许多神经系统和全身性疾病会改变哺乳动物大脑的神经化学特性。通过脑组织粗提物，可高效获得特征性的脑代谢物谱。为此，采用高分辨率核磁共振波谱法，能够对代谢物浓度（代谢组学）进行详细的定量分析。
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摘要
摘要
长期以来，研究人员通过在 RNA 和蛋白质水平上研究基因表达来探索疾病背后的生物学过程。近年来，基因组学和蛋白质组学得到了对生物系统中代谢物库进行全面定量分析的补充。这一策略被称为代谢组学，旨在对参与代谢的小分子组成进行全面的表征。基因组和蛋白质组定义了细胞能够执行的功能，而代谢组则是实际表型的一部分。在当前代谢组学所采用的多种方法中，光谱技术尤其受到关注，因为它们能够在无需预先选择特定生化通路的情况下同时分析大量代谢物，从而实现广泛且无偏倚的研究策略。本文介绍了一种经优化的高分辨率核磁共振（NMR）波谱法用于代谢组学分析的实验方案，该方法是高效定量组织代谢物的首选方法。该方法的重要优势包括：（i）可直接使用粗提物，无需对样品进行纯化或代谢物分离；（ii）NMR 本身具有定量特性，仅需一种参考化合物即可实现对 NMR 谱图中所有代谢物的定量；（iii）NMR 的非破坏性特点，使得同一样品可重复用于多次测量。由于 NMR 信号具有线性响应，该方法可覆盖较宽的代谢物浓度动态范围，尽管浓度极低的代谢物可能难以检测。对于丰度最低的化合物，高灵敏度的质谱方法可能更具优势，但该技术所需的样品前处理和定量流程比 NMR 波谱法更为复杂。本文所述 NMR 方案已针对大鼠脑组织分析进行了优化，但经过少量修改后，同样适用于其他组织。
引言
小鼠模型已广泛应用于脑科学研究1。一方面通过在RNA和/或蛋白质水平上研究基因表达，另一方面研究形态学、功能、电生理和/或行为表型，已在小鼠和大鼠脑中开展了基因型-表型相关性研究2-6。然而，要全面理解连接表型与基因型的机制，必须研究蛋白质表达下游的分子事件，i.e. 酶作用的生化底物的代谢过程7。这一需求在过去10至15年中推动了生物学多个领域代谢研究的复兴8,9。虽然经典代谢研究通常集中于特定代谢通路的细节，但新兴的代谢组学方法则致力于全面分析所研究组织的整体代谢谱。这一理念带来的一个直接结果是迫切需要分析工具，以最大程度减少对特定代谢通路和/或化合物类别的偏向性。然而，经典的生化检测依赖于特定分析物的特定化学反应，且该分析物必须在检测前预先确定。相比之下，核磁共振（NMR）波谱法和质谱法（MS）等光谱技术具有以下特点：(i) 基于生化化合物特有的分子（物理）性质，每种性质在一次实验所检测的谱图中产生一个或多个独立信号；(ii) 每次实验可同时检测大量不同的化合物。
因此，每个谱图都包含了大量代谢物的综合信息。正因如此，光谱方法适用于代谢组学研究，因为在测定分析物性质时无需预先进行选择8。 Consequently，这些技术天然适用于探索性研究，因为它们能极大地促进对意外代谢变化的检测。
