检测选择性剪接的过程中上皮 - 间质转化

上皮 - 间质转化（EMT）是推动胚胎发育过程中的器官形态和组织重塑一个发展计划。当异常激活，EMT促进肿瘤转移和器官纤维化^1,2。 EMT过程中引人注目的研究已经描述转录调控的重要性，通过几个转录因子，如扭曲，蜗牛和ZEB，这抑制了粘着连接蛋白的E-钙粘蛋白的表达，从而导致cobble-的损失定义石样上皮形态学和纺锤状的间充质表型^3-8的增益。通过RNA的全基因组分析，最近的研究表明，存在一组基因的剪接方式有两种上皮或间质表型^9,10相关联的。从我们的实验室工作功能连接选择性剪接和EMT。通过研究细胞表面粘附分子CD44，我们证明了CD44 ALTERNative剪接EMT过程中紧密调节，并且更重要的是，CD44剪接同种型转换因果有助于EMT ^11。

选择性剪接表示基因调控的一种普遍的和保守的模型，如高达95％的人的多外显子基因可变剪接^12-14。通过从单个基因产生多个蛋白的产品，选择性剪接构成蛋白多样性的重要机制，增加了另一层复杂性，以人类基因组。因此，选择性剪接的失调可能会导致引起人类疾病的深刻的生物学效应。事实上，在疾病的异常剪接都记载了十多年^15-25，其中包括在基因编码的剪接突变机械骨髓增生异常综合征^26-28通常发现最近的调查结果。因此，开发可靠的方法的选择性剪接í检测soforms是在不同的生物过程，包括EMT的研究非常重要的。

在这里，我们提供了一个协议来检测使用可诱导的EMT模型的变化剪接。该方法用于设计PCR引物和检测剪接异构体是合适的，不仅用于选择性剪接的EMT过程中的研究，而且对选择性剪接在其他生物过程的研究。 EMT过程中调查剪接是必须为了更好地理解EMT和肿瘤转移的机制，从而促进有效的策略的开发来治疗癌症转移。

EMT诱导1细胞培养

注：EMT可以通过治疗TGFβ或转录因子扭，蜗牛，或ZEB1 / 2在上皮细胞异常表达所诱导。另外，在本协议是通过扭ER融合蛋白在人永生化乳腺上皮细胞（HMLE /扭ER，J杨博士的礼物，加州大学圣地亚哥分校^）9,11,29表达可诱导的EMT系统。当4-羟基他莫昔（TAM）的治疗中，融合蛋白的扭ER转位到细胞核中以驱动转录并产生一个完整的EMT的过渡在12-14天^9,11,29。额外的EMT诱导系统，如HMLE /蜗牛-ER，HMLE / TGF-β，和MCF10A / TGF-β，可在我们以前的出版物^11,30中找到。

1. 在37℃的培养箱中，用5％的CO ₂保持HMLE /扭ER的细胞在无血清乳腺上皮细胞生长培养基（MEGM）。通过细胞每2-3天，当他们达到80％汇合。孵育的细胞用0.15％胰蛋白酶在37℃下进行5-10分钟，然后失活胰蛋白酶，用5％小牛血清/ DMEM中。降速细胞和悬浮他们MEGM。板的细胞在新的组织培养皿中，在1〜4的比例。
2. 谭溶解在乙醇，使200微米的解决方案。从光存储保护TAM在-20℃。使用前，刚加谭成MEGM媒体在1：10,000稀释，使20纳米谭终浓度。
3. 对于诱导EMT的，板材1.6×10 ⁶ HMLE /扭ER细胞变成10厘米的组织培养皿，一式两份。培养细胞与20纳米含谭MEGM媒体。
4. 板1.6×10 ⁶个HMLE /扭ER细胞分化成一式两份的10cm平皿和治疗的细胞用0.01％的乙醇作为非TAM处理的控制。
5. 孵化两天后，拿在光学显微镜下的照片在放大10倍来记录细胞的形态变化。
6. 从控制或TAM治疗的一盘吸出培养基细胞。由报废一半的板块中的RNA裂解缓冲液中分离RNA并在RIPA缓冲液，另一半用于蛋白质分析洗涤细胞用冷的PBS中，并收获细胞。
7. 传代细胞，从在一式两份的10cm平皿的控制或TAM处理的菜肴由再镀1.6×10 ⁶个细胞。连续处理的细胞用20nM的TAM或车辆。
8. 重复步骤5到7隔日一次，直到第14天，在此期间，TAM处理的扭ER的细胞表现出纺锤形的间充质的形态，而载体处理的对照细胞维持鹅卵石状上皮形态。

