传统的制备含有荧光探针的聚丙烯酰胺（PA）凝胶的方法涉及将凝胶夹在粘附表面与玻璃载片之间。本文表明，通过用聚-D-赖氨酸（PDL）包被该载片，并将荧光探针定位在凝胶表面1.6 µm范围内，可实现探针的表面局部化。
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摘要
摘要
聚丙烯酰胺（PA）凝胶长期以来被用作研究细胞牵引力的平台，因其制备简便且可调节其弹性特性。当基底涂覆有细胞外基质蛋白时，细胞会黏附于凝胶表面并施加作用力，导致凝胶发生形变。该形变取决于细胞牵引力以及凝胶的弹性性质。若已知表面的形变场，则可根据弹性理论计算表面牵引力。通常通过将荧光标记微珠均匀包埋于凝胶中来测量凝胶的形变。随着凝胶形变，这些探针发生位移，并对靠近凝胶表面的微珠进行追踪。这些微珠报告的位移被视为表面位移，而其距表面的深度则被忽略。这一假设会在牵引力评估中引入误差。为了精确测量细胞作用力，明确微珠的位置至关重要。我们开发了一种技术，利用简单的化学方法将直径为0.1和1 µm的荧光标记微珠限制在PA凝胶中距表面1.6 μm范围内的区域。首先在盖玻片上涂覆聚-D-赖氨酸（PDL）和荧光微珠，然后将PA凝胶溶液夹在盖玻片与粘附表面之间。在凝胶固化过程中，荧光微珠转移至凝胶溶液中。聚合完成后，PA凝胶中靠近凝胶表面的平面上即含有荧光微珠。
引言
通常使用聚丙烯酰胺（PA）凝胶来研究活细胞与其局部环境之间的力学相互作用。这类基底依赖于Dembo和Wang于1997年建立的一种简单且表征明确的实验方案1。这类基底的主要优势之一在于，可通过调节凝胶溶液中特定组分的浓度来调控其刚度，从而为研究细胞与不同刚性环境之间的相互作用提供了一个理想的平台。当PA凝胶包被细胞外基质（ECM）蛋白后，细胞会黏附于其上并产生作用力。由于细胞施加的力，凝胶会像弹性体一样发生形变。这种形变的程度取决于细胞施加的力的大小以及凝胶本身的弹性特性。已有大量研究采用PA凝胶来探究细胞的牵引力。
在一种PA凝胶制备方法中，将荧光微球（微珠）嵌入凝胶内部，用于量化细胞在不同刚度凝胶上的牵引力2。当细胞施加作用力时，微珠随凝胶变形而从其初始位置发生位移。通过各个微珠的位移来测量变形场。结合弹性理论及凝胶的弹性特性，利用该变形场可计算出牵引力。这些测量结果有助于揭示细胞如何在机械层面感知并与其局部微环境相互作用3。
在许多广泛使用的聚丙烯酰胺（PA）凝胶制备方案中，微球在凝胶处于液态、未聚合的状态下即均匀混入其中。完全聚合后的PA凝胶在其整个体积内均含有荧光微球。在计算细胞牵引力时，通常监测最靠近凝胶表面（即细胞-基质界面）的微球。为简化力的计算过程，通常假设这些微球的位移发生在细胞培养表面。而微球在凝胶深度方向上的实际位置则被忽略。然而，在弹性介质（如PA凝胶）中，距离受力点较近的微球比距离较远的微球会产生更大的位移。因此，若将位于表面以下较远处（微球所在位置）的位移视为表面位移，会导致对细胞牵引力的低估。误差的程度取决于微球与表面之间的距离。若不了解微球的具体位置，则无法评估该误差的大小。