尽管核磁共振波谱法和质谱法可互换用于多种代谢物的分析，但每种方法均具有特定的优缺点，这些已在近期得到综述10简而言之，核磁共振（NMR）波谱分析通常可直接用于粗提物，分析前无需对样品中的化合物进行色谱分离。相比之下，质谱（MS）通常需结合气相或液相色谱（GC 或 LC）分离技术，仅在少数最新进展中例外，例如质谱成像技术。在某些特殊情况下，如糖类分析，由于不同糖类在质子（¹H）谱中的共振峰存在显著重叠，NMR 分析也可能必须借助液相色谱（LC）分离。1H) NMR 谱图。然而， 1无需色谱分离的氢核磁共振（1H NMR）波谱法仍是目前最受欢迎且几乎普遍应用的代谢组学NMR方法。通常，质谱法（MS）的样品前处理比核磁共振波谱法更为耗时且复杂。由于基质效应引起的严重问题在核磁共振波谱法中远少于质谱法，而在质谱法中，基质效应可能导致信号显著衰减。两种方法均可实现代谢物的定量分析。然而，由于不同代谢物之间基质效应和电离效率的差异，质谱法需要使用多种标准品。相比之下，核磁共振波谱分析每样品仅需一种标准品，因为在适当的测量条件下，该方法具有内在的定量能力，源于被观测原子核的严格线性NMR响应。NMR的一个主要缺点是其相对较低的灵敏度。质谱法，尤其是液相色谱-质谱联用（LC-MS），其灵敏度比NMR高出数个数量级；因此，对于极低浓度化合物的分析，质谱法优于核磁共振波谱法。另一方面，核磁共振实验的非破坏性特性明显优于质谱法；因此，可对同一样品进行多次重复的NMR检测。 例如，针对不同的核磁共振活性核，例如 1H，磷-31（³¹P）31P），碳-13（13C），氟-19（19F) 等等，因为与质谱（MS）测量不同，核磁共振（NMR）不会消耗样品。
核磁共振（NMR）和质谱（MS）均可在不同模式下使用，每种模式均针对具有特定化学特性的化合物检测具有最佳效果。例如， 31P NMR 通常比 1用于分析中等浓度磷酸化化合物的氢核磁共振（¹H NMR），尽管几乎所有磷酸化代谢物也都含有质子。然而，它们的 1H NMR信号可能被掩盖 1其他非磷酸化化合物的氢核磁共振信号，而后者显然不会在 31P 核磁共振谱。在类似情况下， 19对于含氟化合物，应优先采用氟-19核磁共振（19F NMR）分析。 例如，含氟药物（无内源性代谢物的背景信号），而特例情况为 13C NMR 几乎仅在研究碳的去向时才具有重要意义 13需要追踪C标记的外源性代谢前体，由于其天然丰度极低 13碳同位素（约 1%）。许多质谱仪在负离子模式或正离子模式下工作，因此在分析前明确待观测离子带负电荷还是正电荷至关重要。本文重点介绍一种通过质谱分析脑组织代谢组的实验方案 1H 和 31P核磁共振波谱法，因为该方法在以下两方面以较低成本提供了大量重要代谢物的浓度信息：(i) 样品制备所需时间；(ii) 代谢物定量所需的劳动投入。所有实验均可使用标准湿化学实验室设备和高分辨率核磁共振波谱设施完成。其他要求详见下文 实验方案 下文部分。
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方案
注意：动物伦理声明
在大鼠上进行的动物实验遵循法国现行的指导方针，并已获得当地伦理委员会批准（编号 #40.04，法国马赛马赛大学医学院，马赛）。
1. 大鼠脑组织的收获与冷冻
- 准备所需物品：液氮（N2liq.) 放入足够大的杜瓦瓶中，以容纳冷冻夹（至少2-3 L 体积）；麻醉剂（例如，异氟烷，或氯胺酮/赛拉嗪）；麻醉室；无菌解剖器械：手术剪、手术刀、镊子；组织擦拭纸及含清洁酒精（乙醇）的瓶子；针头（25 G）；1 ml 和 10 ml 注射器。标记铝箔片（约 用胶带将尺寸为10 cm × 10 cm的铝箔片包裹单个冷冻夹取的大鼠脑组织。
