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无需使用电击网格的小鼠运动耐力评估：一种替代强制运动的方法

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DOI：

10.3791/51846

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2014年8月14日

 ,  , 
1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

本文内容

摘要

介绍了一种在不使用电击网格的情况下评估实验小鼠运动耐力的方法。该方法是一种人道的改进措施，可减少应激对实验参数的混杂影响。

摘要

利用实验室小鼠模型，耐力运动代谢益处背后的分子通路正逐步被阐明。目前评估小鼠运动耐力最常用的方法是使用配备电击网格的机动跑步机进行强迫跑步。当动物停止奔跑时，移动的跑步机传送带会将其推至一个释放电足部刺激的网格上；为逃避这种负面刺激，小鼠会重新回到传送带上奔跑。然而，使用电击装置可能引发回避行为和心理应激，从而干扰跑步耐力的定量评估，并混淆运动后血清激素和细胞因子水平的测量结果。本文中，我们展示并验证了一种改进的方法，可在不使用电击网格的情况下，利用机动跑步机测定未经训练的C57BL/6实验室小鼠的跑步耐力。当小鼠预先适应跑步机环境后，它们会以符合自身步态速度自愿奔跑。本方法以操作者使用压舌板进行轻柔鼓励代替电击刺激，并结合对小鼠自愿奔跑意愿的敏感观察。每只小鼠力竭前的跑步时间具有明确的终点指标，表现为力竭行为特征，如身体呈伸展姿势和呼吸费力等。该方法是一种人道的改进方案，同时可减少应激对实验参数的干扰。

引言

肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病是相互关联的代谢性疾病，对美国及全球人群的健康产生深远影响1-4。耐力运动既可用于预防，也可用于治疗这些疾病5,6。此外，在临床实践中，步速和耐力的评估被用作诊断人体衰弱、肌肉减少症以及其他疾病（如慢性阻塞性肺疾病）后果的检测指标7。

利用基因修饰或药物处理后运动能力增强或减弱的小鼠，研究人员正逐步阐明耐力运动对身体成分和胰岛素敏感性有益作用背后的生化通路8-11。然而，许多此类研究使用配备电击网格的电动跑台来强迫小鼠奔跑8-11。当小鼠停止奔跑时，移动的跑带会将其推至一个通电的网格上，使其足部受到电击；为逃避这种负面刺激，小鼠被迫重新在跑带上奔跑。这类操作可能引入心理应激和回避行为，从而作为混杂因素影响实验参数12。其他评估耐力的方法，例如使用光束中断装置定量测量自主活动，或在笼内转轮上记录跑步情况，也可能受到昼夜节律变化、焦虑、无意中的训练效应或觅食行为的干扰12-16。此外，这些方法通常需要单只饲养，而单笼饲养本身也是小鼠的一种心理应激源。因此，亟需一种不受应激干扰的、对运动耐力的直接测量方法。

为消除这些顾虑，本实验室开发并验证了一种方法，用于评估未经训练、无跑台经验的小鼠在未配备电击网格的电动跑台上的最大跑步能力和持续跑步速度。跑带末端原本安装电击网格的空间，现成为小鼠休息的平台，也为拒绝跑步的小鼠提供一个停留区域，直至被移出装置。实验人员通过轻柔敲击或使用压舌板触碰小鼠，结合对小鼠自主跑步意愿的敏感观察，鼓励其跑步。该方法已用于量化在肌肉来源的细胞因子白细胞介素-15（IL-15）表达水平上存在差异的基因修饰型与对照型C57BL/6小鼠之间运动耐力的不同16,17。该方法是一种人道的改进措施，可减少因使用电击网格引发的负向强化所带来的混杂效应。

