果蝇（Drosophila Melanogaster）中微小RNA种类的增强型Northern印迹检测

摘要

本出版物旨在对从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎、细胞和组织中提取的RNA进行增强型Northern印迹实验的操作步骤进行可视化展示与讨论。该实验方案特别适用于高效检测小RNA分子。

摘要

近几十年来，人们对 RNA 水平基因表达调控机制的科学兴趣迅速增长。分子生物学这一分支的发展在很大程度上得益于非编码 RNA 被发现为转录后调控中的关键参与者。这一革命性观点的形成和推动，伴随着用于分析短链 RNA 表达的强有力技术的发展，这些技术既可用于高通量层面（全基因组范围鉴定），也可用于单个候选分子的分析（特定物种的稳态积累）。尽管目前已有多种前沿策略可用于定量或可视化这些不稳定的 RNA 分子，Northern Blot 检测仍是分子生物学中快速且准确评估 RNA 表达的合适方法。它是在应用更复杂、更昂贵技术之前的第一步，在许多情况下，仍是一种优先选择的方法，可简便地深入了解 RNA 生物学特性。本文概述了一种高效的检测低丰度表达 microRNA（或其他小型调控性 RNA 物种）的实验方案（增强型 Northern Blot） 黑腹果蝇 完整胚胎、人工解剖的幼虫/成体组织或 体外 培养的细胞。所需RNA量极少，也可考虑使用流式细胞术分选的细胞材料。

引言

近年来，RNA 生物化学领域取得了显著进展¹。随着强效非编码核糖调控因子的发现²、新型RNA介导调控机制的揭示^3,4以及对已知转录后事件更深入的表征⁵，我们对RNA在基因表达调控中潜力的认识得到了极大拓展。这些研究共同推动了RNA生物学的迅速崛起，使其成为当前科学领域中的重要研究主题。特别是近年来，我们逐渐认识到“RNA世界”对分子神经生物学⁶这一现代生命科学中最活跃的研究领域之一所产生的广泛影响。在上个世纪的最后十年，RNA干扰现象^7,8以及小调控RNA^9,10的发现彻底改变了整个科学格局，尤其是微小RNA（microRNA）¹¹——这类内源性表达的小分子非编码RNA，作为基因表达的多效性与组合性调控因子，几乎参与调控所有细胞功能。

在 Ambros 和 Ruvkun 实验室首次于Caenorhabditis elegans中发现 miRNA 近十年后，随着在Drosophila和人类细胞中鉴定出大量 miRNA，该领域重新受到广泛关注^12-15。自那时起，得益于多种转基因技术的应用，Drosophila melanogaster已成为深入研究 miRNA 生物合成及其功能的重要生物学体系。Drosophila

方案

1. 样品采集

1. 脱离半贴壁的Schneider’s 2细胞（1-5 × 10⁶ 细胞（平均），用移液管吹打混匀后，通过离心（100 × g）收集 1分钟）。如果出现 体外 培养的贴壁细胞，在标准条件下用胰蛋白酶消化，或使用细胞刮刀将细胞直接从培养板上收集至适量的RNA提取试剂中。
2. 用于胚胎收集，培养 果蝇 在果蝇培养笼中培养品系，并让胚胎在产卵板上聚集。用毛笔在蒸馏水（dH₂O）中将胚胎刷下。₂O），通过筛网过滤去除碎片，冲洗后将胚胎收集至小瓶中⁴⁸.
3. 作为替代技术，可手动解剖组织或器官。从样本中分离睾丸（piRNA分析的优选系统） 果蝇 在立体显微镜（20倍放大）下，使用解剖针或镊子，在磷酸盐缓冲液（PBS）中解剖腹部，如Sullivan所示 等⁴⁹.
4. 研钵杵 加入0.5体积的RNA提取试剂后立即均质化样品。

2. RNA 提取/分析

1. 根据制造商说明，使用商业试剂进行RNA提取。注意！ RNA提取试剂通常具有毒性和腐蚀性。或者，可采用基于蛋白酶K的RNA提取方案⁵⁰，步骤如下：
   1. 将样品稀释至400 ....

