采用改良式 Bergström 技术的人类骨骼肌活检操作规程

摘要

本视频旨在介绍在人体受试者上应用的改良式 Bergström 骨骼肌活检技术。

摘要

经皮活检技术使研究人员和临床医生能够采集骨骼肌组织样本。该技术安全且高效。本视频介绍了使用改良的 Bergström 针从受试者股外侧肌获取骨骼肌组织样本的经皮活检技术。Bergström 针由一个外 cannula 构成，其针尖侧面有一个小开口（“窗口”），以及一个带有远端切割刃的内芯针（内 trocar）。在局部麻醉和无菌条件下，将针头通过皮肤、皮下组织和筋膜的切口插入骨骼肌内。随后，对内芯针施加负压，回撤外 cannula，骨骼肌组织在负压作用下被吸入外 cannula 的窗口内，然后迅速闭合内芯针，从而切断或钳取骨骼肌组织样本。将针头旋转 90° 后进行第二次切割。此过程可再重复三次。这种多次切割技术通常可在健康受试者中获得 100–200 mg 甚至更多的组织样本，并可在运动或其他干预措施之前、期间或之后立即进行。活检切口部位处理包扎后，受试者通常可立即恢复日常活动，并可在 48–72 小时内完全参与剧烈体力活动。为降低肌肉通过筋膜切口发生疝出的风险，受试者应在 48 小时内避免进行大负荷抗阻训练。

引言

经皮或“半开放”活检技术用于从人类患者和研究对象中获取骨骼肌组织样本。杜兴（Duchenne, 1806–1875）被认为是首位设计带套管针以通过经皮活检从活体受试者获取骨骼肌组织的学者¹。20世纪60年代，Bergström 引入了一种类似于杜兴所描述的经皮活检针^2–4。二十年后，Evans 等⁵通过在 Bergström 活检针的切割套管针中施加负压对这一技术进行了改进。该改进可使组织获取量提高3至5倍^6,7，并已广泛应用于临床及生物医学研究领域。该技术过去推动、未来也将继续推动对肌病的诊断以及对骨骼肌结构与功能的理解。

经皮肌肉活检技术操作简便。若严格遵循无菌技术规范进行操作，其相关风险极低。肌肉活检 procedure 被视为科研项目中的一种研究工具。部分学术机构允许具有博士学位并经过培训的教职研究人员在医师直接监督下开展肌肉活检，而其他机构则要求由经认证的执业医师执行该技术。亚利桑那州立大学（ASU）活检团队在过去13年中已成功完成了超过1,600例肌肉活检^8-15。本视频的目的是介绍改良的 Bergström 针经皮肌肉活检技术⁵，以从受试者股外侧肌中获取骨骼肌组织样本。

方案

所述骨骼肌操作程序遵循阿巴拉契亚州立大学机构审查委员会的指南。

注意：团队由一名操作员（接受过活检技术培训的博士或医学博士）和至少一名、理想情况下三名或更多技术人员组成。操作员负责实施并监督骨骼肌活检过程的所有环节。其中一名技术人员（技术员 #1）直接协助操作员完成肌肉提取的所有步骤，包括作为“非无菌操作手”并使用无菌注射器进行抽吸。第二名技术人员（技术员 #2）在操作过程中与受试者交谈，并按摩其对侧腿部，以尽量减轻受试者的焦虑情绪。第三名技术人员（技术员 #3）负责处理和加工骨骼肌样本。后续分析的具体要求将决定处理和准备骨骼肌样本所需的额外技术人员数量。