目前已有少数技术试图解决如何将微珠限制在细胞培养表面附近这一需求。一种方法是提高整个凝胶中微珠的密度，使得在最表层的焦平面内有足够数量的微珠，从而能够测量靠近表面区域的运动。另一种技术是构建共聚焦成像室用于活细胞成像，仅收集位于最上层焦平面微珠发出的光信号4。还有一种方法是在已聚合但不含微珠的聚丙烯酰胺（PA）凝胶上覆盖一层极薄的含微珠PA凝胶5。然而，这些技术的共同缺点是无法确切知道微珠在凝胶内的精确位置，这会引入微珠位移场计算中的误差，进而影响细胞力的计算结果。另一种方法是使用 Sulfo-SANPAH 将微珠共价连接到已聚合PA凝胶的表面6。该方法可确保微珠仅位于PA凝胶的顶部，但微珠嵌入凝胶深度的程度仍不明确。这可能会形成局部的表面形貌，从而影响细胞行为，因为先前的研究表明细胞能够感知数微米范围内的力学信号7。最近，有研究建立了一种在PA凝胶表面以规则阵列形式图案化直径为1 μm的荧光纤连蛋白标记点的技术8。在这种情况下，荧光标记物的深度是已知的，几乎为零，因为纤连蛋白图案是间接印制在凝胶表面。然而，该方法无法为细胞提供连续的附着环境，因为细胞外基质蛋白仅局限于直径1 μm的点状区域。迄今为止，仍缺乏一种可将示踪微珠完全整合入PA凝胶并精确限定其位于表面附近已知位置的方法。
在此，我们开发了一种技术以限制亚-μ米到 μ直径为 m 的荧光微球被置于 PA 凝胶内贴近细胞培养表面的焦平面处。通常通过将未聚合的液态凝胶溶液夹在两片玻璃板之间来固化凝胶。其中一片玻璃板经过功能化处理，使凝胶能够牢固附着；另一片为非功能化玻璃板，在凝胶固化后被移除。我们通过在该可移除的玻璃表面涂覆一层微球来对其进行改造。当液态凝胶被夹在功能化玻璃与微球包被的玻璃表面之间时，微球在凝胶固化过程中转移至凝胶表面。这将微球嵌入凝胶的深度限制在 1.6 以内 µ表面的微米级。使用底部为玻璃的培养皿作为黏附表面，在其上固化凝胶。为在聚合过程中形成平整的凝胶上表面，采用圆形玻璃盖玻片将凝胶夹在玻璃底培养皿之间。在凝胶制备前，将顶部的玻璃盖玻片涂覆多聚-D-赖氨酸（PDL），以产生正电荷表面。用压缩空气吹去多余的PDL后，将含有微珠的水溶液滴加到盖玻片上。我们使用带羧基的荧光微珠，其带有负电荷，可与经PDL处理形成的正电荷表面发生相互作用。用压缩空气将微珠溶液从盖玻片上吹干后，单层微珠通过静电作用稳定结合在干燥的盖玻片表面。PDL涂层不会影响玻璃对凝胶表面的黏附性，因为玻璃片无损伤，并能完整地从聚丙烯酰胺（PA）凝胶上移除。
通过使用97%的3-氨基丙基三甲氧基硅烷和0.5%的戊二醛处理，使玻璃底培养皿具有黏附性。通过标准方法9混合适当浓度的双丙烯酰胺和丙烯酰胺，制备所需刚度的聚丙烯酰胺（PA）凝胶。将一滴凝胶溶液移液至玻璃底培养皿上，然后用载有微珠的玻璃盖玻片将凝胶夹在培养皿之间。凝胶固化后，移除上方的盖玻片，使微珠嵌入聚丙烯酰胺凝胶中，并位于表面以下1.6 µm范围内。
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方案
制备具有不同硬度的聚丙烯酰胺凝胶，并在靠近细胞培养表面处嵌入荧光微球以进行功能化处理。
1. 顶部玻璃盖玻片的功能化处理
- 用肥皂水清洗玻璃盖玻片（#1.0，直径12 mm），再用乙醇处理以去除多余灰尘。
- 将玻璃盖玻片放置在带格栅的表面上（即 移液器吸头架），使其彼此不接触，以便于与盖玻片进行操作互动。
- 用多聚-L-赖氨酸（0.1 mg/ml）覆盖盖玻片整个表面，孵育1小时（图1A).
