一种向多条斑马鱼（Danio rerio）给药的新方法及其戒断反应的量化

摘要

介绍了一种减少鱼类药物暴露过程中变异性的新方法。在明暗穿梭避暗实验中，暴露于不同乙醇暴露模式的鱼类在戒断期间表现出焦虑水平的改变。

摘要

斑马鱼的焦虑测试通常与药理学物质的应用相结合进行研究。在这些研究中，鱼类通常需要从家庭水族箱中用网捞出，并在不同给药水箱之间转运。为了提高化合物给药的便利性，我们开发了一种新的鱼类转移方法用于药物给药。该方法利用专为产卵设计的插入装置，将整组鱼类转移至药物溶液中，从而实现对群体中所有个体的精确给药。这种方法提高了给药的精确性和效率，尤其在需要长期重复给药的实验方案中显得尤为重要。我们已在一项研究中应用了该操作流程，用于检测在不同21天给药周期下，乙醇给药后斑马鱼在明暗箱实验中的行为变化。结果显示，在每日适量饮酒暴露的鱼类中，停药2天后其位置偏好与对照组相比存在显著差异；然而，在每周一次性大量饮酒（暴饮）暴露的组别中，未观察到位置偏好的显著差异。

该方案可推广应用于所有水溶性化合物，并可在需要检测鱼类在长期给药期间或之后行为变化的任何情况下使用。明暗测试也是评估戒断引起焦虑变化的有效方法。

引言

斑马鱼（Danio rerio）是一种原产于印度的小型硬骨鱼类，是行为学¹和医学研究^2,3中常用的一种模式生物。斑马鱼也常用于测试多种药理学物质，以表征这些物质对行为的影响。已有研究采用不同的剂量和给药方案，考察了兴奋剂⁴、抗焦虑药物⁵和乙醇^6-8等化合物对斑马鱼行为的影响。

本实验室研究了不同乙醇给药方案对斑马鱼在经过充分验证的明暗实验（light/dark assay）^9,20 中焦虑行为和运动活性的影响，该实验也常被称为趋暗实验（scototaxic assay）。我们开发了一种新的乙醇给药方法，以提高长期（21天）重复性每日给药的效率⁶。以往的方法虽具可行性，但我们希望开发一种能减少捞网操作及其相关时间成本，并可同时、精确控制大量斑马鱼给药时间的新方法。在传统的乙醇研究中，斑马鱼通常通过捞网从一个水箱转移至另一个含有特定浓度乙醇与水混合液的水箱^10-12。尽管该方法被广泛接受，但捞网操作可能导致每次将鱼放入和取出药物溶液所需时间存在差异，从而在重复给药实验过程中造成实际药物暴露时间的不一致。因此，减少因转运时间变异所导致误差的方法具有重要意义。采用我们的方法，可实现所有斑马鱼的同时转移，确保每条鱼的给药时间完全一致。在完成乙醇暴露（如本文所述）后，可对斑马....

方案

所有实验操作和行为学测试均经麦克文大学动物研究伦理委员会根据协议编号06-11-12批准，该协议符合加拿大实验动物护理委员会关于实验动物护理与使用的指南。

1. 准备给药罐、溶液及给药方案

1. 制定给药时间表，确保动物在相同环境和每天的同一时间进行给药，以避免时间因素或视觉刺激带来的干扰。
2. 根据实验分组数量，准备足够数量的相同规格、1.5 L透明聚丙烯产卵缸。每缸放置8条鱼，以便后续实验中每天可同时测试两组鱼（见步骤3）。每组需配备一个暂养缸和一个给药缸（共需缸数为组数的两倍）。
   1. 在所有暂养缸中放置400 µm产卵隔板。使用栖息地用水或反渗透水将水箱注满，并调节至适宜温度（对于斑马鱼，为25–28 °C），该温度应与鱼类常规饲养温度保持一致。
      注意：某些药物可能与缓冲型栖息地用水中的化学成分发生不良相互作用。在此情况下，药物处理组及对照组均应使用反渗透水，并添加极少或不添加水族盐进行缓冲。
   2. 确保水箱处于中性环境中，以避免在给药期间鱼类对外部视觉刺激产生条件化反应。
3. 配制药物溶液。将适量药物与栖息地用水混合于产卵缸中。配制0.2%乙醇溶液：取3 ml高纯度乙醇（95%非变性乙醇）与1,497 ml水混合。配制1.4%乙醇溶液：取21 ml乙醇与1,479 ml水混合。

结果

为了在斑马鱼药理学研究中保持准确性和可控性，必须如上所述一致且准确地控制乙醇给药的持续时间。我们的实验流程可提高给药操作的便捷性和通量。无论是采用每周一次的暴饮模式还是每日适量给药模式，与对照组相比，斑马鱼的焦虑水平均发生了改变，该结果通过明暗箱实验进行测定。在末次给药后两天进行测试时，对照组斑马鱼（未接受酒精处理，但仍被转移至给药用鱼缸）表现出预期的行为模式，即对照组鱼在实验装置的暗区停留时间显著更长（图2A），这与以往其他研究中未经处理的斑马鱼行为相似^6,9,13。每周暴饮组的斑马鱼在末次乙醇给药两天后进行测试时，对明区或暗区均无明显偏好（图2B）。有趣的是，每日适量组的斑马鱼则显著偏好实验装置的明区（图2C），这与对照组形成鲜明对比。偏好指数显示，对照组与每日适量组之间存在显著差异（图2D）。各组之间在游泳速度或静止时间上均无显著差异（表1），因此，该效应并非由斑马鱼运动功能障碍所致。

讨论

先前涉及斑马鱼给药的研究仅依赖使用网具将鱼从饲养缸中捞出并转移至药物溶液中^12,16。然而，使用网具操作并不总是稳定，且常因斑马鱼的逃避反应而耗时超出预期，而这种逃避反应在个体间存在显著差异。传统的转移方法虽然有一定用途，但仍有改进空间，例如可减少鱼类离水的总时间，并降低不同个体间转移时间的变异性。除了提升操作的实用性外，本方法还使研究人员能够在溶液中同时对大量鱼类进行精确时长的给药。以往的方法要么只能对单条鱼进行给药，要么需尝试同时用网捕捞整群鱼。前者效率低下，降低了通量；而后者操作笨拙且困难。此外，能够同时评估多条鱼行为的运动追踪系统也可从本方法的精确性中获益。鱼类可直接从产卵插槽转移至群游实验区域，从而确保所有个体几乎在同一时间进入该区域并暴露于实验环境中。

在为期21天的时间内，对三组斑马鱼实施这一新方法后获得了显著结果。对照组鱼类未接受酒精，每日适量组鱼类每天接受一次少量酒精，而每周暴饮组鱼类在21天期间每周接受一次大剂量酒精。在明/暗任务中，给药程序并未改变对照条件下斑马鱼对暗区的正常偏好。然而，在乙醇戒断2天后，每日适量组的斑马鱼更偏好实验区域的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三层台式饲养系统	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L 产卵缸，配备 400 μm 挡板	Aquatic Habitats	N/A
纯谷物乙醇	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT 运动轨迹追踪软件	Noldus Information Technology
移液器	Eppendorf Canada
明暗行为箱	定制		根据操作说明构建，尺寸为 9.5 cm 宽、9.5 cm 深、55 cm 长。