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方案

本方案已获美国退伍军人事务部普吉特湾机构动物护理与使用委员会批准，并符合《实验动物护理与使用指南》（ILAR）的要求。

1. 实验准备

  1. 预先确定是否需要在运动后立即采集血液或组织样本；如果需要，应明确采样与运动结束之间的时间间隔。例如，检测运动诱导的激素或细胞因子释放入血液循环（需采集血液），或检测运动诱导的特定mRNA表达水平（需实施安乐死后采集组织）。若需在运动后立即采集血液或组织，应提前将相关操作所需材料准备妥当并置于操作室内。所有操作均须获得机构审查委员会批准，并遵循相关法规指南进行。并非所有实验都需要在运动后采集血液或组织；有时仅需对跑步耐力进行简单比较即可。
  2. 预先确定实验分组及小鼠运动后的处理流程（见上述说明）。
  3. 将跑步机放置在安静房间内专用的稳固台面上，在跑步实验期间该区域仅用于此项操作。
  4. 设置跑步机的跑道宽度以适应小鼠体型，并根据实验方案调整合适的坡度。本实验采用+5o的上坡设置，以避免小鼠在下坡跑动过程中因离心收缩（肌肉在收缩的同时被拉长）而导致肌肉损伤。
  5. 在跑步机传送带下方放置吸水垫，以收集粪便。

2. 小鼠跑步机适应

确定是否需要设置“久坐”（不运动）的小鼠组，并按照步骤 2.1 - 2.5 所述，将久坐组小鼠置于跑轮上但不进行跑步。确定需要设置 2 个还是 4 个实验组，例如， 久坐/运动（2 组）；运动对照/运动处理（2 组，无久坐动物）；或久坐/运动 × 对照/处理（4 组）。其中“处理”可以是转基因或基因敲除基因型、药物干预方案、特殊饮食或其他实验干预措施。

  1. 将小鼠连同其运输用的家鼠笼及笼伴一起置于操作室中，适应环境1至2小时。
  2. 选取单只小鼠，记录耳标编号；称量小鼠体重并记录数值。
  3. 将小鼠放入跑台中，此时不启动电机，使其适应约5分钟。随后接通电源，但不启动跑带，让小鼠再适应仪器运行噪音5分钟。
  4. 此时将“久坐”组（如使用该组；见注释1）的小鼠从跑台上移除，放回鼠笼，或根据实验设计进行后续处理（见注释2）。

3. 开始力竭跑测试

  1. 适应结束后，当动物在跑带上活动且未处于平台时，将跑带速度调至较低速度（10 m/min）。
  2. 对于不愿持续跑步的动物，使用压舌板轻轻敲击或抬起其后肢1至3次，以鼓励其留在跑台上继续奔跑。
    注意：大多数小鼠会 readily 跑步，但有时会短暂停止。当发生这种情况时，可用压舌板轻轻敲击或抬起动物后部，促使其恢复跑步。通常情况下，小鼠无需实际接触压舌板；仅当它们注意到手持压舌板靠近时，便会继续奔跑。
  3. 当小鼠以初始速度10 m/min跑步时，启动实验室计时器。
  4. 当小鼠位于跑带顶端（上坡端）时，以约每2分钟增加1 m/min的速度，逐步缓慢提高跑速。
  5. 如果小鼠出现反复短时冲刺而无法保持稳定节奏的情况，应将速度调回之前的设定值。
  6. 通过调节速度并观察小鼠表现，确定每只小鼠的最大可持续跑步速度（通常C57BL/6小鼠为14–17 m/min），并记录该速度。
    注意：小鼠在跑台上的位置可为研究者提供其是否愿意以更高速度跑步的提示。若小鼠位于最远端（上坡端）并即将触碰到墙壁，表明其已准备好以更高速度跑步；若小鼠在跑台中部以稳定速度奔跑，则可能已达到其最大速度，或需根据跑步质量进一步调整速度。

4. 终点指标与停止实验的小鼠

  1. 使用压舌板轻轻敲击或抬起停止运动动物的后肢，以鼓励其恢复跑步（参见注释3.2）。对于跑步过程中的短暂中断，不要停止计时器。
  2. 识别并移除拒绝跑步的小鼠。在数据表上记录此情况。根据实验设计，可于另一天重新测试拒绝跑步的小鼠。
    注：部分小鼠会完全拒绝跑步。这类小鼠仅能短时间奔跑，随后停止并进行理毛或“踩踏”动作，即坐在跑台上，以前肢在传送带上移动。这些小鼠呈弓背姿势，四肢紧贴身体下方，以防止被压舌板推回至跑台上。偶尔有小鼠在不愿跑步时对压舌板表现出攻击性，如啃咬压舌板或沿其攀爬以试图逃离。在试验开始后的前5 min 内，即可明确该小鼠是否愿意跑步。将拒绝跑步的小鼠从分析中剔除，但不得将其归类为“久坐”小鼠。
  3. 识别力竭小鼠并停止计时。
    注：力竭的判定标准为连续三次停止跑步，且在轻柔刺激下仍拒绝继续跑步，同时伴有呼吸困难、四肢外展等体力耗竭的体征。小鼠通常在30至60分钟内从力竭状态恢复。
  4. 记录在所有速度下跑步的总时间。
  5. 根据实验设计，将小鼠放回笼中，或按照机构指南立即进行运动后操作，如采集血液或组织样本。
  6. 每只小鼠测试结束后，使用杀菌湿巾清洁传送带，以避免前一只小鼠的气味影响后续测试小鼠的行为。
  7. 测试下一只小鼠。每只小鼠均应使用新的压舌板。同笼饲养的小鼠可在同一天内依次测试，无需额外适应实验环境。