注意：操作液氮时务必佩戴防护手套，并佩戴护目镜或面罩！ - 向杜瓦瓶中充入 N2liq. 并将冷冻夹放入杜瓦瓶中。确保液氮的量2liq 杜瓦瓶中的液氮足以支持多次冻夹操作（数升；氮气量2liq 每次冻钳过程中蒸发的量取决于钳子的大小。
- 麻醉动物（例如，通过异氟烷麻醉，或腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物）进行麻醉。随后通过心脏穿刺实施安乐死，以防止去除头皮和打开颅骨时发生出血。 步骤 1.4–1.7 下文描述了该标准操作流程。
注意：在需要最大程度保存葡萄糖和高能代谢物的特殊实验方案中，可通过将麻醉动物的脑组织直接浸入液氮中快速冷冻来处死大鼠，无需使用漏斗2liq11 在回缩头皮后，于间歇性N下将脑组织从颅骨中解剖出来2liq 以最小化死后代谢12. - 用消毒酒精润湿大鼠头部。使用手术剪刀（i）去除头皮，（ii）沿颅缝切开颅骨。
- 使用镊子进一步打开颅骨，并将头颅倒置，从打开的颅骨下方完整取出全脑。用纸巾迅速清除任何可见的血迹。若脑半球在代谢和形态上对称，可沿中线用手术刀切开分离两半球，取其中一侧半球用于代谢分析。如有需要，可将另一侧半球用于其他脑部研究，如组织学分析。
- 迅速将冷冻钳从 N 上取下2liq装满液氮的杜瓦瓶中，将完整或半只大鼠脑组织置于内表面之一，夹紧并立即将冷冻夹插入N2liq夹紧夹具的同时将杜瓦瓶装满液氮。确保 步骤 1.3–1.6 不超过60秒。
- 1-2 分钟后，从 Dewar，打开夹具，将冻存的脑组织从夹具上松开，并用适当标记的铝箔包裹冻存组织（参见 1.1 如上所述）。确保标签清晰可读，并在样品包裹后牢固粘贴。迅速将包裹好的样品放入N2liq整个操作过程应尽快完成，以避免冷冻脑组织解冻。
- 将冷冻样品储存在 N 中2liq 或在 -80 °C 冰箱中保存至进行代谢物提取。
注意：当生物样本需要保存超过一年时，应于液氮中保存2liq 温度优先选择高于-80 °C。本方案其余部分同样适用此原则。
2. 代谢物提取步骤的制备
- 准备组织匀浆器及配套的试管（例如，内径10 mm，具体取决于匀浆器轴的直径；通常由塑料制成）。使用电动匀浆器而非手动匀浆器（组织研磨器）。准备涡旋振荡器和实验室天平。
- 准备一个装有碎冰的容器。将甲醇、氯仿和水（每250–350 mg冷冻脑组织各需4 ml）置于冰上预冷，确保用量充足。
- 准备移液管和小瓶。
- 准备带有螺旋盖的玻璃小瓶（体积 ≥20 ml），置于冰上（每份组织提取物使用一瓶）。螺旋盖需配有耐氯仿的聚四氟乙烯（Teflon）隔垫。
- 准备5 ml塑料移液管用于分配甲醇和水，使用玻璃移液管或Hamilton注射器用于分配氯仿。另准备若干塑料移液管（5或10 ml体积）用于转移组织匀浆与甲醇的混合物。
- 确保所有玻璃器皿在使用前用蒸馏水彻底冲洗并小心干燥，以去除杂质残留，特别是核磁共振可检测的甲酸盐和乙酸盐。
- 将N填充至瓷研钵中2liq，将瓷制研杵放入研钵中，并用 N 重新填满2liq氮气将蒸发，直至研钵和研杵的温度足够低。保留少量 N2liq 在研钵中。
3. 代谢物提取
- 从储存中取出冷冻脑组织样本（N2liq 罐或 -80 °C 冰箱）。然后立即将组织样本转移至装有部分液氮的研钵中2liq.