1. 受试者准备

1. 收集、准备并整理肌肉活检手术所需的材料（表1）。按照标准操作规程对 Bergström 针（外 cannula 和内 trocar）以及推杆进行去污和灭菌¹⁶。
2. 与受试者共同审阅知情同意书。阿巴拉契亚州立大学所使用的《参与研究知情同意书》中关于骨骼肌活检部分的内容见在线补充材料1。
   1. 与受试者讨论肌肉活检手术的一般情况，重点说明可能存在的风险、皮肤准备、麻醉剂使用以及可能出现的典型感觉。指导受试者仔细阅读《参与研究知情同意书》，并在理解研究设计和操作流程后签署确认。
3. 确认受试者对“___caine”类药物（例如，利多卡因）无过敏反应。
4. 指导受试者仰卧于带有软垫的检查台上，暴露大腿部位。在受试者腿部下方放置两张带塑料背衬的一次性吸水垫。将腿部置于放松状态，在足跟下方垫一小卷毛巾，使膝关节完全伸展（抬高约1 cm），从而使股外侧肌处于缩短位置。
5. 由操作者指导受试者短暂收缩暴露的大腿肌肉，以便确定活检部位。注：股外侧肌活检部位位于阔筋膜（髂胫束）前方稍偏处，大约在髌骨上缘与大转子之间距离的三分之一处⁷。
6. 由操作者使用细头永久性记号笔在切口位置稍下方（约0.5 cm）做标记。
7. 由操作者通过捏起皮肤皱褶来估测大致的皮褶厚度。
8. 操作者及技术人员应使用肥皂和温水洗手，并佩戴一次性手套。
9. 操作者应使用剪刀清除活检部位周围约15 cm × 15 cm区域的毛发。注：清除活检部位毛发可防止手术过程中及缝合时毛发进入切口，同时有助于胶带闭合材料与皮肤之间实现更好的贴合（见步骤3.4）。
10. 操作者应使用预先浸有局部消毒剂的棉片（如聚维酮碘或对碘/贝类过敏者适用的葡萄糖酸氯己定）对区域进行消毒。从中心开始，以同心圆方式向外扩展至剪毛区域的边缘。至少重复两次，每次均使用新的预浸棉片。

2. 活检操作步骤

1. 操作人员应脱去一次性手套，用肥皂和温水洗手，然后采用无菌技术佩戴无菌外科手套。
2. 让技术人员1将无菌带孔洞巾递给操作者。操作者应使用无菌技术，将洞巾覆盖于活检部位，以维持无菌区域。
3. 由技术人员1在保持无菌操作技术的前提下，向操作者提供一支配有21 G针头的5 ml注射器。使用酒精棉片清洁利多卡因药瓶的瓶塞顶部。
   1. 让操作者立即抽取5 ml利多卡因。从注射器上取下21 G针头，并将针头丢弃至锐器容器中。
   2. 让技术人员1号向操作员提供一个1-½ 英寸25 G针头，同时保持无菌操作技术。操作者应将1-½ 将英寸针头安装到注射器上，并排出注射器中的气泡。
4. 让技术人员1号将氯乙烷喷洒于切口部位（皮肤上永久记号墨水标记上方约0.5 cm处），直至皮肤出现“发白”现象。
   1. 操作者应将针头以接近水平于皮肤的角度插入真皮层，回抽针管确认无回血后，注入约100 µ注射利多卡因以形成直径为2-4 mm的“水疱”。
      1. 操作者应回抽针筒（轻微向后拉动针筒活塞），以确认针头未进入血管。若针筒内出现血液，则应拔出针头，将其丢弃于锐器容器中，并从步骤 2.3 重新开始。
      2. 操作者将针头推进皮下组织，回抽针管，然后注入约1 ml利多卡因，形成皮丘。待皮丘消退后，插入1-½ 将装有利多卡因的注射器上的1英寸针头垂直刺入切口部位，至筋膜浅层停止。注意：受试者在初次注射利多卡因时可能会感到轻微的一过性刺痛感（类似于蜜蜂蜇伤）。
   2. 确保操作者不要将利多卡因注入肌肉，因其具有肌毒性^17-19.
   3. 操作者应先回抽针管，然后在将针头从大腿拔出的同时缓慢注射剩余的4 ml利多卡因。注射完成后，在注射部位覆盖无菌纱布，并让受试者放松，等待局部麻醉起效。
5. 2～3 分钟后，技术人员 1 在保持无菌技术的情况下，将手术刀递给操作者。
   1. 让操作者用手术刀尖轻轻探查活检部位，以确认该区域已麻醉。如有必要，向切口部位再注射3-4 ml利多卡因，参见2.4.1.2。
6. 操作者应平行于股骨，在墨水标记上方约2-3 mm处，穿过皮肤和皮下组织做一个1 cm长的直切口。
   1. 操作者应将手术刀插入更深，切开筋膜进入肌肉层，每个方向各进行一次。注意：若手术刀片切入肌肉，受试者可能会感到短暂的刺痛或压力感。
   2. 让技术人员2与受试者交谈并按摩对侧腿部。
7. 让操作者在切口和活检部位覆盖足量的无菌纱布，并对切口施加直接压力，以减少出血。
   1. 让技术人员1将三通金属活塞接头连接至一次性60 ml注射器和30 cm延长管图1).
   2. 让技术人员1将锥形塑料管连接器的一端插入延长管的自由端，并将连接器的另一端牢固插入200的粗端 µl 移液器吸头，剪去尖端约 15-18 mm。

