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方法文章

上皮-间质转化过程中可变剪接的检测

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DOI：

10.3791/51845

⸱

2014年10月9日

 ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

已证明可变剪接调控参与上皮-间质转化（EMT），EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍了一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT 过程中可变剪接的方法。

摘要

选择性剪接在上皮-间充质转化（EMT）中发挥关键作用，EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT 过程中选择性剪接的策略，该模型通过表达转录抑制因子 Twist 来诱导 EMT。EMT 的进程通过细胞形态的变化、细胞间连接处 E-钙黏蛋白定位的丧失，以及 EMT 标志物的转换表达来监测，例如上皮标志物 E-钙黏蛋白和 γ-连环蛋白的减少，以及间充质标志物 N-钙黏蛋白和波形蛋白的增加。利用亚型特异性引物组，通过定量 RT-PCR 分析目标 mRNA 的选择性剪接。相应蛋白亚型的产生通过免疫印迹实验进行验证。本文所述的剪接亚型检测方法也适用于其他生物学过程中选择性剪接的研究。

引言

上皮-间充质转化（EMT）是一种发育程序，在胚胎发生过程中驱动器官形态发生和组织重塑。当异常激活时，EMT会促进肿瘤转移和器官纤维化1,2。大量研究描述了转录调控在EMT过程中的重要性，该过程由多个转录因子（如Twist、Snail和ZEB）定义，这些因子抑制黏附连接蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，导致失去类似铺路石样的上皮形态，并获得纺锤形的间充质表型3-8。近期通过全基因组RNA分析的研究揭示，存在一组基因，其剪接模式与上皮或间充质表型相关9,10。我们实验室的工作在功能上将可变剪接与EMT联系起来。通过对细胞表面黏附分子CD44的研究，我们证明CD44的可变剪接在EMT过程中受到严密调控，更重要的是，CD44剪接异构体的转换在因果关系上促进了EMT的发生11。

选择性剪接是一种广泛存在且保守的基因调控模式，多达95%的人类多外显子基因会发生选择性剪接12-14。通过从单个基因产生多种蛋白质产物，选择性剪接构成了蛋白质多样性的关键机制，为人类基因组增添了另一层复杂性。因此，选择性剪接的失调可能引发显著的生物学效应，导致人类疾病的发生。事实上，异常选择性剪接在疾病中的作用已有十余年文献记载15-25，包括最近发现编码剪接体装置的基因突变在骨髓增生异常综合征中普遍存在26-28。因此，开发可靠的方法来检测选择性剪接的异构体，对于研究包括上皮-间质转化（EMT）在内的多种生物学过程具有重要意义。

本文提供了一种利用可诱导的上皮-间质转化（EMT）模型检测选择性剪接变化的实验方案。PCR引物设计及剪接异构体检测方法不仅适用于EMT过程中选择性剪接的研究，也适用于其他生物学过程中选择性剪接的分析。深入研究EMT过程中的选择性剪接对于更好地理解EMT机制及肿瘤转移过程至关重要，有助于推动针对癌症转移的有效治疗策略的开发。

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方案

1. 上皮-间质转化诱导的细胞培养

注意：上皮-间质转化（EMT）可通过TGFβ处理或在上皮细胞中异位表达转录因子Twist、Snail或Zeb1/2来诱导。本方案描述了一种通过在永生化人乳腺上皮细胞（HMLE/Twist-ER，由加州大学圣地亚哥分校J. Yang博士惠赠）中表达Twist-ER融合蛋白实现的可诱导EMT系统9,11,29。经4-羟基他莫昔芬（TAM）处理后，融合蛋白Twist-ER转入细胞核，驱动基因转录，并在12–14天内完成完整的EMT转化过程9,11,29。其他可诱导EMT系统，如HMLE/Snail-ER、HMLE/TGFβ和MCF10A/TGFβ，可参见我们之前的发表文献11,30。

