植物组织的串联高压冷冻与快速冷冻置换透射电子显微镜制样技术

摘要

获得高质量的透射电子显微镜图像具有挑战性，尤其是在植物细胞中，因其含有大量充满水的液泡和通气空间。串联的高压冷冻与快速冷冻置换技术可显著缩短植物样品透射电镜制样的时间，同时获得超微结构保存极为良好的样品。

摘要

自20世纪40年代以来，透射电子显微镜（TEM）一直为生物学家提供生物材料的超高清分辨率图像。然而，由于样品制备过程繁琐耗时，且需要丰富的经验以获得无假象的样品，因此TEM被认为并非一种用户友好的技术。传统的TEM样品制备方法使用化学固定剂来保存细胞结构。高压冷冻是指在高压条件下对生物样品进行冷冻固定，从而实现极快的冷却速率，限制冰晶形成——而冰晶的形成会破坏细胞超微结构的完整性。目前，高压冷冻结合冷冻置换是制备用于TEM观察的树脂切片中获得最高质量形态结构的首选方法。这些方法可最大限度地减少传统TEM薄切片处理过程中常见的假象。冷冻固定后，样品中的冰在低温下被液态有机溶剂取代，这一过程称为冷冻置换。冷冻置换通常需要在专用且昂贵的设备中进行数天。最近的一项创新技术可将该过程缩短至三小时，而非通常所需的两天。此后通常还需数天的样品制备步骤，包括渗透和包埋于环氧树脂中，然后进行切片。本文介绍了一种结合高压冷冻与快速冷冻置换的实验方案，可在数小时内完成植物样品的固定。该方案可轻松适用于其他组织或生物体。植物组织尤为特殊，因其含有气腔和充满水的液泡，阻碍了水的无冰冷冻。此外，由于细胞壁的存在限制了化学试剂向组织深层渗透，植物组织的化学固定过程尤其漫长。因此，植物组织的处理极具挑战性，但本方案可靠且能产生最高质量的样品。

引言

我们对细胞超微结构的认识主要来源于电子显微镜技术，该技术能够分辨低至数纳米尺度的细节¹。尽管透射电子显微镜（TEM）具有极高的分辨率，但其操作并不便捷，因为样品制备过程需要耗时且繁琐的步骤，并要求操作者具备一定的专业技术。传统的样品固定方法通常联合使用醛类试剂与四氧化锇，随后进行脱水、树脂包埋和切片，以获得超薄切片，再用重金属染色。然而，已知化学固定可能产生多种假象，包括蛋白质聚集、脂质丢失¹，以及膜结构的改变，最终影响多个细胞区室的形态²。这些假象主要归因于在室温下进行固定和脱水时反应速度较慢^3,4,5。

通过高压冷冻（HPF）实现的冷冻固定可避免化学固定引起的大多数假象。冷冻固定的原理在于，它可使水的冰点降低约20摄氏度，减缓生物样品中冰晶的成核与生长过程，并提高水的黏度，从而使细胞组分基本处于固定状态^{6, 7}。HPF可在毫秒时间内将样品温度降至液氮温度，同时施加极高的压力（210 MPa 或 2,100 bar）。若操作得当，HPF可有效防止形成大冰晶，避免对细胞超微结构造成严重损伤。在典型的生物溶质浓度下，HPF可用于固定厚度达100–200 μm的样品⁷。关于HPF背后的物理机制与基本原理，已有大量综述文献，例如^1,7,8....

方案

注意：QFS 操作程序需要用户格外小心和谨慎，我们在适用的地方将这些安全预防措施突出显示为“警告”和“注意”。

1. 高压冷冻运行的准备工作

1. 开始样品制备前，按照制造商说明开启高压冷冻仪。
   注：本方案中使用的高压冷冻仪（HPF）为 Wohlwend Compact 02 型号（图1A），启动过程大约需要一至一个半小时，之后方可开始高压冷冻操作。
   1. 开启 Wohlwend Compact 02 高压冷冻仪。
      1. 将主开关从“0”拨至“1”，启动仪器。
      2. 向仪器通入压缩空气。
      3. 向仪器通入液氮。
      4. 按下“SYSTEM DRY UP”按钮。
      5. 30 分钟后，再次按下“SYSTEM DRY UP”按钮。
      6. 按下“ON/OFF”按钮，开启仪器。
      7. 按下“NITROGEN”按钮。
      8. 即使“DRIVE IN”按钮已亮起，仍需让仪器继续冷却 20 分钟。
      9. “DRIVE IN”按钮亮起。
      10. 按下“DRIVE IN”按钮。
      11. 按下“AUTO”按钮。
      12. “SYSTEM REA....

