体内成像观察C. elegans中dauer特异性神经元的重塑

摘要

在暴露于特定环境应激因素后，线虫Caenorhabditis elegans会经历广泛的表型可塑性，从而进入一种抗逆境的“dauer”幼虫阶段。本文介绍了在dauer阶段期间对神经可塑性进行可控诱导和成像的方法。

摘要

控制动物应激诱导表型可塑性的机制通常十分复杂且难以研究 体内一种典型的应激诱导可塑性实例是线虫的dauer阶段 秀丽隐杆线虫滞育幼虫是在细菌食物浓度较低且存在高浓度滞育信息素的条件下形成的一种替代性发育幼虫阶段。滞育幼虫表现出显著的发育和行为可塑性。例如，一组位于唇区的内唇四分体（IL2Q）神经元在滞育形成过程中会发生广泛的可逆性重塑。本文展示了利用已知调控滞育进入的环境通路，从大规模液体线虫培养物中制备粗提滞育信息素的既定方法。采用该方法，当液体培养物中线虫密度达到每毫升50,000至75,000条时，即可产生具有高度活性的粗提滞育信息素。粗提信息素的活性通过剂量-反应生物测定法进行评估。最后，文中还介绍了用于 体内 描述了在滞育形成期间对IL2Qs进行的延时成像。

引言

表型可塑性，包括发育可塑性和行为可塑性，在生物适应不利环境条件中起重要作用，并被认为是推动进化的关键力量¹。C. elegans 是发育生物学和神经生物学研究中常用的一种模式生物。在理想条件下，C. elegans 经历四个幼虫阶段后进入成虫繁殖阶段。然而，在食物匮乏和种群密度较高的条件下，C. elegans 可发生发育转变，进入一种寿命较长且具有抗逆性的持存幼虫（dauer）阶段²。持存幼虫在形态和行为上表现出多种与非持存个体不同的特征，这些特征可能介导了其抗逆能力。调控持存幼虫形成的环境信号和遗传通路已有广泛研究和描述^{3, 4, 5, 6, 7}。然而，控制持存形成过程中各个具体表型变化的分子机制仍了解较少。

观察特定于dauer期的表型需要制备dauer期动物。这可以通过三种方式实现：1）从饥饿培养的C. elegans群体中手动挑选，2）利用dauer期形成组成型（daf-c）突变体，3）通过纯化的信息素诱导dauer期形成。从标准NGM平板上挑选dauer期个体相对简单，该平板上的C. elegans种群已耗尽其细菌食物来源。在我们的实验条件下，一个标准NGM平板最初接种50 µl OP50 Escherichia coli，培养3天 后接种3–4条成年雌雄同体线虫，....

方案

1. 粗制滞育信息素的制备

1. 从单个菌落接种，在 37 °C、200 rpm 振荡条件下，于 100 ml LB 液体培养基中过夜（O/N）培养 OP50 E. coli。注意：此过夜培养物可提前制备，并在 4 °C 下保存。
2. 将 N2 C. elegans 培养于 15–20 个 6 cm 培养皿的 NGM 琼脂平板上（配方见表 1），每皿接种 50 µl OP50 E. coli，直至细菌几乎耗尽¹⁹。
3. 在 1 L 锥形瓶中配制 5 份各 250 ml 的 S 培养基（配方见表 1）¹⁹。注意：该溶液可提前配制。
4. 在 4 L LB 液体培养基中接种 1 ml OP50 E. coli，于 37 °C 振荡培养 16 小时，过夜培养 OP50 E. coli 培养物。
5. 用 1 ml S 基础溶液（配方见表 1）从步骤 1.2 的平板上冲洗线虫，并将 4–5 个平板的线虫转移至步骤 1.3 中制备的 S 培养基的 4 个 1 L 锥形瓶中（每瓶对应 4–5 个平板）¹⁹。
6. 将步骤 1.4 中的 OP50 在 650 × g 条件下离心 10 分钟，弃上清液。将每份细菌沉淀重悬于 10 ml S 基础溶液中。将等量重悬的细菌分别加入各瓶线虫 S 培养基中。

结果

粗提滞育信息素的产物为黄色液体（图1），具有耐热和耐寒的稳定性。粗提信息素分装后可于-20 °C长期保存，活性无明显损失。信息素制备完成后，通过一次剂量-反应生物测定即可对其活性进行粗略评估。然而，对于大多数实验而言，需重复生物测定2–3次，并取每次实验的平均值进行分析。图3展示了两次信息素生物测定的代表性结果。根据这些数据可计算出EC₅₀和EC₉₀。

