端粒酶在新生小鼠脑组织以及成年小鼠脑的特定区域均有表达。本文介绍一种无毒且节省时间的TRAP检测法，用于分析小鼠脑不同区域的端粒酶活性，并检测雄性和雌性小鼠脑之间端粒酶活性的差异。
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本文内容
摘要
摘要
端粒酶是一种核糖核蛋白，负责维持端粒长度，从而促进基因组完整性、细胞增殖和寿命。此外，端粒酶可保护线粒体免受氧化应激损伤，并赋予细胞抵抗凋亡的能力，提示其在神经元等非分裂但高度活跃的细胞存活中可能具有重要作用。我们先前已证明新型端粒酶激活剂能够增加小鼠大脑不同区域的端粒酶活性和表达水平，并保护运动神经元细胞免受氧化应激损伤。这些结果进一步支持端粒酶参与了神经元抵抗多种损伤的保护机制。为了阐明端粒酶在大脑中的作用，本文比较了雄性和雌性小鼠大脑中端粒酶活性的差异及其对年龄的依赖性。TRAP 法是检测各种组织或细胞系中端粒酶活性的标准方法。本文展示了通过使用 CHAPS 裂解缓冲液进行非变性蛋白提取，继而对标准 TRAP 法进行改良，用于分析小鼠大脑三个区域中端粒酶活性的方法。
在此两步法检测中，内源性端粒酶通过添加TTAGGG六碱基对重复序列（端粒酶反应）来延长特定的端粒酶底物（TS引物）。端粒酶反应产物通过PCR扩增，形成以6 bp为增量的DNA梯状条带。通过4.5%高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离DNA梯状条带，随后使用高灵敏度核酸染料染色进行分析。
与传统的TRAP检测方法相比，本方案采用非毒性且节省时间的TRAP检测法来评估小鼠脑组织中的端粒酶活性。传统TRAP检测使用32P标记的放射性dCTP进行DNA检测，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳解析DNA梯状条带，而本方法能够检测雌性和雄性小鼠不同脑区中端粒酶活性的差异。
引言
端粒酶是一种核糖核蛋白，由端粒酶逆转录酶（TERT，端粒酶的催化亚基）和RNA组分（TERC）构成。端粒酶的经典功能是通过在端粒末端添加重复序列（TTAGGG）来维持端粒的适当长度，从而促进基因组完整性和细胞增殖1。此外，TERT在细胞中还具有其他功能，例如，它可赋予细胞抵抗多种损伤因子诱导的凋亡能力2，保护人源间充质干细胞免受氧化应激损伤3，并通过与TIA1阳性RNA颗粒结合，在完全分化的神经元中发挥促存活作用4。
TERT 主要在体细胞分裂细胞以及大多数类型的癌症中表达并具有活性，而在非分裂细胞中，该酶的表达水平和活性受到严格调控5,6。研究表明，在啮齿类动物大脑中，出生后第10天时端粒酶活性已无法检测到，而 TERT mRNA 在成年期仍维持在较低水平7。其他研究证实，成年动物的脑室下区、嗅球、海马、成年小脑和大脑皮层中存在端粒酶活性8。我们最近的研究表明，能够增强脑和脊髓中端粒酶表达和活性的新型化合物，在 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）注射小鼠模型中具有神经保护作用，可延缓 SOD1 转基因小鼠肌萎缩侧索硬化症的发病和疾病进展，并增加这些小鼠脊髓中运动神经元的存活率9。为了充分理解端粒酶在神经元和大脑中的促生存作用，有必要建立一种简单、相对灵敏且快速的检测方法，用于检测大脑不同区域的端粒酶活性。
端粒重复扩增程序（TRAP）是一种广为人知的高灵敏度检测方法，结合了端粒酶的经典活性与聚合酶链式反应（PCR）。在该检测中，端粒酶向端粒酶底物（TS引物）寡核苷酸添加TTAGGG重复序列，随后通过PCR扩增产生间隔为6个碱基对（bp）的DNA梯状条带，扩增所用反向引物为ACX。使用32P标记的dCTP来检测微量的PCR产物。DNA梯状条带通过测序级聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离。DNA条带的强度和DNA梯状条带的长度分别反映了活性酶分子的数量及其持续合成能力10。
这种传统检测方法存在一些主要困难：接触放射性物质的危险性、体积大且难以操作的测序用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）板，以及电泳运行和放射性产物胶片曝光所需的时间消耗（两种情况均需过夜）。
本方案提供了一种改进的非放射性琼脂糖微型凝胶检测方法。使用4.5%高分辨率琼脂糖凝胶分离DNA 6 bp阶梯标记物，并通过高灵敏度核酸染料实现检测。结合高分辨率琼脂糖微型凝胶与高灵敏度核酸染料，该方法操作简便，避免了放射性暴露风险，并将整个检测时间从3天显著缩短至数小时。
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方案
动物实验已获得本-古里安大学动物实验伦理委员会的批准（IL-39-08-2010）。
1. 小鼠脑组织蛋白提取