- 在此期间，用去离子水（DI 水）将直径为 0.1 μm 的红色荧光微球胶体溶液稀释 10,000 倍，以获得每 20 μm 约含 1 个微球的粒子密度2 在凝胶表面。参见 图2 以获得不同稀释度的结果。该稀释比例可根据具体实验需求进行调整。
- 将稀释后的溶液置于超声水浴中处理30分钟。
- 孵育1小时后，用镊子小心地提起每张盖玻片，并用空气吹干。将干燥的盖玻片放回网格表面。
- 从超声波水浴中取出稀释后的胶体溶液，用移液器将150 μl溶液滴加到每块盖玻片上，静置10分钟。图1B).
- 使用镊子小心地取下每一片盖玻片，并用空气吹干。将干燥的盖玻片放回网格表面，避光保存，直至使用时取出。
2. 在玻璃底培养皿上直接制备PA凝胶
- 将加热板预热至 100 °C。
- 在化学通风橱内的平坦表面上放置所需数量的玻璃底培养皿（35 mm 培养皿，带 14 mm 微孔，#1.0）。
- 用 97% 的 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（3-APTES）覆盖每个培养皿微孔的玻璃部分，持续 7 分钟以进行化学活化。操作时需注意避免 3-APTES 滴到培养皿的塑料表面，以防聚苯乙烯降解。
- 7 分钟后，用去离子水（DI 水）充满培养皿，并将液体倒入废液容器中。
- 对每个培养皿重复步骤 2.4 三次 ，然后轻轻振荡培养皿以去除多余的水分。将培养皿置于加热板上，直至玻璃部分完全干燥。
- 从加热板上取出培养皿，放回化学通风橱内的平坦表面上。
- 在化学通风橱中，配制 0.5% 戊二醛溶液，并用该溶液覆盖每个培养皿微孔的玻璃部分，反应 30 分钟。操作时需注意避免戊二醛滴到培养皿的塑料表面，以防塑料降解。
- 30 分钟后，用去离子水充满培养皿，随后倒入废液容器中以冲洗并去除戊二醛。
- 对每个培养皿重复步骤 2.4 三次 ，然后轻轻振荡培养皿以去除多余水分。将培养皿置于加热板上，直至玻璃部分完全干燥。
- 在混合 PA 凝胶溶液各组分之前，将功能化的玻璃盖玻片移至化学通风橱中并放置在易于取用的位置，以便在混合凝胶溶液后能迅速将凝胶与玻璃底培养皿进行夹心组装。
- 在 15 ml 离心管中，按 表 1 所列浓度（改编自已发表的实验方案10），依次加入 40% 双丙烯酰胺、2% 丙烯酰胺和丙烯酸，以获得目标基质弹性。
- 按 表 1 中对应目标基质弹性的用量，加入 100 mM HEPES、10% 过硫酸铵和 TEMED，完成凝胶溶液的配制。
- 立即用移液器吸取 15 μl 凝胶溶液，滴加至培养皿玻璃部分的中央。
- 立即用镊子夹取一张功能化的玻璃盖玻片。
- 将盖玻片翻转，使带有荧光微球的一面朝下，与凝胶溶液接触。
- 将盖玻片轻轻放置在液态 PA 凝胶上方，确保功能化面与凝胶接触（图 1C）。注意：为获得最佳效果，建议由第二人负责添加盖玻片，以避免在多个培养皿中逐个滴加液态 PA 凝胶时发生部分聚合。
- 将所有培养皿倒置，以减少重力对荧光纳米颗粒在 PA 凝胶中沉降聚合的影响。
- 静置至少 35 分钟，或直至离心管中的 PA 凝胶储备液明显完成聚合。
- 将培养皿翻转回正，并加入 PBS 以帮助去除盖玻片。
- 小心用镊子接触培养皿的玻璃部分及盖玻片边缘，沿盖玻片周缘轻轻刮动。重复数次，直至盖玻片松动。取下盖玻片并放入适当的锐器废物容器中。
- 移除所有盖玻片后，荧光微球将已转移至凝胶表面（图 1D）。用 PBS 完全覆盖 PA 凝胶，盖上培养皿盖，于 4 °C 保存。
3. 用纤连蛋白功能化PA凝胶
- 按照已建立的方案11配制以下预混溶液：浸润溶液（137 mM NaCl，5% (v/v) 甘油）和2倍偶联缓冲液（0.2 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)，10% (v/v) 甘油，pH 4.5）。
- 在生物安全柜中使用真空泵将含有PA凝胶的玻底培养皿中的PBS完全吸除。
- 用移液器将浸润溶液滴加至每块凝胶上，确保凝胶完全浸没。室温孵育至少1小时。
- 将盐酸1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺 (EDC) 和 N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠 (NHS) 恢复至室温。