  1. 在含有5% CO2的37 °C培养箱中，将HMLE/Twist-ER细胞培养于无血清的乳腺上皮细胞生长培养基（MEGM）中。当细胞融合度达到80%时，每2-3天传代一次。用0.15%胰蛋白酶在37 °C孵育5-10分钟消化细胞，随后加入5%小牛血清/DMEM终止胰酶反应。离心收集细胞并重悬于MEGM中，按1:4的比例将细胞接种至新的细胞培养皿中。
  2. 将TAM溶于乙醇中配制成200 μM的储存液。避光保存于-20 °C。使用前，将TAM以1:10,000的比例新鲜加入MEGM培养基中，使其终浓度为20 nM。
  3. 为诱导EMT，将1.6 × 106个HMLE/Twist-ER细胞接种至10 cm细胞培养皿中，设两个重复。使用含20 nM TAM的MEGM培养基进行培养。
  4. 将1.6 × 106个HMLE/Twist-ER细胞接种至10 cm培养皿中，设两个重复，并以0.01%乙醇处理作为未加TAM的对照组。
  5. 培养两天后，在10倍物镜下用光学显微镜拍照，记录细胞形态学变化。
  6. 吸除对照组或TAM处理组其中一个培养皿中的培养基，用预冷的PBS洗涤细胞，然后用细胞刮分别将培养皿的一半刮入RNA裂解液中用于RNA提取，另一半刮入RIPA裂解液中用于蛋白质分析。
  7. 将对照组或TAM处理组的细胞进行传代，按1.6 × 106个细胞/皿的比例重新接种至10 cm培养皿中，设两个重复，并持续用20 nM TAM或溶剂对照处理。
  8. 从第2天开始，每隔一天重复步骤5至7，直至第14天。此时，经TAM处理的Twist-ER细胞呈现纺锤形的间充质样形态，而溶剂对照处理的细胞则维持鹅卵石样的上皮形态。

2. EMT 的表征

注意：EMT 的完成由以下几点指示：（1）细胞形态从鹅卵石样的上皮形态转变为纺锤形的成纤维细胞样外观；（2）E-钙黏蛋白在细胞间连接处的定位消失；（3）EMT 标志物的表达发生转换，表现为上皮标志物的丢失和间充质标志物的获得。

在第1节所述的EMT诱导过程中，通过10倍放大倍数的光学显微镜捕捉细胞形态学变化。本节描述了在细胞连接处通过免疫荧光检测E-钙黏蛋白的方法。EMT标志物的表达通过免疫印迹法进行检测。常见的上皮标志物包括E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白和闭合蛋白，而间充质标志物则包括纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白。免疫印迹法的一般操作步骤详见第4节。

  1. 在 TAM 处理的第 12 天，将 1 × 105 个细胞接种到置于 24 孔板孔中的 12 mm 圆形玻璃盖玻片上。
  2. 接种后 48 小时，吸除培养基，并用预热的 PBS 洗涤细胞。
  3. 用预热的 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟。
  4. 用 PBS 洗涤细胞三次。
  5. 在室温下用含 0.2% Triton X-100 的 PBS 孵育细胞 15 分钟。
  6. 用 PBS 洗涤细胞三次。
  7. 在室温下用 5% BSA/PBS 封闭 1 小时，以阻断非特异性结合。
  8. 在湿盒中，于 4 °C 过夜孵育细胞，加入用 1% BSA/PBS 按 1:50 稀释的一抗 E-cadherin。注意：一抗稀释倍数通常在 1:50 至 1:200 之间，每种抗体的最佳稀释度应通过实验确定。
  9. 弃去一抗溶液，并用 PBS 洗涤细胞三次。
  10. 在室温下用 1:500 稀释的荧光标记二抗孵育细胞 1 小时。从本步骤开始，需避免光照。
  11. 弃去二抗溶液，并用 PBS 洗涤三次。
  12. 用 0.1–1 g/ml 的 DAPI 或 Hoechst 染色 10 分钟。
  13. 用 PBS 冲洗细胞三次。
  14. 滴加封片剂将盖玻片封固，并用指甲油密封。
  15. 在 63X 荧光显微镜下观察细胞并采集图像。

可使用其他抗体进行染色以确认EMT表型。例如，可通过染色N-钙黏蛋白和α-平滑肌肌动蛋白来鉴定间充质表型29,31,32。通过用鬼笔环肽对F-肌动蛋白进行染色，可监测细胞骨架结构的重组11。此外，还可进行细胞迁移和细胞死亡抗性检测，以评估EMT的特性11。