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结果

该运动耐力测定方法能够准确反映在细胞因子IL-15表达水平上存在差异的C57BL/6小鼠不同品系的分子与代谢特征16,17。与同窝对照小鼠相比，过表达IL-15的转基因小鼠（IL-15 TG小鼠）在力竭前的跑步时间显著延长；而缺乏IL-15的小鼠（IL-15 KO小鼠）在达到力竭前的跑步时间则显著缩短（图1A）。已有研究报道，IL-15 TG小鼠的肌肉向更具氧化性的表型转变16；相反，IL-15 KO小鼠的肌肉则向氧化性较低的表型转变17。这些肌肉表型变化与在光束中断装置中测得的自发性体力活动水平，以及通过自主跑步至力竭实验测得的运动耐力具有相关性。来自两个不同来源（本单位饲养种群与商业供应商）的野生型对照C57BL/6小鼠在跑步时间上无显著差异（图1A）。

仅在IL-15基因敲除小鼠中观察到最大持续跑步速度的差异（图1B）。跑步距离（未显示）也可进行计算和统计分析；然而，将两个参数（力竭时间与速度）分开分析可获得更...

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讨论

本文介绍一种在实验室小鼠中评估自主跑步耐力的方法，该方法使用电动跑步机且无需电击网格。此方法能够揭示在白细胞介素-15（IL-15）表达水平不同的C57BL/6小鼠亚系之间存在的差异，而这种差异继而导致影响运动耐力的相关因子表达水平的不同16,17。依据实验动物科学中的“3R原则”，该方法可作为使用电击网格的强制运动实验方案的一种更为人道的替代方法或优化改进8-11。强制运动还可能引入心理应激和回避行为等混杂因素，从而影响跑步参数以及运动后指标（如血清细胞因子和激素）的测定结果12。

该技术的一个局限性在于，持续最大跑步速度的确定、拒绝跑步的行为以及力竭终点的判断均依赖于观察者的主观评估。然而，大多数年轻小鼠在缓慢适应仪器后会自愿跑步；此外，小鼠在跑步后通常会表现出明确的拒绝继续跑步和达到力竭状态的行为特征。尽管如此，成功实施该技术仍要求观察者对动物状态具有一定的敏感性。因此，建议在一项研究中的所有力竭跑步测试均由同一名观察者完成，且最好由对处理分组设盲的观察者执行，以尽量减少在判断这些参数时引入观察者偏倚。尽管跑步...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

由美国退伍军人事务部资助（项目号 BX001026，LSQ），并依托于 VA Puget Sound 医疗保健系统提供的资源与设施、华盛顿大学 Nathan Shock 衰老基础生物学卓越中心转基因资源核心（NIA #5P30AG-013280）以及华盛顿大学糖尿病内分泌学研究中心（NIH #P30 DK-17047）。我们感谢 VA Puget Sound 的 Cynthia Pekow 兽医学博士和 Kari L. Koszdin 兽医学博士对本文稿提出的宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
开放式啮齿类动物跑步机 Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RM此目录编号适用于无电击网格的型号。旧型号（Eco 3/6）的电击网格可手动移除。
Sani Cloth 杀菌擦拭巾PDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NY通常通过本地机构订购含 10% 异丙醇；可使用任何等效产品。
压舌板任何本地供应商
实验室计时器任何供应商
IL-15 TG 小鼠*JAX, Bar Harbor, ME011002小鼠 IL-15 转基因由修饰后的人α-骨骼肌动蛋白启动子驱动表达，并改变信号序列以促进分泌。
C57BL/6J 小鼠（野生型）*JAX, Bar Harbor, ME000664IL-15 TG 小鼠的对照小鼠
IL-15 KO 小鼠*Taconic Farms, Germantown, NY4269-M在 C57BL/6 背景上的纯合 IL-15 "基因敲除" 小鼠
C57BL/6NTac（野生型）*Taconic Farms, Germantown, NYB6-MIL-15 KO 小鼠的对照小鼠
*可选；小鼠品系及处理方式可根据实验方案具体设定。