- 使用 N2liq- 使用预冷的研钵和研杵将冷冻的脑组织破碎成较小的碎片，以便于装入用于组织匀浆的试管中。为防止冷冻组织碎片在研磨过程中从研钵中飞溅出来，可在铝箔包裹下进行破碎。切勿将冷冻组织研磨成粉末，因为这会增加水汽冷凝的风险，使转移至试管的操作更加困难。重要提示：在整个操作过程中，需添加 N2liq 根据需要将样品转移至研钵，以保持其深度冷冻状态。
- 将冻存的脑组织小块充分混合后，称取250–350 mg，转移至装有冰甲醇的试管中（每250–350 mg脑组织加入4 ml甲醇）。每次加入冻存组织块后，立即使用组织匀浆器进行匀浆。
注意：整个操作过程需迅速完成，以避免（i）样品表面产生明显冷凝水，导致样品重量被高估；（ii）样品受热或解冻。在均质化过程开始时，各组织样品应保持冻结状态。 - 在将最后一块冷冻大鼠脑组织样本加入试管并匀浆后，将匀浆液转移至一个≥20 1.5 ml体积的玻璃小瓶，盖上螺旋盖，置于冰上静置15分钟。若试管体积不足以容纳≥4 ml甲醇，则使用较小体积的甲醇匀浆部分冷冻脑组织，将匀浆液转移至玻璃小瓶中，然后用新鲜甲醇继续匀浆剩余的组织碎片。确保每250–350 mg脑组织的总甲醇体积为4 ml。
- 加入等体积的冰冻氯仿（即，每250-350 mg脑组织加入4 ml裂解液，充分涡旋混匀，冰上静置15分钟。
注意：操作挥发性溶剂（尤其是氯仿）时，务必使用通风橱！ - 加入等体积的水（即，每250-350 mg脑组织加入4 ml），充分涡旋混匀，于-20 °C过夜静置。
4. 相分离与溶剂蒸发的制备
- 准备预冷的离心机（4 °C，最大半径下13,000 × g）和离心管。确保离心管体积≥20 ml，耐氯仿，并能承受13,000 × g的离心力。使用专用的玻璃离心管，但在使用前需用蒸馏水冲洗（所有玻璃器皿均需如此，见 2.3).
- 准备经过充分冲洗的玻璃巴斯德移液管和合适的移液器辅助工具（吸球、手动移液泵、自动移液器助吸器）， 等等.).
- 为每个脑组织样本准备另外两个彻底清洗过的试管（体积 ≥15 ml），其中一个需耐氯仿（由玻璃或聚四氟乙烯制成），另一个需耐甲醇（由耐甲醇的塑料或玻璃制成）。
- 准备溶剂蒸发装置（可使用市售或自制设备）。确保该装置能提供受精确控制的干燥氮气流，并将其导入含有挥发性溶剂（甲醇、氯仿）的提取液表面。
- 准备另外两个装有冰的托盘或水桶：一个用于样品在冰上运输，另一个用于在蒸发过程中保持样品低温。
- 准备冻干机及冻干所需材料：(i) 每种提取物配备一个 50 ml 离心管或真空圆底烧瓶，(ii) N2liq 以冷冻样品的水相（≤0.3 每份样品使用 L。若使用离心管，还需准备适用于冻干机的宽口真空过滤瓶。
5. 相分离与溶剂蒸发
- 为实现完全相分离，将甲醇/氯仿/水/脑组织匀浆液转移（参见 3.6) 转移至耐氯仿的离心管（≥20 ml 体积）中，在 13,000 x g 和 4 °C 条件下离心 40 分钟。
注意：将形成两相，中间由一层沉淀的蛋白质分隔。下层（较重相）包含甲醇、氯仿和溶解的脂质，而上层（较轻相）包含水、甲醇和溶解的水溶性代谢物。 - 使用巴斯德移液管将上层相转移至适当的 ≥15 ml 离心管中（耐甲醇的塑料管或玻璃管），置于冰上保存。
- 使用一支新的巴斯德移液管将下层相转移至适当的 ≥15 ml 管（玻璃或聚四氟乙烯）。置于冰上保存。
- 若需用于总蛋白测定，将沉淀的蛋白层于 -80 °C 保存；否则弃去。
- 保留含有水/甲醇相的试管（参见 5.2) 冰上操作，并将干燥的氮气流对准提取液表面以蒸发甲醇。或者，可将氮气轻柔地通入提取液中。当氮气鼓泡不再导致提取液体积减少时，终止蒸发过程。此时，继续进行冷冻干燥（参见 5.7），或在管子密闭（螺旋盖或封口膜）的情况下将样品于 -80 °C 冻存，直至进行冻干。