- 分别配制10倍浓度的EDC溶液（150 mM，19 mg/ml，溶于去离子水中）和NHS溶液（250 mM，29 mg/ml，溶于去离子水中）。
- 将1份10倍EDC溶液、1份10倍NHS溶液、3份去离子水和5份2倍偶联缓冲液混合均匀。
- 在生物安全柜中使用真空泵吸除浸润溶液，确保凝胶表面无残留液体。
- 加入足量的NHS/EDC溶液以覆盖凝胶表面并填满培养皿的玻底孔（150–250 μl）。室温避光孵育30分钟。
- 室温解冻纤连蛋白，解冻后加入无菌去离子水，配制成50 μg/ml的纤连蛋白溶液。
- 在生物安全柜中使用真空泵吸除NHS/EDC溶液，确保凝胶表面无残留液体。
- 向每块凝胶加入150 μl纤连蛋白溶液，室温孵育35分钟，使纤连蛋白充分结合。
- 35分钟后，向每个培养皿中加入PBS，并于4 °C保存，最长可保存2周。
4. 牵引力实验
- 将细胞培养基、PBS 和胰蛋白酶在水浴中预热至 37 °C。
- 用无菌 PBS 冲洗凝胶 5 次，每次冲洗之间吸除 PBS，并将凝胶盖好后置于超净台中。
- 按每 25 cm2 加入 1 ml 胰蛋白酶的比例加入含有细胞的培养瓶中。待细胞从培养瓶表面脱落之后，用细胞培养基稀释胰蛋白酶，并对细胞进行计数。根据凝胶表面积，计算每块凝胶所需的细胞数量，以达到最终接种密度为 3,000 个细胞/cm2。调整细胞悬液浓度，使 150 μl 细胞-培养基混合液中含有该数量的细胞。将 150 μl 细胞悬液分装至每块凝胶上。
- 将含有细胞的培养皿放入培养箱中孵育 30 分钟。然后小心取出培养皿，并加入培养基（约 2 ml）至充满整个培养皿，确保培养皿表面完全浸没在培养基中。
- 将培养皿重新放回培养箱中，直至进行成像采集。
- 准备显微镜和数据采集系统进行成像：插入 40 倍水浸物镜，插入微分干涉差（DIC）棱镜，选择 mCherry 或等效荧光滤光片，并开启环境控制腔室。
- 准备成像时，从培养箱中取出一个培养皿，轻柔地放置在显微镜载物台上。移除培养皿盖子以进行 DIC 成像。
- 定位单个细胞，并在 DIC 模式下捕获该细胞的单张静态图像。
- 不移动显微镜载物台，切换至荧光成像模式。聚焦于荧光微球，并记录微球的图像。
- 用移液器小心吸除培养皿中的细胞培养基，并加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。
- 在细胞脱落后，对细胞下方的微球进行成像。
- 使用 ImageJ12 中的粒子图像测速（PIV）分析方法，计算由细胞力引起的位移场。
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结果
采用共聚焦成像技术确定微珠确实位于凝胶表面之下，并量化其在凝胶深度方向上的精确位置。将发射不同波长荧光的微珠沉降在凝胶表面，利用质心识别算法计算凝胶内部嵌入的荧光纳米微珠与表面微珠之间的距离。凝胶表面微珠的位置作为凝胶顶部表面的参考点——即细胞黏附后施加作用力的位置。两种实验情景的示意图（凝胶内为绿色微珠、表面为红色微珠，或反之）见图3。该算法对三维质心位置的z轴高度进行插值计算。我们对三种不同刚度的凝胶（1、10 和 40 kPa）以及两种尺寸（直径）的荧光微珠（0.1 μm 红色微珠和 1 μm 黄绿色微珠）重复进行了该过程。根据三维质心位置，确定凝胶内每颗微珠与其最近邻的不同波长微珠之间的距离。图4展示了微珠在凝胶表面及内部的空间分布情况及其在YZ平面上的投影视图，后者提供了所有微珠相对于凝胶表面的深度信息。
对于刚度分别为1、10和40 kPa的PA凝胶，0.1 μm微珠的平均深度分别为619 nm、467 nm和278 nm（图5A）。对于直径为1 μm的微珠，在40 k...
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讨论
使用该技术时，必须对珠溶液进行适当稀释，并根据所需的珠直径、PA凝胶基底刚度以及目标实验中所研究现象的尺度来选择合适的珠。
