通用手持式三维光声成像探头用于深部组织人体血管造影及实时功能学临床前研究

摘要

本文提供了使用新开发的手持式光声（光电声）系统进行三维功能和分子实时成像的实验方案的详细描述。该系统展现出的强大性能和多功能性，可能为光声技术在临床前研究和临床实践中的应用开辟新的领域。

摘要

光学对比度高且空间分辨率优异的独有结合，使光声成像（光声学）成为在深层光学不透明组织中同时获取解剖学、功能性和分子对比度的理想方法。尽管光声成像在小动物研究中的巨大潜力已得到近期充分展示，科研界也在大力推动该成像技术向临床应用的转化。本文介绍了一种新开发的光声断层成像方法，能够实时提供具有高分辨率和丰富光谱信息的组织形态与功能三维图像。文中详细描述了该成像系统在手持式和固定式两种模式下的实验操作流程，并针对小鼠模型及人体中的功能与分子研究的不同潜在应用场景进行了演示。这种新方法具备三维实时可视化能力，加之成像探头设计灵活、便于手持操作，使其在当前用于临床前研究和临床实践的众多成像模态中独树一帜。

引言

光声成像技术因其独特的技术优势，在生物和医学研究领域正受到日益增长的关注，这体现在相关出版物数量持续增加，涵盖了利用该技术各种新应用的研究^1-5。特别是，该技术能够在远超光扩散极限的深度上，以高时空分辨率对具有光谱特异性的光吸收剂进行成像，从而为功能成像和分子成像开辟了前所未有的能力^6-10。

事实上，光声技术向临床实践的转化在多种疾病的诊断和治疗监测方面展现出广阔的应用前景。然而，光子在光学散射和吸收性组织中的传播深度有限，以及光声效应本身通常较弱的信号响应，限制了该方法的适用成像深度。因此，研究人员已尝试使用手持式光声探头对体表可接触部位进行成像^11,12，而内窥镜系统则通过自然腔道插入体内，实现对内部结构的成像¹³。一些光学吸收较低的人体部位，例如女性乳腺，也可通过断层光声扫描仪进行成像^14,15。其中，手持式成像方式尤其受到关注，因其具备高度的灵活性，类似于超声成像。然而，将常见的超声线性阵列探头改造用于光声成像仍面临挑战，主要原因是超声与光声在断层成像需求方面存在根本差异。标准超声成像通过千赫兹范围内的高脉冲重复频率，采用逐次发射-接收方案实现高帧率成像；而实时三维光声成像则依赖单次激光脉冲激发后同步采集三维断层数据。因此，高质量的光声成像意味着需从尽可能大的立体角范围内获取被成像物体的三维数据。

最近，我们推出了首款用于实时三维（容积）成像的手持式光声探头¹⁶。该系统基于一个由256个压电元件组成的二维阵列，这些元件排列在一个球形表面（图 1A中的蓝色点），覆盖90°的角度。单个元件的尺寸约为3 × 3 mm²，其取向和频率带宽（约2–6 MHz）可确保有效采集来自球心周围厘米级体积的信号（图 1A中的黑色立方体）。成像区域的光学激发通过插入阵列中央圆柱形腔的光纤束实现，因此任何可通过光纤束传输的波长均可用于成像。实际的换能器阵列连同光纤束的照片如图 1B所示。高效的激发与信号的同步检测使得单次激发（单个激光脉冲）即可实现深层组织成像，结合图形处理器（GPU）实现的重建算法，还可进一步实现由激光脉冲重复频率决定帧率的实时成像¹⁷。一个带有透明聚乙烯膜的圆柱形外壳（图 1C）被连接到换能器阵列上，用于容纳声学透射液体介质（水）。该膜通过声耦合凝胶进一步与组织连接。手持操作模式下使用的光声探头实物图如图 1D所示。

所展示的三维手持式光声成像技术结合实时功能成像能力，在临床诊断中具有重要优势，并有望应用于多种疾病指征，如外周血管疾病、淋巴系统疾病、乳腺癌、皮肤病变、炎症或关节炎¹⁸。此外，其快速成像能力使得在探头保持静止位置的情况下仍可实现动态生物过程的可视化。结合快速波长调谐的光学参量振荡器（OPO）激光技术，该方法可实现对光吸收剂体内分布的实时成像。因此，在小动物成像应用中也可能产生新的可能性，e.g.，用于研究组织血流动力学、in vivo细胞追踪、药代动力学可视化、器官灌注、肿瘤及心血管系统的靶向分子成像，或神经成像。