- 将含有甲醇/氯仿相的离心管放置（见 5.3将样品置于冰上，并将干燥的氮气流对准提取液表面以蒸发甲醇。当所有溶剂完全蒸发后，停止操作，将样品保存于-80 °C，试管需封闭（使用螺旋盖或Parafilm封口），直至进行NMR分析。
- 制备用于冻干的水相
- 甲醇蒸发过程结束后（参见 5.5），将样品转移至一个彻底冲洗过的50 ml离心管中（如果样品为冷冻状态，需先解冻再转移）。或者，也可转移至真空圆底烧瓶中。
- 将离心管（或圆底烧瓶）部分插入液氮中旋转，使提取液迅速冷冻2liq 使试管或烧瓶的内表面逐渐被冻结的液体覆盖。确保没有 N2ml 可以进入 receptacle。
- 当所有液体完全冻结后，用带孔的盖子或螺口盖盖住试管，以允许蒸汽逸出，并将试管放入宽口真空过滤瓶中。
- 在将烧瓶或瓶子连接至冷冻干燥机后，开始冻干。
- 当样品完全干燥后，终止冻干过程。将样品置于-80 °C保存于密闭试管中（务必盖紧管盖！），直至用于NMR分析。
注意：通常冻干所需时间不超过24小时。根据冻干机的设计以及使用的是宽口瓶中的离心管还是圆底烧瓶，可同时对多个样品进行冻干。
6. 核磁共振样品的制备
- 将干燥及冻干提取物于极低温度（≤-80 °C）保存。为制备核磁共振（NMR）样品，可将冻干物重新溶解。 立即 在进行核磁共振实验之前。
注意：将样本储存在溶液中和/或接近室温条件下可能导致样本降解！ - 按如下步骤配制200 mM的螯合剂水溶液：反式-1,2-环己二胺四乙酸（CDTA）。
- 加入纯水（例如，20 ml）加入到试管或离心管中，并加入足量的CDTA粉末以配制200 mM溶液。
注意：由于使用了CDTA的酸形式而非CDTA盐，pH值非常低，因此CDTA的大部分将不溶解。 - 逐步向 CDTA 溶液中加入越来越多的 CsOH 粉末，每次加入后充分涡旋混匀。
注意：水溶液中CsOH含量增加时，可溶性CDTA组分将随之增加。避免 "过度滴定", 即 添加 较少 比CDTA溶液的化学计量量更多的CsOH。 - 当几乎所有的CDTA粉末溶解后，每次加入CsOH并充分涡旋混合后开始测量pH值。当达到最终pH值时，停止加入CsOH（表1).
注意：此时，所有 CDTA 均已溶解。Cs 的使用+ 作为CDTA的抗衡离子时，通常优先选择Na+ 或 K+. Cs+ 由于其较大的离子半径，是一种软路易斯酸，而钠则不是+ 和 K+ 离子半径较小且为硬酸的元素。因此，Cs+ 与磷酸盐（硬碱）形成配合物的能力弱于钠+ 和 K+。这对于 31P NMR 波谱法分析磷酸化代谢物时，由于络合作用往往会导致核磁共振谱线变宽，尤其是在离子交换速率较慢至中等的条件下更为显著。
- 加入纯水（例如，20 ml）加入到试管或离心管中，并加入足量的CDTA粉末以配制200 mM溶液。
- 对于 31P NMR 分析磷脂（PL），将干燥的脂质溶解（参见 5.6) 溶于700 µl由氘代氯仿（CDCl₃）和甲醇组成的溶剂混合液中3），甲醇以及按前述方法配制的CDTA溶液 6.2 （5:4:1 体积比）。将样品转移至微量离心管中。在两个步骤中均使用带有耐氯仿吸头的直排式（或正排式）微量移液器。
注意：请谨记，更改以下任一参数都会影响磷脂（PL）的外观（化学位移和谱线宽度） 31P NMR 谱图 13-17:
(i) 体积比 CDCl3 甲醇 : CDTA 溶液
（ii）使用的总溶剂体积
(iii) 溶剂中水相组分的pH值
（iv）溶剂水相组分中的CDTA浓度。
注意：通常情况下，这些样本参数的微调（表1）并非必要，仅在特殊情况下需要时应极其谨慎地进行。改变溶剂之间的体积比容易导致形成两相体系，而非单一的均相体系！在大多数应用中，单相体系比两相体系更具实用性。13,14. - 对于 1水溶性代谢物的H NMR分析，溶解冻干粉（见 5.8) 在 700 µl 氘代水（D₂O）中2O) 含 3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d4 钠盐（TSPd4) 在毫摩尔浓度范围内（D2含 0.05% TSPd 的 O 溶液4 可从商业渠道获得）。将样品转移至微量离心管中。