除了对十二烷基硫酸钠具有抗性外²，滞育幼虫还可通过多种形态学特征进行识别，包括封闭的口孔、侧翼纵脊、前部表皮下折射体以及萎缩的咽部（图2 和 图4A 显示L2幼虫）。滞育幼虫还具有若干独特的行为特征，包括：倾向于保持行为静止、存在一种称为立起行为（nictation）的偶发扩散策略、抑制头部觅食运动、抑制咽部抽吸活动以及诱导排泄管节律性搏动^{2, 5, 23}。这些行为特征在个体间存在变异。

讨论

研究特定于dauer阶段的神经可塑性及其他与dauer相关的形态学变化，需要通过基因突变（例如 daf-c 突变体）或暴露于信息素的方式，实现对dauer形成过程的可控且可靠的诱导。尽管利用基因突变诱导dauer具有操作便利的优点，但可能干扰实验结果。因此，基于daf-c突变体所获得的数据，应进一步通过野生型动物经dauer信息素诱导进入dauer阶段的实验加以验证。

粗制滞育信息素的制备相对简单，已有多种该方案的变体被发表¹⁸。除可能的污染外，本文所述方法非常可靠。为制备提取物，我们采用在S培养基液体培养液中高密度培养线虫的标准方法¹⁹。接种至液体培养液中的初始线虫接种量在数量上具有较大灵活性。起始时使用较多数量的线虫可加快实验进程。然而，必须确保所有初始接种的线虫均无污染。在液体培养基中培养过程中可能产生真菌或细菌污染。真菌污染可通过菌丝的存在轻易检测。细菌污染则较难评估，通常若在规定的孵育时间后液体培养物未能迅速变澄清，则可能提示存在细菌污染。产生足量信息素所需的总线虫种群密度也具有一定灵活性。例.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
N2 C. elegans 布里斯托尔品系	秀丽隐杆线虫遗传中心
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	向 Schroeder 实验室申请获取
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	向 Schroeder 实验室申请获取
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	秀丽隐杆线虫遗传中心
OP50 大肠杆菌	秀丽隐杆线虫遗传中心
培养皿	Tritech Research	60 mm T3308，35 mm T3501
NGM 琼脂	多种来源		将 3 g NaCl、17 g 琼脂、2.5 g 蛋白胨溶于 975 ml H2O 中，高压灭菌后冷却至 55°C，再加入 1 ml 5 mg/ml 溶于乙醇的胆固醇、25 ml 1 M KPO4 缓冲液（pH 6.0）、1 ml 1 M CaCl2、1 ml 1 M MgSO4
S 培养基	多种来源		S 培养基由 S 基础溶液（1.46 g NaCl、0.25 g K2HPO4、1.5 g KH2PO4、0.25 ml 5 mg/ml 溶于乙醇的胆固醇，加 H2O 至 250 ml，高压灭菌）组成。向 S 基础溶液中加入 2.5 ml 柠檬酸钾缓冲液（pH 6.0）（将 2 g 一水柠檬酸、29.4 g 一水三柠檬酸三钾, H2O 加至 100 ml，高压灭菌）、2.5 ml 微量金属溶液（1.86 g 乙二胺四乙酸二钠、0.69 g FeSO4 •7 H2O、0.2 g MnCl2•4 H2O、0.29 g ZnSO4 •7 H2O、0.025 g CuSO4 •5 H2O，加 H2O 至 1 L，高压灭菌后避光保存）、0.75 ml 1 M CaCl2 和 0.75 ml 1 M MgSO4。
用于剂量-反应实验的滞育信息素平板	多种来源		在 6 支 15 ml 培养管中，每管加入 0.085 g 贵族琼脂、0.5 ml 0.513 M NaCl 和 5 µl 溶于乙醇的 5 mg/ml 胆固醇。向每管中加入适量粗提信息素，以形成一系列浓度梯度。加 H2O 至总体积为 4.725 ml。  在本生灯上煮沸至琼脂完全溶解，然后冷却至 55 °C。向每管中加入 125 µl 1 M KPO4 缓冲液（pH 6.0）、50 µl 0.1 M CaCl2、50 µl 0.1 M MgSO4 和 50 µl 5 mg/ml 硫酸链霉素。  将每管内容物倒入一个直径为 35 mm 的培养皿中。室温下静置过夜使琼脂凝固（若存放时间更长，应置于密闭容器中以防过度干燥）。
0.1 微米微球珠	Polysciences 公司	00876-15
M9 缓冲液	多种来源		将 3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 ml 1 M MgSO4 溶于 H2O 至 1 升，高压灭菌灭菌