结果

按照文中所述并以图1示意图表示的整体实验流程，我们评估了不同来源的复杂RNA样品中的小RNA表达。在图1所示实验中，通过蛋白酶K提取法从黑腹果蝇（Drosophila）Schneider 2细胞中分离RNA，通过变性琼脂糖凝胶电泳（可选步骤）检测其完整性，随后进行双份上样。其中一半凝胶样品转移至中性膜并使用EDC进行化学交联；另一半则转移至带正电荷的尼龙膜，随后进行紫外线交联（1.2 × 10⁵ μJ/cm²）。在两种条件下均验证了属于Dmel-miR279家族的两个内源性miRNA（Dmel-miR279本身及Dmel-miR286¹⁵）的表达。改进后的方法（ENB）相较于标准方法（SNB）具有更高的检测灵敏度。

两种方法之间的效率差异在图2和图3中表现得更为明显。实验设计原理同上：此处展示了对从成年果蝇睾丸中.......

讨论

尽管我们对RNA调控神经发生过程中复杂交织机制的理解在不断深入，但基于RNA的调控网络在影响神经干细胞生物学、神经元分化/功能整合、神经系统病理及肿瘤发展中的作用机制仍待探索。这些网络在不同生物界中的保守性凸显了遗传系统在该领域的潜在重要性 黑腹果蝇 对于揭示尚未探索的细胞通路具有重要作用，其中短链非编码RNA和转录因子被视为关键的分子参与者。在此背景下，候选小RNA表达水平的分析是开展精确功能研究的前提：我们近期的研究结果即为一例，表明 Dmel-miR279 调节 gcm/glide 命运决定因子 体内，通过改进的Northern印迹分析法作为表达分析工具来实现。