- 准备3个15 ml的离心管，每管加入5 ml林格氏液，并将离心管置于冰上。
- 使用异氟烷麻醉（注意：需在化学通风橱中操作）处死小鼠，持续10-20秒，随后进行颈椎脱位并立即断头。
- 从颅骨中取出脑组织，并用冰冻的林格氏液冲洗数秒，以防止脑组织受损。
- 使用手术刀将小脑（CR）和脑干（BS）从前额皮层分离。接着将小脑与脑干分离，并从前额皮层切下额叶（FL）；去除额叶上的嗅球。将这三个脑区分别放入指定的15 ml离心管中。
- 将每管中的组织匀浆。加入新鲜的冰冻林格氏液，使每管总体积相等，然后在800 × g条件下离心7分钟。
- 弃去上清液，向每管中加入100 µl CHAPS裂解缓冲液。通过21 G针头的1 ml注射器反复抽吸溶液约10次，充分混匀，冰上孵育30分钟。
- 将每管内容物转移至新的微量离心管中，在13,000 × g条件下离心30分钟。将上清液转移至新的微量离心管中，采用已建立的方法测定蛋白浓度。将蛋白提取物以10 µl分装，于-80 °C保存。
2. TRAP 检测的仪器准备、反应溶液配制及蛋白质稀释计算
- 准备适当数量的已标记微型离心管，用于蛋白质提取物稀释和端粒酶反应缓冲液。在本方案的所有移液操作中均使用滤芯吸头，以防止污染。
- 将以下溶液置于冰上解冻：TRAP 反应混合液（10x）、TS 引物、dNTPs、超纯水（UPW）以及蛋白质提取物（试剂及其浓度参见材料表）。
- 使用超纯水（UPW）将蛋白质提取物溶液稀释至终浓度为 1 µg/µl。
3. 端粒酶反应
- 在微量离心管中加入以下组分，配制端粒酶反应混合液：2 µl TRAP 混合液（10x）、1 µl TS 引物（0.1 µg）、1 µl dNTPs（10 mM）和 15 µl 超纯水（UPW）。若处理多个样品，将上述体积乘以样品数量再加1。
- 向每个反应管中加入 19 µl 反应混合液，并向每管加入 1 µl 稀释后的蛋白提取物（含 1 µg 蛋白质），最终反应体积为 20 µl。
- 将反应管置于预热至 30 °C 的水浴中，孵育 45 分钟。
4. PCR 反应
- 在端粒酶反应结束前15分钟，解冻以下溶液：ACX引物、Titanium Taq缓冲液、UPW。
- 在微量离心管中加入以下组分配制PCR反应混合液：2.5 µl Titanium Taq缓冲液（10x）、1 µl ACX引物（0.1 µg）、2 µl UPW（若使用内参则为1 µl）和0.5 µl Titanium Taq聚合酶（50x）。若处理多个样本，将上述体积乘以样本数加2。
- 向每个PCR管中加入6 µl PCR混合液，并将端粒酶反应液全部（20 µl）加入各PCR管中，最终体积为26 µl。
- 将PCR管放入PCR扩增仪中，运行以下程序：
- 90 °C – 2 min。
- 94 °C – 30 sec.*
- 60 °C – 30 sec.*
- 72 °C – 45 sec.*
- 72 °C – 2 min。
PCR产物保存于-20 °C。
* = 34个循环
5. 琼脂糖微型凝胶制备、样品电泳及凝胶染色
- 取一个体积为缓冲液体积2-4倍的烧杯，加入25 ml预冷的电泳缓冲液（TBE）和一个搅拌子，在快速搅拌的同时缓慢撒入1.125 g高分辨率（HR）琼脂糖粉末。移除搅拌子，用塑料封口膜覆盖烧杯，并刺一个小孔用于通气。将烧杯放入微波炉中，先以"低"功率加热3分钟，然后切换至"高"功率，以短脉冲方式小心加热，避免溶液溢出。注意当加热产生的泡沫变为大气泡并在数秒内消失时，表明琼脂糖已完全溶解。
- 将凝胶倒入水平小型凝胶装置中，待凝胶在室温下完全凝固后，于4 °C冰箱中预冷20分钟再使用。
- 每条加样孔加入25 µl TRAP样品（含20 µl TRAP PCR产物和5 µl 6x上样染料），在4 °C冷室中以110 V恒压电泳运行3小时。
- 配制核酸染料的3x工作液：将15 µl 10,000x核酸染料原液加入含0.1 M NaCl（0.29 g）的50 ml双蒸水（DDW）中，混匀。将凝胶置于该染色液中，轻轻振荡染色20分钟。
- 使用波长为302 nm的紫外透射仪观察TRAP梯状DNA条带。
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结果
采用改良型TRAP检测法和放射性TRAP检测法时，分别从3只1月龄和3只3月龄的CD-1雌性小鼠及3只1月龄和3只3月龄的CD-1雄性小鼠的额叶（FL）、脑干（BS）和小脑（CR）组织中制备全细胞蛋白提取物；而用于放射性TRAP检测法的样本则来自3只2月龄的CD-1雄性小鼠。使用改良型TRAP检测法在1 µg蛋白提取物中检测端粒酶活性，而放射性TRAP检测法则使用2 µg蛋白提取物。通过放射性TRAP检测法与改良型TRAP检测法对端粒酶活性的检测结果表明，改良型检测法在端粒酶DNA产物的可视化效果和分辨率方面更优，这可通过DNA梯状条带的长度和强度得以体现（图1A 与 1C 和 1D 对比）。当逐步降低来源于胶质母细胞瘤U-251细胞系的蛋白提取物浓度时，可观察到端粒酶DNA产物呈渐进性减少，提示改良型TRAP检测法在较低蛋白提取物浓度下仍具有较高的端粒酶活性检测灵敏度（图1B）。