图1. Bergström 活检针。（A） Bergström 活检针（5 mm）由（a）外 cannula 和（b）内 trocar 组成，相关组件包括（c）推杆、（d）剪去约15–18 mm的200 µl移液器吸头、（e）锥形塑料连接器、（f）三通金属旋塞阀、（g）30 cm延长管以及（h）一次性60 ml注射器。（B） 组装完成的Bergström活检针（5 mm）及其相关组件。（C） 将Bergström活检针（5 mm）的内trocar向外抽出约1 cm，可打开外cannula的取样窗口。

9. 出血停止后，让技术人员 #1 打开已灭菌的高压灭菌袋，并在保持无菌操作技术的前提下，将 5 mm 活检针及其内芯穿刺针交给操作者（图 1）。
   1. 让操作者组装活检针（外鞘管和内芯穿刺针），检查其对齐情况及滑动功能。
10. 让操作者用双手牢固握住活检针组件（外鞘管和内芯穿刺针），防止内芯穿刺针旋转。让技术人员 #1 以轻微向下的扭转动作，将切割过的移液器吸头牢固插入活检针内芯穿刺针的顶部。确保技术人员 #1 仅接触移液器吸头，不得触碰操作者或活检针。
11. 让操作者通过切口将活检针插入组织。使用活检针尖端定位筋膜上的切口（通过经验获得的“手感”）。将针头略穿过筋膜后，在继续推进针头进入肌肉时，将针头方向向下倾斜朝向地面。注意：当使用活检针尖端定位筋膜切口并推进针头进入肌肉时，受试者可能会感到一些轻度不适（例如，“深层压迫感”或轻度抽筋感）。
    1. 让技术人员 #2 指示受试者保持“放松”状态，在操作者将针头推进肌肉时不要收缩大腿肌肉。
12. 当活检针就位后，让操作者示意技术人员 #1 打开一次性 60 ml 注射器。
    1. 让技术人员 #1 迅速将一次性 60 ml 注射器拉至 40–50 ml 刻度处，以在活检针内产生负压吸力。
    2. 让操作者将内芯穿刺针向后拉出约 1 cm，以打开外鞘管的取样窗，同时保持外鞘管在肌肉内的位置不变。随后让操作者迅速闭合内芯穿刺针，以切割（夹取）并收集肌肉样本。然后让操作者示意技术人员 #1 释放负压。
    3. 让技术人员 #1 打开通气阀与外界相通，以释放负压。
    4. 让操作者将活检针旋转 90° 并重复上述过程。如有需要，可让操作者最多重复此旋转操作 3 次（共获取 4 份样本）。
13. 让操作者在从大腿拔出活检针的同时，用无菌纱布对切口部位施加直接的反向压力，注意避免钩住筋膜或皮肤。若感到明显阻力，可在对内芯穿刺针施加扭转动作的同时重新切割。
14. 从大腿取出活检针后，让操作者将内芯穿刺针向后拉回 1 cm，目视检查外鞘管腔内情况，以评估是否采集到足够量的组织。
    1. 让操作者将活检针交给技术人员 #1。为保持无菌操作，确保技术人员 #1 仅接触针具，不接触操作者。再由技术人员 #1 将活检针转交给技术人员 #3。
15. 让技术人员 #3 从活检针中取出组织。
    1. 让技术人员 #3 使用推杆（图 1）和一对精细尖头镊子，确保将所有肌肉组织从内芯穿刺针和外鞘管中完全取出。
    2. 让技术人员 #3 快速称量样本，确认采集的肌肉组织量是否充足，并将样本置于冰冻解剖台上。
16. 让技术人员 #3 小心地从肌肉样本中分离出可见的结缔组织和脂肪。让技术人员 #3 根据后续分析要求准备肌肉样本的储存。例如，立即将样本放入冻存管并在液氮中速冻，或用于组织学制片的包埋与冷冻，或将样本放入含有 RNase 抑制剂的冻存管中等。
17. 如有必要，在保持无菌操作技术的前提下，使用第二支已灭菌的活检针重复该操作。

