已证明可变剪接调控参与上皮-间质转化（EMT），EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍了一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT 过程中可变剪接的方法。
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本文内容
摘要
摘要
选择性剪接在上皮-间充质转化（EMT）中发挥关键作用，EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT 过程中选择性剪接的策略，该模型通过表达转录抑制因子 Twist 来诱导 EMT。EMT 的进程通过细胞形态的变化、细胞间连接处 E-钙黏蛋白定位的丧失，以及 EMT 标志物的转换表达来监测，例如上皮标志物 E-钙黏蛋白和 γ-连环蛋白的减少，以及间充质标志物 N-钙黏蛋白和波形蛋白的增加。利用亚型特异性引物组，通过定量 RT-PCR 分析目标 mRNA 的选择性剪接。相应蛋白亚型的产生通过免疫印迹实验进行验证。本文所述的剪接亚型检测方法也适用于其他生物学过程中选择性剪接的研究。
引言
上皮-间充质转化（EMT）是一种发育程序，在胚胎发生过程中驱动器官形态发生和组织重塑。当异常激活时，EMT会促进肿瘤转移和器官纤维化1,2。大量研究描述了转录调控在EMT过程中的重要性，该过程由多个转录因子（如Twist、Snail和ZEB）定义，这些因子抑制黏附连接蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，导致失去类似铺路石样的上皮形态，并获得纺锤形的间充质表型3-8。近期通过全基因组RNA分析的研究揭示，存在一组基因，其剪接模式与上皮或间充质表型相关9,10。我们实验室的工作在功能上将可变剪接与EMT联系起来。通过对细胞表面黏附分子CD44的研究，我们证明CD44的可变剪接在EMT过程中受到严密调控，更重要的是，CD44剪接异构体的转换在因果关系上促进了EMT的发生11。
选择性剪接是一种广泛存在且保守的基因调控模式，多达95%的人类多外显子基因会发生选择性剪接12-14。通过从单个基因产生多种蛋白质产物，选择性剪接构成了蛋白质多样性的关键机制，为人类基因组增添了另一层复杂性。因此，选择性剪接的失调可能引发显著的生物学效应，导致人类疾病的发生。事实上，异常选择性剪接在疾病中的作用已有十余年文献记载15-25，包括最近发现编码剪接体装置的基因突变在骨髓增生异常综合征中普遍存在26-28。因此，开发可靠的方法来检测选择....
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方案
1. 上皮-间质转化诱导的细胞培养
注意：上皮-间质转化（EMT）可通过TGFβ处理或在上皮细胞中异位表达转录因子Twist、Snail或Zeb1/2来诱导。本方案描述了一种通过在永生化人乳腺上皮细胞（HMLE/Twist-ER，由加州大学圣地亚哥分校J. Yang博士惠赠）中表达Twist-ER融合蛋白实现的可诱导EMT系统9,11,29。经4-羟基他莫昔芬（TAM）处理后，融合蛋白Twist-ER转入细胞核，驱动基因转录，并在12–14天内完成完整的EMT转化过程9,11,29。其他可诱导EMT系统，如HMLE/Snail-ER、HMLE/TGFβ和MCF10A/TGFβ，可参见我们之前的发表文献11,30。
- 在含有5% CO2的37 °C培养箱中，将HMLE/Twist-ER细胞培养于无血清的乳腺上皮细胞生长培养基（MEGM）中。当细胞融合度达到80%时，每2-3天传代一次。用0.15%胰蛋白酶在37 °C孵育5-10分钟消化细胞，随后加入5%小牛血清/DMEM终止胰酶反应。离心收集细胞并重悬于MEGM中，按1:4的比例将细胞接种至新的细胞培养皿中。
- 将TAM溶于乙醇中配制成200 μM的储存液。避光保存于-20 °C。使用前，将TAM以1:10,000的比例新鲜加入MEGM培养基中，使其终浓度为20 nM。
- 为诱导EM....