在对顶部玻璃盖玻片进行功能化处理之前稀释微珠溶液时应格外小心。通过改变胶体溶液的稀释倍数，可以调节凝胶表面微珠之间的间距。过度稀释会导致结合到盖玻片上的微珠数量减少，最终降低凝胶中微珠的数量；而稀释不足则可能导致凝胶中微珠密度过高，使微珠相互接触而难以区分。尽管通常难以完全避免纳米颗粒的聚集现象，但对稀释后的溶液施加超声波可有效减少纳米颗粒的聚集。我们发现，本方案中所用胶体溶液进行10,000倍稀释后，微珠浓度为3.64 × 108 个/ml，可获得直径为0.1 μm微珠的理想颗粒密度，即0.05 个/μm2。1:20,000稀释（1.82 × 108 个/ml）则可达到平均每颗粒占据52 μm2的面积。图2展示了不同稀释倍数下凝胶表面的图像。需要注意的是，转移至凝胶上的微珠数量存在一定变异性，这主要是由于在功能化过程中使用压缩空气去除盖玻...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢伊利诺伊大学跨学科创新倡议计划（Interdisciplinary Innovation Initiative Program）的资助，项目编号 12035。S.K. 在伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校（UIUC）的研究由美国国家科学基金会（NSF）资助，项目编号 0965918 IGERT：培养下一代细胞与分子力学及生物纳米技术研究人员。 本研究部分得到了美国国家科学基金会纳米生物系统节点（nanoBIO node）项目（ECC-1227034）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 97% 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES） | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 70% 戊二醛 | Polysciences, Inc. | 111-30-8 | |
| 1 M HEPES 缓冲液 | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 40% 丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 2% 双丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| 0.1 µm 荧光微球（mCherry） | Invitrogen | F8801 | |
| 人纤维连接蛋白，1 mg | BD Biosciences | 354008 | |
| 过硫酸铵 | Bio-RAD | 161-0700 | |
| 四甲基乙二胺（TEMED） | Bio-RAD | 161-0801 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Millipore | A-003-E | |
| 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC） | Thermo Scientific | 22980 | |
| N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠（NHS） | Thermo Scientific | 24500 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1X） | Life Technologies | 25300-054 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 丙烯酸 | Sigma-Aldrich | 147230 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES） | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| 材料 | |||
| 35 mm 玻璃底培养皿，带 14 mm 微孔，#1 盖玻片 | In Vitro Scientific | D35-14-1-N | |
| 玻璃盖玻片，直径 12 mm | Ted Pella, Inc. | 26023 |
参考文献
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