利用组织提取物的高分辨率核磁共振波谱法对大鼠脑组织进行代谢组学分析

摘要

许多神经系统和全身性疾病会改变哺乳动物大脑的神经化学特性。通过脑组织粗提物，可高效获得特征性的脑代谢物谱。为此，采用高分辨率核磁共振波谱法，能够对代谢物浓度（代谢组学）进行详细的定量分析。

摘要

长期以来，研究人员通过在 RNA 和蛋白质水平上研究基因表达来探索疾病背后的生物学过程。近年来，基因组学和蛋白质组学得到了对生物系统中代谢物库进行全面定量分析的补充。这一策略被称为代谢组学，旨在对参与代谢的小分子组成进行全面的表征。基因组和蛋白质组定义了细胞能够执行的功能，而代谢组则是实际表型的一部分。在当前代谢组学所采用的多种方法中，光谱技术尤其受到关注，因为它们能够在无需预先选择特定生化通路的情况下同时分析大量代谢物，从而实现广泛且无偏倚的研究策略。本文介绍了一种经优化的高分辨率核磁共振（NMR）波谱法用于代谢组学分析的实验方案，该方法是高效定量组织代谢物的首选方法。该方法的重要优势包括：（i）可直接使用粗提物，无需对样品进行纯化或代谢物分离；（ii）NMR 本身具有定量特性，仅需一种参考化合物即可实现对 NMR 谱图中所有代谢物的定量；（iii）NMR 的非破坏性特点，使得同一样品可重复用于多次测量。由于 NMR 信号具有线性响应，该方法可覆盖较宽的代谢物浓度动态范围，尽管浓度极低的代谢物可能难以检测。对于丰度最低的化合物，高灵敏度的质谱方法可能更具优势，但该技术所需的样品前处理和定量流程比 NMR 波谱法更为复杂。本文所述 NMR 方案已针对大鼠脑组织分析进行了优化，但经过少量修改后，同样适用于其他组织。

引言

小鼠模型已广泛应用于脑科学研究¹。一方面通过在RNA和/或蛋白质水平上研究基因表达，另一方面研究形态学、功能、电生理和/或行为表型，已在小鼠和大鼠脑中开展了基因型-表型相关性研究^2-6。然而，要全面理解连接表型与基因型的机制，必须研究蛋白质表达下游的分子事件，i.e. 酶作用的生化底物的代谢过程⁷。这一需求在过去10至15年中推动了生物学多个领域代谢研究的复兴^8,9。虽然经典代谢研究通常集中于特定代谢通路的细节，但新兴的代谢组学方法则致力于全面分析所研究组织的整体代谢谱。这一理念带来的一个直接结果是迫切需要分析工具，以最大程度减少对特定代谢通路和/或化合物类别的偏向性。然而，经典的生化检测依赖于特定分析物的特定化学反应，且该分析物必须在检测前预先确定。相比之下，核磁共振（NMR）波谱法和质谱法（MS）等光谱技术具有以下特点：(i) 基于生化化合物特有的分子（物理）性质，每种性质在一次实验所检测的谱图中产生一个或多个独立信号；(ii) 每次实验可同时检测大量不同的化合物。

因此，每个谱图都包含了大量代谢物的综合信息。正因如此，光谱方法适用于代谢组学研究，因为在测定分析物性质时无需预先进行选择⁸。 Consequently，这些技术天然适用于探索性研究，因为它们能极大地促进对意外代谢变化的检测。

尽....

方案

注意：动物伦理声明
在大鼠上进行的动物实验遵循法国现行的指导方针，并已获得当地伦理委员会批准（编号 #40.04，法国马赛马赛大学医学院，马赛）。

1. 大鼠脑组织的收获与冷冻

1. 准备所需物品：液氮（N_2liq.) 放入足够大的杜瓦瓶中，以容纳冷冻夹（至少2-3 L 体积）；麻醉剂（例如，异氟烷，或氯胺酮/赛拉嗪）；麻醉室；无菌解剖器械：手术剪、手术刀、镊子；组织擦拭纸及含清洁酒精（乙醇）的瓶子；针头（25 G）；1 ml 和 10 ml 注射器。标记铝箔片（约 用胶带将尺寸为10 cm × 10 cm的铝箔片包裹单个冷冻夹取的大鼠脑组织。
   注意：操作液氮时务必佩戴防护手套，并佩戴护目镜或面罩！
2. 向杜瓦瓶中充入 N_2liq. 并将冷冻夹放入杜瓦瓶中。确保液氮的量_2liq 杜瓦瓶中的液氮足以支持多次冻夹操作（数升；氮气量_2liq 每次冻钳过程中蒸发的量取决于钳子的大小。
3. 麻醉动物（例如，通过异氟烷麻醉，或腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物）进行麻醉。随后通过心脏穿刺实施安乐死，以防止去除头皮和打开颅骨时发生出血。 步骤 1.4–1.7 下文描述了该标准操作流程。
   注意：在需要最大程度保存葡萄糖和高能代....