结果

以下结果使用Wohlwend Compact 02进行高压冷冻（HPF）获得（图1A）。该仪器的一个主要优势在于其样品载网及其夹持器操作简便。使用其他仪器时，McDonald建议由两名操作者共同完成样品制备和高压冷冻过程，其中一人负责制备样品，另一人同时进行冷冻并将样品转移至FS冷冻管⁹。然而，Wohlwend的样品载网和夹持器设计简便，单个操作者即可独立完成全部操作（图2A、B、E、F和G）。但需指出，在处理珍贵样品前，应先进行数次试运行以熟悉高压冷冻仪器的操作。经验丰富的操作者通常可在一小时内固定多个（10个或以上）样品。然而，本方案中所述原理适用于任何 commercially available 的高压冷冻设备。

HPF-QFS 流程中最关键的步骤可能是将样品装入样品载网前的制备过程（图 2C）。尽管这一点可能并不直观，但这是研究人员在实验流程中最具控制权的环节。高压冷冻（HPF）设备性能稳定，只要正确使用并妥善维护，其压力和温度变化在不同样品间应具有.......

讨论

本方案的成功实施在很大程度上取决于操作者。首先，必须做好充分的前期准备，确保所有必需材料均能及时获得，并具备足够的数量以完成一次完整的高压冷冻-快速冷冻置换（HPF-QFS）实验。其次，操作者必须快速操作，高效地依次执行各个步骤，尽量减少对样品的处理，从而最大限度地减少组织天然状态的改变。样品冷冻后、脱水前，必须始终保持低温状态，因此应特别注意避免任何可能导致样品意外升温的操作，例如使用戴着手套的手而非预冷的镊子进行操作。随着对本方案的熟悉程度提高，操作速度和效率也会相应提升，因此建议在正式处理目标样品前先进行预实验。第三，操作者必须充分意识到冷冻置换介质中所用化学试剂的危害性，以及使用液氮和干冰时存在的风险。制备冷冻置换介质和执行快速冷冻置换（QFS）步骤时必须在通风橱中进行。对于其余所有操作步骤，建议佩戴必要的个人防护装备，包括手套、实验服、封闭式鞋头的鞋子和护目镜。

长期以来，人们已经认识到在制备透射电子显微镜（TEM）样品（包括植物样品）时，使用冷冻固定法而非室温下的化学固定剂具有诸多优势¹⁰。一项比较了通过高压冷冻（HPF）或化学固定剂固定的烟草（<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Wohlwend HPF Compact 02 高压冷冻机	Technotrade International, Inc	HPF02	配备集成示波器，用于显示冷冻和压力曲线；需配备电脑（不含）以显示 冷冻参数
DN 3 × 0.5 mm 铝制样品载具支架	Technotrade International, Inc	290
样品载具，P=1,000，DN 3 × 0.5 铝制，A型	Technotrade International, Inc	241-200
样品载具，P=1,000，DN 3 × 0.5 铝制，B型	Technotrade International, Inc	242-200
20.5 L 储存杜瓦瓶，MVE Millennium 2000 XC20	Chart
酿酒酵母			越陈旧越好，以避免产生过多气体（CO2）
牙签
热电偶数据记录仪 EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	电池需单独购买更换
温度探头	Electron Microscopy Sciences	34505
加热块 12/13 mm
旋转摇床	Fisher Scientific	11-402-10
叶片打孔器 - Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
粉红色牙科蜡	Electron Microscopy Sciences	72660
2 ml 冻存管	Electron Microscopy Sciences	61802-02
甲醇
吹风机
干冰
液氮
丙酮
镊子			若干对