参考文献

  1. Hill, J. A., Wyatt, H. R., Reed, G. W., Peters, J. C. Obesity and the environment: where do we go from here? Science. 299 (5608), 853-855 (2003).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (7121), 875-880 (2006).
  4. Pischon, T., Nothlings, U., Boeing, H. Obesity and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 67 (2), 128-145 (2008).
  5. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1α-mediated regulation of gene expression and metabolism: Implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).
  6. Handschin, C., Spiegelman, B. M. The role of exercise and PGC1alpha in inflammation and chronic disease. Nature. 454 (7203), 463-469 (2008).
  7. Vasunilashorn, S., et al. Use of the Short Physical Performance Battery score to predict loss of ability to walk 400 meters: analysis from the InCHIANTI study. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (2), 223-229 (2009).
  8. Wang, Y. X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARδ. PLoS Bio. 2 (10), e294(2004).
  9. LeBrasseur, N. K., et al. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and metabolic outcomes in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (9), 940-948 (2009).
  10. Burch, N., et al. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle. PLoS ONE. 5 (6), e10970(2010).
  11. Li, L., et al. Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) deacetylation by physical activity. Diabetes. 60 (1), 157-167 (2011).
  12. Knab, A. M., et al. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol. & Behavior. 98 (4), 433-440 (2009).
  13. He, Y., et al. IL-15 Receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic behavior. J. Mol. Neurosci. 41 (2), 315-321 (2010).
  14. Wu, X., Hsuchou, H., Kastin, A. J., Rood, J. C., Pan, W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav. Immun. 24 (8), 1340-1346 (2010).
  15. Pistilli, E. E., et al. Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. J. Clin. Invest. 121 (8), 3120-3132 (2011).
  16. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T. W. IL-15 overexpression promotes endurance, oxidative energy metabolism, and muscle PPARδ, SIRT1, PGC-1α, and PGC-1β expression in male mice. Endocrinology. 154 (1), 232-245 (2013).
  17. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T., Marcell, T. J. IL-15 is required for post-exercise induction of the pro-oxidative mediators PPARdelta and SIRT1. Endocrinology. , (2013).
  18. Ward, J. M., Anver, M. R., Mahler, J. F., Devor-Henneman, D. E. Chapter 13, Pathology of mice commonly used in genetic engineering (C57BL/6; 129; B6,129; and FVB/N). The Pathology of Genetically Engineered Mice. Ward, J. M., Mahler, J. F., Maronpot, R. R., Sundberg, J. P. , Iowa State University Press. Ames, IA, Chapter. 161-179 (2000).
  19. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (12), 2053-2057 (2001).
  20. Turner, M. J., Kleeberger, S. R., Lightfoot, J. T. Influence of genetic background on daily running-wheel activity differs with aging. Physiol. Genomics. 22 (1), 76-85 (2005).
  21. Haight, T. J., van der Laan, M. J., Manini, T., Tager, I. B. Direct effects of leisure-time physical activity on walking speed. J. Nutr. Health Aging. 17 (8), 666-673 (2013).
  22. Studenski, S. Gait speed and survival in older adults. JAMA. 305 (1), 50-58 (2011).
  23. Jacobsen, K. R., Kalliokoski, O., Teilmann, A. C., Hau, J., Abelson, K. S. The effect of isoflurane anaesthesia and vasectomy on circulating corticosterone and ACTH in BALB/c mice. Gen. Comp. Endocrinol. 179 (3), 406-413 (2012).
  24. Sellers, T. L., Jaussi, A. W., Yang, H. T., Heninger, R. W., Winder, W. W. Effect of the exercise-induced increase in glucocorticoids on endurance in the rat. J. Appl. Physiol. 65 (1), 173-178 (1988).
  25. Cook, M. D., et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis. Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).

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