本研究详细描述了使用球形阵列光声手持探头的实验成像方案，并展示了其在多种典型临床及小动物成像场景中的性能表现。

方案

以下详细描述了使用容积式手持光声探头的操作步骤。本操作根据批准的机构规定进行，涉及动物和人体实验。

1. 系统准备

1. 在操作前，开启激光器并预热约15 分钟，以稳定输出光束。
2. 放置装有隔离膜的水封部件，使隔离膜与皮肤接触（图1）。
   注意：隔离膜（与皮肤接触）与换能器最敏感区域（球形探头中心）之间的距离决定了有效成像深度。
3. 通过泵将去离子水注入隔离膜与换能器表面之间的整个容积（约100 ml），直至充满。
4. 确保无漏水现象且无气泡存在。或者，可通过使水循环流动以避免产生气泡。
5. 在室温下进行实验，并确保耦合介质（水）保持在此温度。

2. 成像准备

1. 人体成像准备。
2. 使用脱毛膏去除待成像区域的毛发，以避免图像中出现不必要的背景干扰（此步骤为可选）。
3. 在待成像区域周围的皮肤上涂抹超声耦合凝胶，以实现有效的声学耦合。将光声探头置于目标区域。确保超声耦合凝胶中无气泡存在。
4. 动物成像准备。
5. 确保动物护理和实验操作符合机构和政府的相关法规与规定。
6. 使用剃毛膏去除动物待成像区域的毛发。使用兽用眼膏保护动物眼睛，防止因暴露于高强度脉冲激光辐射下而导致的眼部干燥和损伤。
7. 实验前通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮/赛拉嗪（100 mg/kg KG 氯胺酮 + 5 mg/kg KG 赛拉嗪）对动物进行麻醉，或在实验过程中使用异氟烷麻醉（2–3 %（体积分数），气体流速0.9 l/min）。通过检查动物后肢反射确认麻醉效果。
8. 在待成像区域周围的皮肤上涂抹超声耦合凝胶，以实现有效的声学耦合，并将光声探头置于目标区域。确保超声耦合凝胶中无气泡存在。

3. 预览操作模式

1. 将成像波长设定在 690 nm 至 900 nm 之间，脉冲重复频率设定在 10 至 50 Hz 之间。选择声学数据采集系统的参数——输入阻抗为 1 MΩ。对每个激光脉冲以每秒 40 兆采样点的采样率采集 2030 个样本，垂直分辨率为 12 位。使用激光器的 Q 开关输出信号触发采集。
2. 确保操作人员和受试者均佩戴适用于光学激发波长的防护护目镜。调节激光功率，使在实验过程中组织表面的光注量保持在近红外波长下低于 20 mJ/cm²，以满足人体实验的安全暴露限值¹⁹，并防止动物实验中产生热应变和皮肤损伤。
3. 启动预览软件，采用基于 GPU 的图像处理算法实现方案，以实现实时三维图像可视化，其帧率与激光脉冲重复频率相对应。
4. 移动探头和/或待成像物体，以优化成像效果并准确定位感兴趣结构。

4. 数据采集

1. 扫描（手持）模式下的数据采集。
2. 必要时，可在采集前注射对比剂以增强感兴趣区域的对比度。
   注意：在我们的实验中，尚未进行增强对比的人体成像。然而，多种对比剂可潜在地用于此目的。吲哚菁绿（Indocyanine Green, ICG）即为一种经临床批准的光学对比剂，可在成人中以每公斤体重最大推荐剂量2 mg的剂量用于对比增强。
3. 启动数据采集硬件，参数设置参照3.1节，并保持预览软件持续运行。轻柔移动探头，扫描成像区域，以追踪目标结构。
   注意：当同时采集多个激光波长的图像时，在手持模式下探头的移动速度必须显著降低（最好低于 2 毫米/秒，对应激光脉冲重复频率为50 Hz）以避免光谱解混图像中出现与运动相关的伪影。
4. 静止模式下的数据采集
5. 安装已成像的样品（例如将动物和手持探头放置于支架上，使用3.1节所述参数开始采集，同时保持预览软件的运行。
6. 实验过程中保持光声探头与成像部分位置不变，以观察感兴趣区域内的动态生物事件。
7. 注射造影剂以追踪其在目标区域的动态分布。
   注意：在我们的小鼠实验中，使用吲哚菁绿（ICG）进行对比度增强。一般建议，为在多光谱光声成像中产生可检测的对比信号，需向小鼠体内注入10 nmol或0.4 mg/kg剂量的ICG。 在 体内.
   注意：对比剂必须获得相关监管机构对人和/或动物使用的批准。

5. 完成实验

1. 停止激光照射。
2. 将光声探头从成像区域移开。进行动物实验时，停止麻醉供气。
3. 将动物置于红外加热灯下以保持体温，并在动物完全从麻醉中恢复之前避免其与其他动物接触。在动物恢复期间不得无人看管。