- 通过逐滴加入少量（约 2 µl 的氘代盐酸（DCl）和氘代氢氧化钠（NaOD）溶液。首先使用 0.02 N 的 DCl 或 NaOD 溶液。如果 2 或 3 后续添加不会引起足够的pH变化时，继续使用0.2 N DCl或NaOD溶液。注意避免过量滴定。
注意：所需 DCl 或 NaOD 溶液的总体积取决于提取的脑组织量；请记录该数值以进行精确的代谢物定量。在大多数情况下，加入的 DCl 和 NaOD 溶液总体积应几乎可忽略不计（约为 NMR 样品体积的 1%）。
7. 脑磷脂分析的31P核磁共振实验性能13,14
- 为获得最佳结果，建议使用多核高分辨率核磁共振波谱仪（磁场强度≥9.4特斯拉，对应162 MHz） 31P，或 400 MHz 1H共振频率）。此外 31P线圈，确保 31P NMR探针具有一个 1用于质子去耦的H线圈。将核磁共振探头的温度调节设定至目标值（通常为25 °C）。
注意：探头温度可能需要 10–20 分钟才能稳定！ - 在4 °C、11,000 × g条件下，将微离心管中的PL提取液（见6.3）离心30分钟，以沉淀样品中的固体残渣。转移600 µl上清液至高质量NMR管（外径5 mm）中。
- 准备合适的同轴插入管，内装 pH 7.0 的 20 mM 亚甲基二膦酸（MDP）水溶液，用于化学位移校准和定量分析。将该插入管置于装有 PL 提取液的 NMR 管中。
- 将NMR管装入合适的转子，并转移至NMR磁体中。随后以15–20 Hz转速旋转样品，并等待样品温度达到设定值约 10 分钟。
- 通过调节轴向和非轴向匀场线圈电流，仔细减小样品中磁场的不均匀性18.
- 将核磁共振谱图采集参数设置为最佳值，这些参数可能随磁场强度的不同而变化（对于9.4 T系统，参见 表1 （有关推荐的参数值）。
- 设置每次实验的瞬态数（= NS）。
- 将NS设为约80（数据采集的总持续时间） 约 20 分钟）如果仅需精确定量最主要的磷脂（磷脂酰胆碱（PtdCho）、磷脂酰乙醇胺（PtdEtn）、乙醇胺缩醛磷脂）。
- 若需定量浓度较低的磷脂（如烷酰基磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸），将NS设为约100–200（总数据采集时间1–2小时）。
- 若需定量极低浓度的PLs，将NS设为约1,500–2,000（数据采集总时长7–10小时；过夜实验） 例如 磷脂酰肌醇单磷酸和二磷酸（PtdIP 和 PtdIP）2），心磷脂、溶血磷脂、烷基酰基磷脂酰乙醇胺，以及偶尔出现的其他成分。
- 谱图采集结束后，使用优化参数处理自由感应衰减（FID）信号。这些参数的取值随磁场强度、匀场质量以及待定量的PL信号而变化。
- 为获得磷脂全范围的最佳结果，应使用多种（至少两种）不同的滤波方法重复处理。对于严重重叠的信号，采用强分辨率增强。 例如用于PtdCho和PtdEtn区域。
- 弱信号应使用强滤波（避免使用弱滤波或分辨率增强）。
- 通过切趾法滤除非常微弱且宽泛、无明显重叠的信号例如，LB = 3 Hz）以提高信噪比， 例如 PtdIP 和 PtdIP2参见 表1 用于特征处理参数。
- 将每个PL信号的面积与同一光谱中参考化合物（MDP）信号下的面积进行比较，以量化其面积。
- 在单独的实验中，使用装有（i）已知浓度的磷化合物和（ii）与PL中所用相同的同轴插入管杆的5 mm NMR样品管，对参考化合物（MDP）的信号进行校准。 31P 核磁共振实验（参见 7.3 和 7.9).