结果

为了在脑组织及其他组织提取物的代谢物核磁共振（NMR）谱图中获得最佳分辨率，长期以来普遍采用的方法是去除或屏蔽提取液中存在的金属离子（尤其是顺磁性离子）。这一目的通常通过向提取物中添加螯合剂（如EDTA或CDTA）来实现。¹⁹，或通过Chelex-100等离子交换树脂处理提取物²⁰. 本文展示的结果 图1 证明该步骤对于此过程并非必要 ¹根据上述方案仔细制备脑组织提取物后进行氢核磁共振（¹H NMR）波谱分析。在此条件下，所分析的所有波谱区域均获得了极窄的谱线。即使在信号非常密集的区域， 例如，用于谷氨酰胺/谷氨酸的检测 myo-肌醇/甘氨酸，峰位于某一距离处 <0.01 ppm 在 400 MHz 下几乎可以完全分离图1，底部）。因此，对中心和底部图谱中可见的众多微小但目前尚未指认的峰进行定性和定量分析 图1 未来可以预见。

讨论

核磁共振波谱法是一种高效、高度可重复且准确测定溶液中化学化合物浓度的方法。然而，要获得高质量的数据，必须遵循样品制备和分析过程中的若干规范。在利用核磁共振波谱法测定代谢物浓度时，只要观测信号的强度未接近检测阈值（即信号极弱），信号的产生或接收过程均不会成为定量误差的主要来源。在其他所有情况下，生物学变异、样品制备技术（提取效率、化合物的物理和化学稳定性、移液和称量误差） 等等。），以及信号采集和处理参数的选择将决定结果的精确性和准确性。显然，组织采集过程中发生的任何代谢变化都会反映在所获得的代谢物浓度中。因此，必须尽快完成组织采集，并采用特定的组织冷冻技术（如漏斗冷冻），以确保结果的准确性 体内 快速代谢化合物的浓度非常重要（尤其是葡萄糖、乳酸、ATP及其分解产物、ADP和AMP）。

即使在常规高分辨率核磁共振波谱仪的中等磁场强度（9.4 T）下，也能获得优异的谱图。例如，在 ¹大鼠脑组织提取物水相的氢核磁共振谱中，化学位移差Δδ达到 约 0.005 ppm（对应于2.0） 赫兹，400.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Virbac	Vetflurane	动物用麻醉剂
异氟烷蒸发器	Ohmeda	Isotec 3	更新型号：Isotec 4
手术刀、剪刀、镊子、夹子	Harvard Apparatus Fisher Scientific	多种 多种	动物手术器械
冷冻夹具	自制	n/a	带铝板的钳子，用于插入 液氮中冷却
杜瓦瓶	Nalgene	4150-4000
液氮	Air Liquide	n/a
氮气	Air Liquide	n/a
氮气蒸发仪	Organomation Associates	N-EVAP 111	可用自制装置替代
研钵	Sigma-Aldrich	Z247472
研杵	Sigma-Aldrich	Z247510
组织匀浆器	Kinematica	Polytron	配备适配匀浆器转轴的试管
电子天平	Sartorius	n/a
甲醇	Sigma-Aldrich	M3641
氯仿	Sigma-Aldrich	366910
玻璃离心管	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml、30 ml 管
微量离心管	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml 管；若与离心机转子兼容，应替代 "Eppendorf" 管
聚苯乙烯移液管	Costar Corning	Stripettes	5 ml 和 10 ml 规格
氘代氯仿	Sigma-Aldrich	431915	氘代度 99.96%
重水	Sigma-Aldrich	423459	氘代度 99.96%
氘化氯	Alpha Aesar	42406	20% 溶于重水
氘氧化钠	Sigma-Aldrich	164488	30% 溶于重水
冷冻干燥机	Christ	Alpha 1-2
低温离心机	Heraeus	Megafuge 16R
pH 计	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
氢氧化铯	Sigma-Aldrich	516988
NMR 管	Wilmad	528-PP
NMR 同轴内插管	Sigma-Aldrich	Z278513	由 Wilmad 生产
NMR 移液管	Sigma-Aldrich	Z255688
移液器	Eppendorf	Research	配备适用于 0.5 至 1,000 μl 体积的吸头
移液辅助器	Drummond	XP
NMR 波谱仪	Bruker	AVANCE 400	含探头及其他附件
NMR 软件	Bruker	TopSpin 1.3	更新版本可用：Topspin 3.2
水溶性标准化合物	Sigma-Aldrich	多种
磷脂标准化合物	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	多种 多种 多种	缩醛磷脂来源，但纯度可能 <70 - 80%
亚甲基二膦酸	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913