6. 离线数据处理

1. 在用于数据处理的软件应用程序中加载包含采集到的光声信号的文件。
2. 使用重建算法，获得与每帧和每个波长对应的光学吸收三维体积图像相对应的三维矩阵数组。
   注意：为获得更定量的吸收能量分布表征，在重建过程中优选使用能够考虑成像物体中各种畸变因素的算法，例如组织异质性与衰减、探测元件的有限带宽和几何形状效应，以及光通量变化等。
3. 使用解混算法，从每个多波长帧中获得一组新的三维矩阵数组，用以分别表示样品中各吸收物质的光学吸收分布。
4. 如有需要，可进一步处理代表光学吸收分布的三维矩阵数组，以利于生物相关参数的可视化与读取。

结果

本节展示了代表性结果，以演示所述体积式手持光声探头的性能。在所有情况下，皮肤表面的光通量均保持在20 mJ/cm^{2 19}的安全暴露限值以下。

探针在实时追踪人体外周血管系统方面的性能展示于图2中。在本实验过程中，探针以800 nm的单一波长在一名健康志愿者的手部缓慢扫描，激光器以每秒10个脉冲的频率工作¹⁷，从而实现对所有扫描位置下血管结构的实时可视化。在三个方向上重建图像的代表性最大强度投影（MIP）如图2所示。通过采用GPU实现的滤波反投影算法¹⁷，可在测量过程中实现实时可视化。

实时多光谱成像能力在图3中得到展示。具体而言，测量是通过对一名健康志愿者手腕部位进行探头扫描完成的，该区域包含不同尺寸和氧饱和度水平的血管，以及富含黑色素的皮肤色素沉着¹⁰。本实验采用重复频率为50 Hz、可在每脉冲基础上调谐波长的激光器...

讨论

光声成像技术在小动物研究中所展现出的独特优势，已极大地推动了该技术向临床应用的转化，许多诊断和治疗监测应用前景被广泛期待，例如在乳腺癌、皮肤癌、炎症或外周血管疾病等领域。e.g., 在乳腺和皮肤癌、炎症或外周血管疾病中。然而，与小鼠或其他体型更小的动物不同，人类体型较大，且光穿透深度有限，难以像在小动物上那样通过环绕布置足够数量的光源和探测元件来构建有效的断层成像采集几何结构，因此难以实现类似于磁共振成像（MRI）或计算机断层扫描（CT）的全身光声断层成像。本文介绍的手持式光声成像探头非常适合人体成像，因其具备超声成像的诸多优点，如便携使用、高分辨率、非电离激发以及实时成像能力。然而，光声成像的最优硬件设计和图像重建方法与常规超声扫描仪中常用的方法存在显著差异。这主要是由于两种成像模式在基本工作特性上的根本区别，例如脉冲重复频率、所检测超声信号的幅度、底层信号激发机制以及相应的图像重建方法。特别是，光声成像本质上是一种三维成像模式，原则上仅需一次激光脉冲激发，即可从被成像物体获取完整的三维断层数据集，本研究也已对此进行了验证。此外，将该探头改造为可同时提供超声图像的功能是可行的，这也将成为我们未来研究计划中的一个重要方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基于光学参量振荡器（OPO）的激光器	Innolas Laser GmbH, Krailling (德国)	定制	该激光器提供脉宽约为10纳秒、能量高达80毫焦的激光脉冲。 波长可在680-950纳米范围内调节。
球面压电复合探测器阵列	Imasonic SaS, Voray (法国)	定制	该阵列由分布在球形表面上的256个压电传感器组成。 每个元件尺寸为3 × 3 mm2，中心频率为4 MHz，带宽为100%。
数据采集系统（DAQ）	Falkenstein Mikrosysteme GmbH, Taufkirchen (德国)	定制	该DAQ系统以每秒40兆采样率同时采集256路信号，每路包含2,030个采样点。 输入阻抗为1 MΩ。
光纤束	CeramOptec GmbH, Bonn (德国)	定制	该光纤束由480根独立光纤在输入端和输出端随机分布组成。 每根光纤的数值孔径为0.22。
裸鼠（athymic nude小鼠）	Harlan Laboratories (荷兰)	Athymic nude - Foxn1nu	实验时小鼠为8周龄（成年）。 伦理协议已获巴伐利亚州政府批准（编号55.2.1.54-2632-102-11）
Bepanthen乳膏	Bayer AG (德国)		用于麻醉期间保护眼睛的兽用软膏
数据处理软件	Matlab (Mathworks, Natick, MA, 美国)	定制	该数据处理软件由本研究所开发。 支持各波长下的图像重建、多波长解混以及进一步的数据处理。
盛水部件		定制	该部件容纳水，作为皮肤与换能器元件之间的声学耦合介质
吲哚菁绿（ICG）	PULSION Medical Systems SE		ICG-PULSION（活性成分：吲哚菁绿染料）是一种用于心脏、循环系统及微循环诊断、肝功能检测以及眼科血管造影诊断的药物。