鼠sRANKL⁶。

该方法还可与其他骨质疏松症的体内模型相互补充，例如卵巢切除术后通过激素调节破骨细胞⁷，以及通过低钙饮食进行饮食干预⁸。这些模型对于研究肌肉骨骼相关疾病的不同方面非常有用，但需要手术操作，且可能耗时长达数月，并伴随显著的成本⁹。卵巢切除（OVX）啮齿类动物模型是一种实验性动物模型，通过切除卵巢导致雌激素缺乏，从而模拟人类绝经后骨质疏松症<....

方案

1. sRANKL 质粒 DNA 的水动力递送

1. 通过小鼠尾静脉进行水动力递送
   1. 在尾静脉注射前称量小鼠体重。将sRANKL或绿色荧光蛋白（GFP）MC溶于林格氏液中（预热至37 °C），总体积约为小鼠体重的10%。
   2. 注射前将小鼠置于笼中加热约10分钟，以扩张血管并使侧静脉（LVs）可见。密切监测小鼠，避免脱水和过热。
   3. 一旦侧静脉扩张且清晰可见，立即将小鼠转移至固定器中，并将塞子推入足够深度以限制其活动。监测小鼠呼吸等正常活动，必要时调整固定器塞子位置。
   4. 用酒精棉片对尾尖3/4处的注射区域进行消毒。使用27–30 G针头进行尾静脉注射。一手牢固握住尾巴，将针头插入尾静脉，推动注射器并在5–7秒内完成注射。
   5. 从尾静脉拔出针头，并用棉球按压注射部位以止血。监测小鼠15–30分钟，待呼吸频率恢复至正常水平后，将其送回动物房。
2. 基因转移后系统性小鼠sRANKL表达的确认及血清TRACP5b定量检测
   1. 将小鼠置于笼中加热5–10分钟，以扩张血管并使侧静脉（LVs）可见。密切监测小鼠，避免脱水和过热。
   2. 用刀片在距尾尖约1/4处的尾部做一小切口。
   3. 在血清分离管中收集约100 μl血液。
   4. 将血清分离管在室温下孵育30分钟。
   5. 以10,000 × g离心5分钟，收集....

结果

此处介绍一种用于破骨细胞分化的新型基因转导技术 体内 以及将前体细胞诱导分化为破骨细胞的细胞培养方案 体外 描述了一种用于研究细胞因子对破骨细胞生成影响的方法。在 图1，展示了将GFP和小鼠sRANKL MC成功转染至小鼠体内的代表性结果。在 图2，通过明场显微镜观察小鼠骨髓或人外周血单个核细胞前体细胞向破骨细胞分化的代表性图像如图所示。 图3，展示了通过三种独立方法表征小鼠骨髓来源破骨细胞的代表性图像。小鼠sRANKL的存在激活了TRAP的表达（图3A 和 B）以及F-actin环的形成（图3C 和 D）。扫描电子显微镜（SEM）显示，小鼠sRANKL可诱导形成具有骨吸收能力的多核巨细胞（图3E 和 F). 图4，对人外周血单个核细胞（PBMC）来源的破骨细胞采用相.......

讨论

肌肉骨骼疾病是导致发病率和残疾的主要原因，包含150多种疾病和综合征，目前影响约9000万美国人。关节炎症和骨破坏是肌肉骨骼疾病的主要特征，包括关节炎和骨质疏松症。骨质疏松症是一种削弱骨完整性的疾病，常导致骨折。关节炎是一种慢性、致残性疾病，其特征是关节发炎，导致关节肿胀、压痛和僵硬，限制正常活动，甚至导致残疾。尽管各种肌肉骨骼疾病的发病机制差异显著，但骨破坏是其共同的核心特征。肌肉骨骼疾病中的骨破坏主要由骨吸收与骨形成之间的失衡引起。 关键词：肌肉骨骼疾病，关节炎，骨质疏松症，骨破坏，骨吸收，骨形成，炎症，关节，骨折，骨完整性^21,22一种治疗策略是尝试阻断这些细胞破坏骨组织的能力²³此处概述的技术和步骤可用于研究破骨细胞 体内 和 体外

本文所述的体内模型采用微环（minicircles），即一种去除细菌骨架的小型附加体DNA载体（约4 kb），也可作为转基因载体²⁴。与常规细菌质粒相比，微环表达转基因的水平高出10至1,000倍，且表达可持续数月之久。微环.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-MEM	Life Technologies	12561-056
人M-CSF	Miltenyi Biotec	130-096-492
小鼠M-CSF	Miltenyi Biotec	130-094-643
人RANK配体 - 可溶性	Miltenyi Biotec	130-094-631
小鼠RANK配体 - 可溶性	Miltenyi Biotec	130-094-076
小鼠尾静脉固定器	Braintree	TV-150 STD
小鼠TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA试剂盒	R&D systems	MTR00
酸性磷酸酶（白细胞）（TRAP）试剂盒	Sigma	387A
小鼠TRAP检测	immunodiagnostic systems	SB-TR103