3. 封闭

1. 让操作者使用无菌纱布和冰袋对活检部位施加直接压力，持续 10-15 分钟。
2. 止血完成后，让操作者使用酒精消毒片清除切口周围区域的干涸血液。
3. 让技术人员1将一瓶医用皮肤粘合剂及其涂抹工具递给操作者。操作者在不触碰涂抹头或管口顶部的前提下，组装好粘合剂管和涂抹工具。
4. 让操作者用一只手将切口边缘拉拢闭合，同时用另一只手在干燥的切口表面均匀涂抹一层医用粘合剂。待粘合剂固化（约 90 秒）后，在切口上垂直贴上胶带闭合条。或者，也可使用两根无菌 4-0 缝线缝合切口。
5. 让操作者在切口处放置 3-4 块 2” x 2” 的非无菌纱布垫，施加直接压力，并用自粘性绷带固定。
6. 让操作者向受试者提供口头和书面指导，内容包括正确的伤口护理方法、正常与异常反应的识别，以及术后 1 至 4 天内的活动注意事项（详见在线补充材料2）。

结果

如上所述的肌肉活检操作可使研究人员快速且一致地采集骨骼肌组织样本。在健康、 athletic 的受试者中，通常一次操作（使用3-4个活检钳）可获得200 mg或更多的组织。整个过程耗时15-20分钟，其中大部分时间用于切口前的准备工作。在基于运动的研究中，通常在运动前和运动后采集肌肉样本，并在恢复期间再采集一至两个样本。采用这种设计时，可在准备运动前大腿部位的同时，对运动后（对侧）大腿的毛发进行剃除，并用细头永久性记号笔预先标记切口位置。这样可在长时间运动过程中²⁰或运动结束后8-10分钟内完成肌肉活检。 alternatively，在研究较短时间运动（例如，30分钟 或更短）时，可于运动前预先做好切口，覆盖无菌敷料并用外科胶带固定，从而在运动结束后迅速采集活检样本（10秒²¹至4 分钟²²内完成）。由于该操作相对迅速，研究人员得以在一次运动前后及过程中捕捉细胞和分子水平的变化，并检验营养干预的交互效应。

亚利桑那州立大学人类表现实验室已发表多篇基于肌肉组织活检样本数据的运动营养...