3. 使用qRT-PCR检测剪接异构体

  1. 引物设计
    注意：引物对应仔细设计，以扩增不同的剪接异构体。外显子跳跃是最常见的可变剪接事件，此处以此为例说明引物设计策略。图1A展示了一个包含四个外显子的前体mRNA，其中第三个外显子为可变外显子。包含外显子3会生成较长的剪接异构体，而跳过外显子3则产生较短的剪接异构体。需要设计引物以区分包含外显子3和跳过外显子3的异构体，并检测该mRNA的总转录本。
    1. 为检测外显子的包含情况，应在可变外显子3内部设计一条正向引物，在邻近的组成型外显子4内部设计一条反向引物，从而特异性扩增包含可变外显子的异构体。注意不要将正向和反向引物均设计在同一个可变外显子内，以避免从基因组DNA或前体mRNA中扩增出PCR产物。
    2. 为特异性扩增外显子跳跃事件，应设计其中一条引物跨越组成型外显子2与外显子4的连接处，该连接处在外显子3被包含时会被破坏；另一条引物则设计在组成型外显子4内部。这样，只有当可变外显子3被排除，且组成型外显子2与外显子4连接在一起时，才能生成PCR产物。
    3. 为检测该基因的总转录本，应将引物设计在两个组成型外显子1和2内部，从而从所有异构体中扩增出PCR产物。
    4. 确保所有引物的熔解温度（Tm）约为55 °C，每条引物长度约为18–22个核苷酸，PCR产物大小在80至150个碱基对之间。
  2. RNA提取：使用总RNA提取试剂盒（见材料表）提取RNA。
    1. 将细胞收集于350 μl RNA裂解缓冲液中。
    2. 向裂解液中加入350 μl 70%乙醇，并充分混匀。
    3. 将样品转移至RNA纯化柱中。
    4. 在10,000 × g离心1分钟，弃去穿流液。
    5. 用500 μl RNA洗涤缓冲液I洗涤一次，再用RNA洗涤缓冲液II洗涤两次。
    6. 以最大转速离心2分钟，彻底去除残留的RNA洗涤缓冲液II。
    7. 将纯化柱转移至新的1.5 ml离心管中，在柱基质中心加入50 μl无核酸酶水，通过最大转速离心洗脱RNA。
  3. 第一链cDNA合成
    1. 通过紫外吸收测定法确定RNA的浓度和质量。注意：高质量RNA的260 nm / 280 nm吸光度比值应约为2.0。
    2. 设置逆转录（RT）反应体系，总体积为20 μl，包含250 ng总RNA、0.05 μg随机六聚体引物、50 pmol MgCl2、10 pmol dNTP、2 μl 5× GoScript缓冲液和1 μl逆转录酶。
    3. 在42 °C反应1小时，随后在70 °C孵育5分钟以灭活逆转录酶。
  4. 实时PCR
    1. 设置20 μl反应体系，包含10 μl SYBR Green主混合液、0.1–1.0 μl cDNA模板以及各5 pmol的正向和反向引物。
    2. 进行实时PCR扩增，共40个循环，每个循环包括：95 °C变性10秒，58 °C退火10秒，60 °C延伸30秒。每个样本设三个技术重复。
    3. 检查溶解曲线，确保每对引物仅出现单一峰。
    4. 通过计算扩增曲线的二阶导数确定定量循环（Cq）值。
    5. 采用“ΔΔCq法”计算诱导样本中目标mRNA相对于未诱导样本的相对表达量（RQ），公式如下所示。使用GAPDH或TBP等看家基因作为内参。

定量PCR方程；ΔCq、ΔΔCq、RQ公式；基因表达分析方法。
为了更准确地计算剪接异构体的相对值，应考虑使用多个参考基因。结果可采用Pfaffl等人描述的改进型绝对定量方法进行分析et al33,34。

4. 蛋白质水平上剪接异构体的检测

  1. 用 100 μl 冰冷的 RIPA 裂解缓冲液收集细胞。
  2. 将裂解物置于冰上孵育约 10 分钟。
  3. 在 4 °C 条件下，以 14,000 × g 离心 10 分钟，收集上清液。
  4. 采用 Bradford 法测定蛋白浓度。
  5. 将蛋白样品用 SDS 上样缓冲液稀释后，每孔上样 20–40 μg 蛋白至 10% SDS-PAGE 凝胶中。
  6. 以 20 mA 恒流电泳 1.5 小时。
  7. 在 4 °C 条件下，使用湿转系统以 85 V 恒压转膜 3 小时。根据目标蛋白的分子量调整转膜时间。
  8. 用 5% 脱脂奶粉在室温下封闭膜 30 分钟至 1 小时。
  9. 加入一抗，在 4 °C 过夜孵育。一抗的稀释比例通常在 1:200 至 1:5,000 范围内，需通过实验确定每种抗体的最佳稀释比例。本实验方案所用抗体的稀释比例详见“特定试剂与仪器表”。
    1. 若需检测剪接异构体，可使用特异性识别某一特定异构体的抗体；或者使用识别组成型外显子编码区表位的抗体，根据蛋白分子量的差异同时检测多种剪接异构体。
    2. 同时，通过免疫印迹检测 EMT 标志物以监测上皮-间质转化过程。使用 E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白和闭合蛋白作为上皮标志物，纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白作为间质标志物。
  10. 用 TBS-T（50 mM Tris，150 mM NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4）洗涤膜三次，每次间隔 5 分钟。
  11. 加入 HRP 标记的二抗（1:10,000 稀释），室温孵育 1 小时。
  12. 用 TBS-T 洗涤膜三次，每次间隔 5 分钟。
  13. 使用化学发光检测系统显色，并将膜曝光于放射自显影胶片上。