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结果
上述步骤为检测上皮-间质转化（EMT）过程中的可变剪接提供了一种可靠的方法。以下以Twist诱导的EMT过程中CD44剪接异构体转换的代表性结果为例进行说明。
在HMLE/Twist-ER细胞中，由Twist诱导的上皮-间质转化（EMT）表现为从类似铺路石的上皮表型转变为细长的成纤维细胞样表型（图2A），上皮标志物E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白和闭合蛋白消失，同时间充质标志物纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白表达上调（图2B）。此外，通过观察细胞间连接处E-钙黏蛋白定位的丧失来评估EMT的发生（图2C）。
通过qRT-PCR和免疫印迹检测EMT过程中CD44剪接异构体的表达转换。人类CD44基因包含9个可变外显子。CD44的可变剪接使细胞能够产生至少包含一个可变外显子的CD44变异体（CD44v），以及不包含任何可变外显子的CD44标准型（CD44s）。图3A展示了用于检测不同CD44剪接异构体.......
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讨论
本文所述方法能够在可诱导的 EMT 模型中检测选择性剪接。因此，可在 EMT 的整个时间过程中捕捉剪接异构体表达的动态变化。该方法相较于使用不同代表上皮或间充质表型的细胞系进行选择性剪接比较具有优势，因为无关细胞系间不同的遗传背景可能对选择性剪接产生非特异性影响。然而，在得出有关选择性剪接变化的结论之前，必须使用多种 EMT 标志物谨慎确认 EMT 是否成功诱导。此外，除本文所述的 Twist-ER 可诱导 EMT 系统外，还建议采用其他 EMT 系统（如 Snail-ER 或 TGFβ 诱导的系统）对实验结果进行验证11,30。
EMT 过程中剪接异构体的转换可在 RNA 和蛋白质水平上检测到。对于蛋白质分析，优先使用剪接异构体特异性抗体。当缺乏异构体特异性抗体时，可通过免疫印迹结合 SDS-PAGE 上的分子量来确定剪接异构体的蛋白质水平。每个异构体的 RNA 水平可通过异构体特异性引物进行定量。利用 qRT-PCR 检测，可灵敏且精确地测定每个异构体的表达倍数变化。特别是当实验材料有限时，例如分析临床样本中特定剪接异构体的表达，qRT-PCR 分析可提供.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢 Wensheng Liu 在细胞成像方面提供的宝贵帮助。本研究得到了以下基金项目的资助： 美国国立卫生研究院（R01 CA182467）、美国癌症协会（RSG-09-252-01-RMC）、林恩·塞奇基金会、姐妹的希望基金会
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | H7904 | 将4-羟基他莫昔芬溶于乙醇中配制成200 μM的储存液。溶液于-20 °C避光保存。 |
| E.Z.N.A. 总RNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | R6731 | 总RNA提取试剂盒 |
| GoScript反转录系统 | Promega | A5001 | qRT-PCR实验试剂 |
| GoTaq qPCR预混液 | Promega | A6002 | qRT-PCR实验试剂 |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR系统 | Roche | qRT-PCR实验设备 | |
| CD44抗体 | R&D Systems | BBA10 | 1:1,000稀释 |
| E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4065 | 免疫印迹实验中1:2,500稀释；免疫荧光实验中1:50稀释 |
| γ-连环蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1,000稀释 |
| 闭合蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500稀释 |
| 纤维连接蛋白抗体 | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5,000稀释 |
| N-钙黏蛋白抗体 | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2,000稀释 |
| 波形蛋白抗体 | NeoMarkers | MS-129-p1 | 1:500稀释 |
| GAPDH抗体 | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10,000稀释 |
| Amersham ECL化学发光Western印迹检测试剂 | GE Health Life Science | RPN2209 | 化学发光检测系统 |
参考文献
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
- Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. De....
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重印与许可