- 根据磷脂信号的相对峰面积计算各磷脂浓度（参见 7.9），以及从同轴插入物获得的MDP校准值（参见 7.10）。需考虑到对某一特定信号有贡献的磷原子核的数量 31P NMR信号可能因其信号的分子来源不同而有所变化。
注意：MDP 磷酸盐信号（通常以 19.39 ppm 为参考）代表两个磷原子核，心磷脂磷酸盐信号同样如此。其他所有磷脂 31脑提取物中检测到的P核磁共振信号各自代表一个磷原子核。 - 根据需要使用统计学软件比较各组动物之间的脑部PL水平。
8. 水溶性脑代谢物分析的1H NMR实验性能
- 设置温度调节的 1H NMR探针调至目标值（通常为25 °C）。另见相关说明 7.1.
- 在微量离心管中离心水相提取液（参见 6.5在 4 °C、11,000 x g 条件下离心 30 分钟，以沉淀样品中的固体残渣。将 600 µl 上清液转移至高质量 NMR 管（外径 5 mm）中。
- 将核磁共振管转移至核磁共振磁体中，进行匀场，并按照说明将核磁共振谱图采集参数设置为最佳值 7.4-7.6参见 表1 推荐参数值。
- 将每次实验的瞬态数设置为约 NS = 32（数据采集总时长 约 13 分钟）。为了获得较弱信号（尤其是在芳香区）的良好信噪比，应使用 NS = 64（数据采集总时长） 约 26 分钟或更长时间。
- 光谱采集结束后，使用优化参数对自由感应衰减（FID）信号进行处理。这些参数的取值会因磁场强度、匀场质量以及待定量的代谢物信号而略有差异。
注意：在大多数情况下，只需对每个谱图处理一次，采用一组能够对所有代谢物信号提供良好折中效果的处理参数即可。参见 表1 用于特征处理参数。 - 以参考化合物（TSP-d）信号下的面积为基准，对每种代谢物信号的面积（通常为多重峰，有时会与其他分子产生的单峰或多重组信号重叠）进行定量。4）在同一光谱中。
- 根据TSP-d计算单个代谢物浓度4 浓度（参见 6.4）。需考虑到对某一特定信号有贡献的质子数量 1H NMR信号可能因其信号的分子来源不同而有所变化。TSP-d4 三甲基信号（以0.0 ppm为参考）代表九个质子。
- 根据需要使用统计学软件比较各组动物之间的脑代谢物水平。
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结果
为了在脑组织及其他组织提取物的代谢物核磁共振（NMR）谱图中获得最佳分辨率，长期以来普遍采用的方法是去除或屏蔽提取液中存在的金属离子（尤其是顺磁性离子）。这一目的通常通过向提取物中添加螯合剂（如EDTA或CDTA）来实现。19，或通过Chelex-100等离子交换树脂处理提取物20. 本文展示的结果 图1 证明该步骤对于此过程并非必要 1根据上述方案仔细制备脑组织提取物后进行氢核磁共振（¹H NMR）波谱分析。在此条件下，所分析的所有波谱区域均获得了极窄的谱线。即使在信号非常密集的区域， 例如，用于谷氨酰胺/谷氨酸的检测 myo-肌醇/甘氨酸，峰位于某一距离处 <0.01 ppm 在 400 MHz 下几乎可以完全分离图1，底部）。因此，对中心和底部图谱中可见的众多微小但目前尚未指认的峰进行定性和定量分析 图1 未来可以预见。
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讨论
核磁共振波谱法是一种高效、高度可重复且准确测定溶液中化学化合物浓度的方法。然而，要获得高质量的数据，必须遵循样品制备和分析过程中的若干规范。在利用核磁共振波谱法测定代谢物浓度时，只要观测信号的强度未接近检测阈值（即信号极弱），信号的产生或接收过程均不会成为定量误差的主要来源。在其他所有情况下，生物学变异、样品制备技术（提取效率、化合物的物理和化学稳定性、移液和称量误差） 等等。），以及信号采集和处理参数的选择将决定结果的精确性和准确性。显然，组织采集过程中发生的任何代谢变化都会反映在所获得的代谢物浓度中。因此，必须尽快完成组织采集，并采用特定的组织冷冻技术（如漏斗冷冻），以确保结果的准确性 体内 快速代谢化合物的浓度非常重要（尤其是葡萄糖、乳酸、ATP及其分解产物、ADP和AMP）。
即使在常规高分辨率核磁共振波谱仪的中等磁场强度（9.4 T）下，也能获得优异的谱图。例如，在 1大鼠脑组织提取物水相的氢核磁共振谱中，化学位移差Δδ达到 约 0.005 ppm（对应于2.0） 赫兹，400...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