讨论

本视频逐步概述了亚利桑那州立大学人类表现实验室所采用的骨骼肌活检操作流程。过去13年中，该方法经少量修改后已用于采集约1,600例肌肉活检样本。这些肌肉活检样本为运动营养学相关研究提供了重要数据，推动了多项重要科研发现。

在进行改良的 Bergström 骨骼肌活检技术时，有许多关键的技术要点需要特别注意。首先，活检团队在整个操作过程中必须严格遵守无菌技术。在确定切口位置 [1.4] 时，需要注意股外侧肌在收缩状态下比放松状态时更靠前且更靠近近端，因此活检时应据此调整定位。如果研究方案要求从同一大腿进行多次活检，初次切口位置应略低于大腿长度的三分之一处 [1.4]；后续每次活检切口应位于前一次切口近端 2–3 cm 处。评估大致的皮褶厚度 [1.6] 有助于操作者估算筋膜表层组织的厚度，这对于步骤 2.3.2、2.4.1、2.6、2.6.1 和 2.11 的准确执行至关重要。操作者必须学会感知 皮下组织与 筋膜之间阻力的变化 [2.4.1]。在注射局部麻醉剂时，这种触感有助于确保活检质量，使操作者能够充分浸润皮下组织，同时尽量减少骨骼肌组织直接暴露于具有肌毒性<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bergström 活检针，5 x 100 mm	Stille Surgical Inc.	119-29187-50	1 个
Durasorb 蓝色敷垫	Fisher	22-031-340	每箱 300 个
一次性备皮剃刀	Moore Medical	89760	1 个
剃须膏	Moore Medical	92869	1 罐
酒精棉片	Moore Medical	98721	每盒 200 片
聚维酮碘棉签（3 包装）	Moore Medical	90691	每包 50 个
口罩	Fisher	19-039-690	每箱 50 个
无菌手套；6.5 号	Moore Medical	68128	每盒 50 双
无菌手套；7.0 号	Moore Medical	68129	每盒 50 双
无菌手套；8.5 号	Moore Medical	68132	每盒 50 双
带孔洞巾	Moore Medical	92712	每箱 50 个
利多卡因（1% 盐酸盐，不含肾上腺素）	Dealmed	427902	30 ml 瓶装
氯乙烷喷雾	Dealmed	386020	3.5 液盎司瓶装
5 ml 注射器配 21 G 针头	Fisher	14-827-48	每箱 100 个
25 G 5/8" 针头	Fisher	14-826AA	每箱 100 个
25 G 1 1/2" 针头	Fisher	14-826-49	每箱 100 个
一次性手术刀配 #11 刀片	Fisher	0-8927-5B	每盒 20 个
60 ml 注射器	Fisher	13-689-8	每箱 40 个
约 30 英寸延长管	Fisher	14-169-7A	每卷 50 英尺
金属三通阀	Fisher	01-290-38	每个
聚丙烯管接头（锥形端，3.2 至 5.5 mm）	Fisher	15-315-28A	每箱 100 个
黄色移液器吸头（1–200 µl）	Fisher	02-681-2	剪去吸头末端约 15–18 mm
外用手术粘合剂	Medline	MSC091076	每箱 36 支
外用手术粘合剂	Medline	MSC091076Z	每盒 6 支
蝶形缝合胶带（粘性条带）1/2" x 4"（每包 6 条）	Moore Medical	93050	每盒 300 条
绷带条，3/4 x 3 英寸	Fisher	19-027-202	每包 100 条
粘性绷带（5 米卷装）	Fisher	19-027-768	每箱 36 卷
1" 纸质手术胶带	Fisher	19-027-761	每箱 12 卷
缝合线（4-0 反向切割，FS2）	Moore Medical	82926	每盒 36 根
4 x 4 无菌纱布垫	Moore Medical	66949	每包 50 片
2 x 2 非无菌纱布垫	Moore Medical	37336	每包 200 片
3 x 4 非粘连敷料垫	Moore Medical	74389	每箱 100 片
高压灭菌袋 3.5 x 9	Moore Medical	40390	每箱 200 个
高压灭菌袋 5.25 x 10	Moore Medical	40391	每箱 200 个
高压灭菌指示胶带	Moore Medical	31608	每盒 250 卷
实验服—小号	Fisher	23-900-520A	每包 10 件
实验服—中号	Fisher	23-900-520B	每包 10 件
实验服—大号	Fisher	23-900-520C	每包 10 件
杀菌性一次性擦拭布	Moore Medical	62879	每罐 160 片