在3月龄雌性和雄性小鼠中，FL和BS区域的端粒酶...
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讨论
通过TRAP法分析小鼠脑组织中的端粒酶活性主要包括4个步骤：1）从脑组织特定区域提取蛋白质；2）端粒酶对TS引物进行延伸——端粒酶反应；3）通过PCR扩增端粒酶反应产物；4）利用高分辨率琼脂糖凝胶分离PCR产物。
这种改进的TRAP检测方法解决了传统检测中的两个主要难题：传统方法需要使用放射性dCTP来灵敏地检测PCR产物，以及需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离DNA梯状条带。高分辨率琼脂糖凝胶电泳相比难以操作的测序级PAGE，可更简便地检测端粒酶反应产物（即DNA梯状条带）。此外，核酸染色剂为无毒溶液，且具有高灵敏度，能够检测微量DNA。
需特别注意以下关键步骤：1）尽量缩短组织取出与匀浆之间的时间，以保持蛋白质完整性；2）避免反复冻融CHAPS裂解缓冲液；3）蛋白质提取物应分装保存，使用前仅 thaw 一次，避免样品反复冻融。
在凝胶制备步骤中可能会出现问题，因为高浓度琼脂糖凝胶在加热过程中容易溢出，需要密切注意。该技术存在若干局限性，例如必须在低温室中进行电...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作部分得到了内盖夫技术 B.G. 和琳达·鲍尔斯贡献的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| TRAP反应混合液（10倍浓度） | 手动配制，将以下成分溶于超纯水（UPW）：630 mM KCl、200 mM Tris-HCl（pH 8.2）、10 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mg/ml BSA、0.5% TWEEN（购自Sigma）。分装后于-20 °C保存。 | ||
| 林格氏液 | 手动配制，将以下成分溶于双蒸水（DDW）：124 mM NaCl、3 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4·H2O、2 mM MgSO4、26 mM NaHCO3、1.802 g/L 无水D-(+)-葡萄糖。 | ||
| 异氟烷 | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | 在通风橱中小心操作 |
| dNTPs（10 mM） | Sigma | D7295 | |
| TS引物（5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'） | Sigma | DNA寡核苷酸以冻干形式订购，根据所需浓度加入超纯水（UPW）溶解 | |
| ACX引物（5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3'） | Sigma | DNA寡核苷酸以冻干形式订购，根据所需浓度加入超纯水（UPW）溶解 | |
| 钛聚合酶/缓冲液（Titanium Taq Polymerase/Buffer） | Clontech | S1792/S1793 | |
| 高分辨率琼脂糖 | Sigma | A4718 | 任何高质量的高分辨率琼脂糖均可适用 |
| 小型凝胶电泳装置 | Bio-Rad | 170-4466 | |
| 核酸染料（GEL-RED） | Biotium | 41003 | |
| IC引物（5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3'） | Sigma | DNA寡核苷酸以冻干形式订购，根据所需浓度加入超纯水（UPW）溶解 | |
| CHAPS裂解缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9852S | 加入PMSF（蛋白酶抑制剂）至终浓度为1 mM |
| 超纯水（UPW） | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1小鼠 | HARLAN Laboratories INC. |
参考文献
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602(2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
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重印与许可