谨此感谢法国国家科学研究中心（CNRS，UMR 6612 和 7339）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷 | Virbac | Vetflurane | 动物用麻醉剂 |
| 异氟烷蒸发器 | Ohmeda | Isotec 3 | 更新型号：Isotec 4 |
| 手术刀、剪刀、镊子、夹子 | Harvard Apparatus Fisher Scientific | 多种 多种 | 动物手术器械 |
| 冷冻夹具 | 自制 | n/a | 带铝板的钳子，用于插入 液氮中冷却 |
| 杜瓦瓶 | Nalgene | 4150-4000 | |
| 液氮 | Air Liquide | n/a | |
| 氮气 | Air Liquide | n/a | |
| 氮气蒸发仪 | Organomation Associates | N-EVAP 111 | 可用自制装置替代 |
| 研钵 | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| 研杵 | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| 组织匀浆器 | Kinematica | Polytron | 配备适配匀浆器转轴的试管 |
| 电子天平 | Sartorius | n/a | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| 玻璃离心管 | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml、30 ml 管 |
| 微量离心管 | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml 管；若与离心机转子兼容，应替代 "Eppendorf" 管 |
| 聚苯乙烯移液管 | Costar Corning | Stripettes | 5 ml 和 10 ml 规格 |
| 氘代氯仿 | Sigma-Aldrich | 431915 | 氘代度 99.96% |
| 重水 | Sigma-Aldrich | 423459 | 氘代度 99.96% |
| 氘化氯 | Alpha Aesar | 42406 | 20% 溶于重水 |
| 氘氧化钠 | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% 溶于重水 |
| 冷冻干燥机 | Christ | Alpha 1-2 | |
| 低温离心机 | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH 计 | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| 氢氧化铯 | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR 管 | Wilmad | 528-PP | |
| NMR 同轴内插管 | Sigma-Aldrich | Z278513 | 由 Wilmad 生产 |
| NMR 移液管 | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| 移液器 | Eppendorf | Research | 配备适用于 0.5 至 1,000 μl 体积的吸头 |
| 移液辅助器 | Drummond | XP | |
| NMR 波谱仪 | Bruker | AVANCE 400 | 含探头及其他附件 |
| NMR 软件 | Bruker | TopSpin 1.3 | 更新版本可用：Topspin 3.2 |
| 水溶性标准化合物 | Sigma-Aldrich | 多种 | |
| 磷脂标准化合物 | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich | 多种 多种 多种 | 缩醛磷脂来源，但纯度可能 <70 - 80% |
| 亚甲基二膦酸 | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
参考文献
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