EMT的表征2。

注：完成EMT是通过表明：（1）细胞从鹅卵石样上皮细胞形态为梭形纤维母细胞样外观形态变化; （2）E-cadherin的定位在细胞与细胞连接处的损失;的EMT标志物和（3）转换表达式，由损耗定义上皮标记和间质标记物的增益。

细胞的形态变化是通过光学显微镜在EMT诱导的时间过程中放大10倍拍摄的，在本节中描述了第一节免疫荧光检测E-钙粘着蛋白在细胞结的说明。的EMT标志物的表达通过免疫印迹法检测。常见的上皮标记为E-钙粘蛋白，γ-catenin及occludin的，和间质标记物包括纤维连接蛋白，N-钙粘蛋白和波形。免疫印迹法的一般过程在第4节中描述。

1. 谭处理，种子1×10 ⁵细胞在12毫米的玻璃圆形盖玻片置于24孔板的孔的第12天。
2. 播种，吸中，洗涤细胞，预热的PBS后48小时。
3. 固定的细胞用预热的4％多聚甲醛固定15分钟。
4. 用PBS洗涤细胞三次。
5. 孵育的细胞用0.2％的Triton X-100的PBS中的15分在室温。
6. 用PBS洗涤细胞三次。
7. 孵育细胞在5％BSA / PBS进行1小时，在室温到阻断非特异性结合。
8. 孵育细胞与第一抗体的E-钙粘蛋白在1:50稀释1％BSA / PBS在湿盒在o / n 4℃。注：范围为初级抗体的稀释通常是1:50〜1：200，并为每个抗体的最佳稀释度应通过试验确定。
9. 滗出第一抗体并用PBS洗涤细胞三次。
10. 孵育在1细胞用荧光标记的二抗：500稀释为1小时，在室温。从在此步骤中，保护细胞免受光。
11. 滗二次抗体和洗三次，用PBS。
12. 染色的细胞用0.1〜1克/毫升的DAPI或Hoechst的10分钟。
13. 漂洗细胞，用PBS三次。
14. 摩盖玻片用一滴安装介质，并密封盖玻片指甲油。
15. 观察细胞，并采取à63X荧光显微镜下的图像。

用另外的抗体染色，可以执行确认EMT表型。例如，N-cadherin和α-平滑肌肌动蛋白可染的骨髓间充质表型^29,31,32。细胞骨架结构的重组可以通过与鬼笔环肽的F-肌动蛋白¹¹染色细胞进行监控。此外，测定对细胞运动性和细胞死亡的电阻可以被执行以检查EMT ¹¹的属性。