自1977年首次开发以来⁵¹，Northern印迹（NB）一直被视为RNA分析的参考方法。尽管该检测方法存在一些固有的局限性，例如难以转换为多重检测格式或信号定量时可能出现误差，但RNA分子生物学领域的最新突破重新确立了这一传统技术作为“快速且简洁”系统的价值，可用于检测小核糖核酸的内源性表达，或验证功能获得或功能缺失实验策.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
最终组成/名称	公司	目录号（库存）	备注
通用要求
离心机，5418	Eppendorf	5418 000.017
去污剂，RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	适用于玻璃器皿/塑料器皿，擦拭后冲洗
RNase抑制剂，DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	危险物质 //// 1609-47-8
样品制备
体视显微镜，M60	Leica
1× PBS缓冲液
137 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
2.7 mM KCl	Sigma-Aldrich	P9541	7447-40-7
10 mM Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	7558-79-4
1.8 mM KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	7778-77-0
RNA提取/分析
紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
凝胶成像系统，ChemiDoc XRS+	Biorad	170-8265
水平电泳仪，Mini-Sub Cell GT	BioRad	170-4487EDU
RNA提取试剂，TRIzol试剂	Life Technologies	15596026	危险物质
PCA（25:24:1），提取时1:1使用	Sigma-Aldrich	77617	136112-00-0
氯仿，提取时1:1使用	Sigma-Aldrich	C2432	67-66-3
乙醇，沉淀用2.5体积，洗涤用70%	Sigma-Aldrich	59844	64-17-5
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0311
终止混合液
300 mM NaOAc，pH 5.5	Sigma-Aldrich	S2889	127-09-3
1× RSB溶液
2% 十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	71736	切勿冷却SDS，以防 沉淀 //// 151-21-3
2 mg/ml 蛋白酶K	Roche Applied Science	0-3115828001	EC 3.4.21.64 9
10× 网织红细胞标准缓冲液（RSB）
100 mM Tris-Cl，pH 7.4	Sigma-Aldrich	T5941	1185-53-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
30 mM MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	7786-30-3
变性琼脂糖凝胶
1.2% 琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539	让凝胶凝固至少1小时 //// 9012-36-2
10× MOPS缓冲液
0.2 M MOPS钠盐，pH 7	Sigma-Aldrich	M9381	切勿将MOPS钠盐与MOPS混淆 //// 71119-22-7
琼脂糖上样染料
1× MOPS缓冲液
3% 甲醛	Sigma-Aldrich	F8775	危险物质 //// 50-00-0
50% 甲酰胺	Sigma-Aldrich	47670	危险物质 //// 75-12-7
溴化乙锭（EtBr）30 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	危险物质 //// 1239-45-8
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
小RNA分级分离
平头凝胶上样吸头	Life Technologies	LC1002
Savant SpeedVac浓缩仪	Thermo Scientific	DNA120
垂直电泳仪，Mini-PROTEAN Tetra Cell	Biorad	165-8000
变性丙烯酰胺凝胶
10% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）	Sigma-Aldrich	A3449	危险物质。使用前让凝胶聚合45分钟
1× TBE缓冲液（或1× MOPS缓冲液）
7 M 尿素	Sigma-Aldrich	U6504	57-13-6
0.1% 过硫酸铵	Sigma-Aldrich	215589	7727-54-0
0.1% TEMED	Sigma-Aldrich	T9281	110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder（10 bp步长）	Thermo Scientific	SM1211	标记0.1 μg，如"探针标记"反应中所述
丙烯酰胺蓝色染料
50% 甲酰胺	Sigma-Aldrich	47670	危险物质 //// 75-12-7
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
电泳缓冲液（RB）
1× MOPS缓冲液
替代RB：1× TBE缓冲液
1× TBE缓冲液
5× TBE
445 mM Tris碱	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
445 mM 硼酸	Sigma-Aldrich	B7901	10043-35-3
20 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
凝胶染色液
溴化乙锭 0.5 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	危险物质 //// 1239-45-8
1× RB			用EtBr染色15分钟，无EtBr去染15分钟
转膜
3MM Whatman滤纸	Sigma-Aldrich	Z270849
中性尼龙膜，Hybond NX	GE Healthcare Life Science	RPN203T	感光
交联
交联溶液（XLS）
1% 1-甲基咪唑（v/v）	Sigma-Aldrich	336092	务必每次新鲜配制XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl	Sigma-Aldrich	H1758	危险物质 //// 7647-01-0
3.1% EDC（w/v）	Sigma-Aldrich	3450	25952-53-8
（预）杂交
液体闪烁计数器	Beckmann	LS 6500
剪切鲑鱼精DNA，0.1 mg/ml	Life Technologies	AM9680
rasi4反义探针			5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA反义探针			5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279反义探针			5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286反义探针			5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
纯化试剂盒，Illustra MicroSpin G-25柱	GE Healthcare Life Science	27-5325-01
（预）杂交溶液（HS）
0.5% SDS	Sigma-Aldrich	71736	151-21-3
5× Denhardt溶液
20× SSPE
3.6 M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
0.2 M 磷酸钠	Sigma-Aldrich	342483	7601-54-9
20 mM EDTA（pH 8.0）	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
50× Denhardt溶液
1% Ficoll 400（w/v）	Sigma-Aldrich	F2637	26873-85-8
1% 聚乙烯吡咯烷酮	Sigma-Aldrich	PVP40	9003-39-8
1% BSA	Sigma-Aldrich	A7906	9048-46-8
1× TEN缓冲液
10 mM Tris-Cl（pH 8.0）	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
1 mM EDTA（pH 8.0）	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
探针标记
0.4 μM 寡核苷酸
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG002A	危险物质 //// 51963-61-2
1× T4多核苷酸激酶缓冲液	Biolabs	B0201
T4多核苷酸激酶 0.5单位/μl	Biolabs	M0201	EC 2.7.1.78
洗涤
盖革-米勒探测器	Canberra Industries	MCB2/CPS – EM77021
洗涤缓冲液（WB），2× SSPE
严格洗涤缓冲液
0.2× SSPE
2× SSPE，0.5% SDS
0.2× SSPE，0.5% SDS
信号检测
PharosFX Plus系统	Biorad	170-9460
Image J	免费提供
Quantity One	Biorad
X射线胶片，BioMax XAR	Sigma-Aldrich	F5888	感光
X射线胶片显影液	Sigma-Aldrich	P7042
X射线胶片定影液	Sigma-Aldrich	P7167
剥离
剥离溶液
10 mM Tris-HCl pH 8.8	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
5 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
0.1% SDS	Sigma-Aldrich	71736	煮沸后加入SDS以避免起泡 //// 151-21-3