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结果

上述步骤为检测上皮-间质转化（EMT）过程中的可变剪接提供了一种可靠的方法。以下以Twist诱导的EMT过程中CD44剪接异构体转换的代表性结果为例进行说明。

在HMLE/Twist-ER细胞中，由Twist诱导的上皮-间质转化（EMT）表现为从类似铺路石的上皮表型转变为细长的成纤维细胞样表型（图2A），上皮标志物E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白和闭合蛋白消失，同时间充质标志物纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白表达上调（图2B）。此外，通过观察细胞间连接处E-钙黏蛋白定位的丧失来评估EMT的发生（图2C）。

通过qRT-PCR和免疫印迹检测EMT过程中CD44剪接异构体的表达转换。人类CD44基因包含9个可变外显子。CD44的可变剪接使细胞能够产生至少包含一个可变外显子的CD44变异体（CD44v），以及不包含任何可变外显子的CD44标准型（CD44s）。图3A展示了用于检测不同CD44剪接异构体...

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讨论

本文所述方法能够在可诱导的 EMT 模型中检测选择性剪接。因此，可在 EMT 的整个时间过程中捕捉剪接异构体表达的动态变化。该方法相较于使用不同代表上皮或间充质表型的细胞系进行选择性剪接比较具有优势，因为无关细胞系间不同的遗传背景可能对选择性剪接产生非特异性影响。然而，在得出有关选择性剪接变化的结论之前，必须使用多种 EMT 标志物谨慎确认 EMT 是否成功诱导。此外，除本文所述的 Twist-ER 可诱导 EMT 系统外，还建议采用其他 EMT 系统（如 Snail-ER 或 TGFβ 诱导的系统）对实验结果进行验证11,30。

EMT 过程中剪接异构体的转换可在 RNA 和蛋白质水平上检测到。对于蛋白质分析，优先使用剪接异构体特异性抗体。当缺乏异构体特异性抗体时，可通过免疫印迹结合 SDS-PAGE 上的分子量来确定剪接异构体的蛋白质水平。每个异构体的 RNA 水平可通过异构体特异性引物进行定量。利用 qRT-PCR 检测，可灵敏且精确地测定每个异构体的表达倍数变化。特别是当实验材料有限时，例如分析临床样本中特定剪接异构体的表达，qRT-PCR 分析可提供...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢 Wensheng Liu 在细胞成像方面提供的宝贵帮助。本研究得到了以下基金项目的资助： 美国国立卫生研究院（R01 CA182467）、美国癌症协会（RSG-09-252-01-RMC）、林恩·塞奇基金会、姐妹的希望基金会

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-羟基他莫昔芬SigmaH7904将4-羟基他莫昔芬溶于乙醇中配制成200 μM的储存液。溶液于-20 °C避光保存。
E.Z.N.A. 总RNA提取试剂盒Omega Bio-TekR6731总RNA提取试剂盒
GoScript反转录系统PromegaA5001qRT-PCR实验试剂
GoTaq qPCR预混液PromegaA6002qRT-PCR实验试剂
LightCycler 480实时荧光定量PCR系统RocheqRT-PCR实验设备
CD44抗体R&D SystemsBBA101:1,000稀释
E-钙黏蛋白抗体Cell Signaling Technology4065免疫印迹实验中1:2,500稀释；免疫荧光实验中1:50稀释
γ-连环蛋白抗体Cell Signaling Technology23091:1,000稀释
闭合蛋白抗体Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-55621:500稀释
纤维连接蛋白抗体BD Transduction Laboratories6100771:5,000稀释
N-钙黏蛋白抗体BD Transduction Laboratories6109201:2,000稀释
波形蛋白抗体NeoMarkersMS-129-p11:500稀释
GAPDH抗体Millipore CorporationMAB3741:10,000稀释
Amersham ECL化学发光Western印迹检测试剂GE Health Life ScienceRPN2209化学发光检测系统

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定量RT-PCR免疫印迹实验亚型特异性引物EMT标志物CD44剪接亚型Twist可诱导模型他莫昔芬处理细胞形态学分析
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