利用定量RT-PCR检测3剪接异构体的检测

1. 引物设计
   注：引物对，应精心设计，放大不同的剪接异构体。外显子跳跃，最常观察到的选择性剪接事件，在此示为一个例子来说明引物设计的策略。 图1A示出了四个外显子的mRNA前体，与所述第三外显子的可变外显子。纳入外显子3的结果生产更长的剪接异构体，而跳过外显子3的产生较短的剪接异构体。引物需要被设计以区分外显子3，包括同种型和外显子3跳过的同种型，并检测该mRNA的总转录物。
   1. 用于检测外显子包含的，精心设计的可变外显子3，并在附近的组成型外显子4的内侧的反向引物内的正向引物，允许可变外显子包含同种型的特异性扩增。确保不设计正向和反向的相同变量的外显子中的引物，以避免从基因组DNA或mRNA前体的PCR扩增产物。
   2. 特异性扩增外显子跳跃事件，设计的横跨构外显子2和外显子4，当可变外显子3被包括，否则将被破坏的交界处的引物之一。设计构成的外显子4，这样里面的另一个引物，PCR产物生成，只有当可变外显子3 exclud埃德和本构外显子2和外显子4随后结合在一起。
   3. 以检测该基因的总转录物，设计中的两个构个外显子1和2的引物，因此，PCR产物是从所有亚型扩增。
   4. 确保熔化温度（Tm）为所有的引物是约55℃时，各引物的长度是约18-22个核苷酸，PCR产物的大小为基础对介于80和150。
2. RNA提取：提取的RNA使用总RNA提取试剂盒（见表材料）。
   1. 收集细胞350μL的RNA裂解液。
   2. 加入350微升70％乙醇的裂解物并充分混合。
   3. 将样品转移到RNA的纯化塔。
   4. 离心机以10,000 xg离心1分钟，丢弃流过。
   5. 用RNA洗涤缓冲液洗二柱曾用500微升的RNA洗涤缓冲液I和的两倍。
   6. 去除残留的RNA洗涤缓冲液II通过离心从在最大速度下的柱2分钟。
   7. 柱转移至新的1.5毫升试管中，加入50μl的无核酸酶的水在柱基质的中心，并通过离心分离以最大速度洗脱RNA。
3. 第一链cDNA的合成
   1. 确定浓度和RNA的质量用紫外吸收测量。注：质量好的RNA应该有大约2.0 260纳米/ 280纳米的吸收率。
   2. 设置逆转录酶（RT）反应包含250ng的总RNA，0.05微克随机六聚体引物，50皮摩尔的MgCl _2，10皮摩尔的dNTP，2微升5×GoScript缓冲液中，加入1μl逆转录酶在20微升的最终体积。
   3. 进行RT反应在42℃进行1小时，接着温育在70℃下5分钟，以灭活逆转录酶。
4. 实时荧光定量PCR
   1. 成立20微升反应，由10微升的SYBR Green预混液，0.1-1.0微升cDNA模板，和5皮摩尔的正向和反向引物。
   2. 运行实时PCR用下列步骤进行40个循环：95℃变性10秒，58℃退火10秒，和60℃延伸30秒。一式三份进行PCR反应。
   3. 检查解离曲线，并确保具有单峰被观测到的每个引物组。
   4. 通过计算扩增曲线的二阶导数的值获得的量化周期（Cq的）值。
   5. 相比，使用“增量增量Cq的（ΔΔCq）'所示的由下述式方法的未诱导的样品计算诱导样品中的靶mRNA的相对量（RQ）。使用管家基因，如GAPDH或TBP，作为参考。

为了更准确地计算剪接异构体的相对值，叔他使​​用多个参考基因应该被考虑。结果，能使用由Pfaffl 等人 ^33,34所述的改性绝对值量化方法进行分析。

在蛋白质水平考试4剪接异构体的

1. 收集细胞在100μl冰冷的RIPA缓冲液。
2. 设置在冰上裂解物为约10分钟。
3. 离心机以14,000 xg离心10分钟，在4℃，并收集上清液。
4. 测定蛋白浓度用Bradford检测。
5. 稀释在SDS上样缓冲液的蛋白质样品并装载20-40微克蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶。
6. 跑SDS-PAGE凝胶在20mA 1.5小时。
7. 根据靶蛋白的分子量转移蛋白至PVDF膜在湿的传送系统，在4℃下进行3小时，在85 V.调整传输时间。
8. 块膜在5％脱脂乳进行30分钟至1小时，在室温下。
9. 孵育膜无线TH一抗，4℃CO / N。的范围为初级抗体的稀释通常是在1：200〜1：5000，确定每个抗体实验的最佳稀释度。在这个协议中使用的抗体的稀释可以在“表特定的试剂和设备”中找到。
   1. 为了检测剪接异构体，使用识别特定亚型的特异性抗体。另外，使用该识别出组成型外显子编码区的抗原决定簇的抗体，同时检测剪接异构体根据其不同的蛋白质的大小。
   2. 在同一时间，通过免疫印迹对EMT标志物监测EMT。使用E-钙粘蛋白，γ-catenin及occludin的上皮标记和纤维连接蛋白，N-钙粘蛋白和波形间充质标记。
10. 洗膜三次，用TBS-T（50毫摩尔Tris，150 mM氯化钠，0.05％吐温20，pH 7.4）中，在5分钟的时间间隔。
11. 孵育膜与HRP偶联的二级蚂蚁ibody以1:10,000稀释为1小时，在室温。
12. 洗膜3次用TBS-T以5分钟的间隔。
13. 可视化蛋白用化学发光检测系统和所述膜暴露于放射自显影胶片。

上述过程提供了一个可靠的方法EMT过程中检测可变剪接。的CD44剪接同种型转换时扭诱导的EMT代表性的结果在下面给出的一个例子。

在HMLE /扭ER细胞扭诱导的EMT的特点是从鹅卵石状上皮细胞表型的细长成纤维细胞表型的转变（ 图2A），无上皮标志物E-钙粘蛋白，γ-catenin和occludin和中上调的间质标记物纤连蛋白，N-钙粘蛋白，波形蛋白（ 图2B）。此外，EMT通过E-钙粘蛋白定位在细胞-细胞连接（ 图2C）的损失评估。

的CD44剪接异构体的EMT过程中的切换表达进行了检查，定量RT-PCR和免疫印迹。人CD44基因包含9个变量外显子。 CD44选择性剪接使得细胞亲达斯CD44的变体（CD44V），包括至少一个可变的外显子，和CD44的标准（CD44s的）即不含所有可变外显子的图3A中示出的引物设计的各种CD44剪接异构体的检测的战略。对于外显子跳跃的产物CD44s的检测中，正向引物位于组成型外显子5，而反向引物跨越构外显子5和6之间的交界处对于CD44V剪接异构体含有V5和V6变量的检测外显子，正向和反向引物的V5和V6内的设计，分别。引物进行检测的其他CD44可变含有外显子 - 异构体可以使用相同的策略进行设计。此外，总的CD44转录物使用正向和反向位于组成型外显子2和外显子3，分别为（ 图3A）的引物进行检测。如图3B所示，定量RT-PCR分析利用这些引物组，表示在光盘显著减少44V mRNA和谭后处理中的扭ER表达HMLE细胞14天增加CD44s的表达。相反，CD44的总转录物的EMT（ 图3C）中保持不变。一致以定量RT-PCR的结果，CD44V的蛋白水平显着下降，而CD44s的蛋白质的表达被大大上调（ 图3D）。因此，CD44的主要同种型，从CD44V在EMT过程转移到CD44s的。

图1引物设计。示意图示出用于检测剪接异构体中的外显子跳跃模式引物的位置。灰色方块代表组成的外显子，橙色框表示可变外显子和细线连接框表示内含子。引物的位置是indicat编按箭头：黑色箭头表示的引物组，用于检测总mRNA，橙色箭头表示引物用于扩增外显子，包括同种型，和蓝色箭头表示引物，用于检测外显子跳跃的异构体。

图2诱导的EMT。 （一）相位对比图像（10X）表示HMLE /扭ER细胞形态学变化之前（未处理）和谭后治疗14天。（二）在HMLE /扭质细胞前EMT标志物免疫印迹分析（未处理）后谭治疗14天。当谭治疗，上皮标记E-钙粘蛋白，γ-catenin及occludin的表达下调，而间质纤维连接蛋白标志物，N-钙粘蛋白和波形蛋白表达上调。（三）免疫荧光图像（63X），表明E-cadherin的损失定位在细胞 - 细胞连接后TAM治疗14天。绿染色表明E-cadherin的，和DAPI染色（蓝色）表示核。比例尺= 10微米。 请点击这里查看该图的放大版本。

图3的EMT过程中切换的CD44剪接异构体。 （一）引物设计的CD44剪接异构体的检测。灰色方块代表组成的外显子，橙色框表示可变外显子和细线连接框表示内含子。引物位置是箭头所示：黑色箭头表示引物，用于检测CD44的总mRNA，橙色箭头表示引物用于扩增CD44v5-6和蓝色箭头表示的引物组对检测CD44s的（B，C）的 CD44同种型的使用引物EMT过程中的水平特异性地检测CD44V含有可变外显子V5和V6（V5 / 6）和CD44s的（B），和CD44的总mRNA的定量RT-PCR分析（C）的 。 mRNA在日间的相对表达水平14细胞进行归一化到对应的第0天的细胞中TAM治疗和非治疗组。误差棒表示SEM; N = 3（四）免疫印迹CD44亚型的过程中HMLE /扭ER细胞谭诱导的EMT分析。 E-钙粘蛋白和N-cadherin蛋白水平进行了监测，以确定EMT的地位。

提交人声明，他们没有竞争的经济利益。