肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）之间的竞争由细菌素介导，细菌素是一类对肺炎链球菌及其他相关物种具有抑制活性的小分子抗菌肽。 本文介绍一种优化的细菌覆盖检测法，可用于表征细菌素的活性与抑制谱、细菌素特异性免疫反应，以及分泌型群体感应肽的检测。
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摘要
摘要
Streptococcus pneumoniae 定植于高度多样化的多微生物群落——鼻咽部，在此必须与常驻微生物竞争。我们已证实，细菌产生的抗菌肽（细菌素）决定了这些竞争性相互作用的结果。所有已完成全基因组测序的肺炎链球菌菌株均携带一个bacterial素样p肽（blp）位点。blp 位点编码多种多样的细菌素，以及其调控、加工和分泌所需的全部高度保守组分。该位点中的细菌素免疫区（BIR）所含细菌素的多样性是肺炎链球菌竞争能力的主要决定因素。除细菌素外，BIR 中还含有免疫基因，用于保护产生菌自身免受其分泌的细菌素的影响。覆盖试验（overlay assay）是一种快速检测大量菌株间由细菌素介导的竞争性相互作用的方法。该试验还可用于表征细菌素特异性的免疫性，并检测分泌型群体感应肽。实验操作为：先在琼脂平板上接种待测菌株（用于检测其是否产生细菌素），随后覆盖一层含指示菌株的软琼脂（用于检测其对细菌素的敏感性）。若在穿刺接种处周围出现透明圈，表明覆盖层中的指示菌株对预先接种菌株产生的细菌素敏感；若未观察到透明圈，则可能是因为指示菌株对该细菌素具有免疫性，或预先接种的菌株不产生细菌素。为确定某一菌株的 blp 位点是否具有功能，可对覆盖试验进行改进，以检测预先接种菌株是否分泌肽类信息素。在此情况下，覆盖层中将分别使用四种具有不同信息素特异性的 lacZ-报告菌株。
引言
肺炎链球菌，作为鼻咽部多微生物群落中常见的定植菌，能够通过产生细菌源性抗菌肽（细菌素）与其他肺炎链球菌及近缘物种竞争。迄今为止所检测的每一种全基因组测序的肺炎链球菌菌株均含有某种形式的 b细菌素-like p肽 位点， blp肺炎链球菌产生细菌素已被证明在以下两种情况的结果中具有重要作用 体外 和 体内 竞争1-4竞争性动态受到多种细菌素及其同源免疫蛋白表达的影响，这些表达由特定的肽信息素诱导。该诱导作用的 blp 基因座受群体感应系统调控，其中肽类信息素BlpC与感应激酶BlpH结合，启动信号级联反应，导致转录的激活 blp 位点5,6存在四种BlpC等位基因变异，每种均可与其对应的BlpH结合6为使细胞能够耐受自身细菌素的作用，编码相应免疫蛋白的基因会与各细菌素基因位于同一操纵子上进行转录。若竞争菌株无法上调相关免疫机制，则会发生杀伤作用。 blp 在对外源信息素响应时，或当菌株缺乏保护所需的特异性免疫基因时，该位点会被激活。肽类信息素和细菌素肽的分泌与加工需要转运蛋白复合物 BlpAB。2,4最近研究表明，相当一部分肺炎球菌菌株为“作弊者”，即其在 blpA 一种使其无法分泌信息素和细菌素的基因1,2这些菌株能够对外源性 BlpC 产生响应2 由邻近菌株分泌，从而促进免疫蛋白的产生。
尽管可以通过生化方法步骤从产生菌株的上清液中制备粗制的细菌素制剂以达到一定纯度，但这种方法不适合用于大规模菌株集合的筛选，且当细菌素在液体培养物中的表达水平较低时效果不佳2,7-9。覆盖法（overlay assay）被用作一种快速研究菌株间可能存在的体外（in vitro）竞争动态的方法。具体操作中，先将一株肺炎链球菌接种于琼脂平板并使其生长，以达到足以诱导blp位点的局部细菌浓度；随后将待测菌株接种至熔融的软琼脂溶液中，再将该软琼脂层覆盖于预先接种的菌株之上，以检测其敏感性。为了评估blp位点的活性（独立于抑制活性之外），可使用一组先前报道过的三种BlpC报告菌株进行覆盖实验。这些报告菌株分别携带三种不同的blpH等位基因，可响应肺炎链球菌分泌的三种最常见BlpC信息素。这些报告菌株整合了受BlpH依赖型启动子调控的lacZ基因，并带有blpC基因的缺失，从而避免自体激活10,11。
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方案
1. 生产菌株的制备
- 从-80 °C冰箱保存的菌种中，将待检测产细菌素能力的肺炎链球菌菌株划线接种至5%绵羊血胰蛋白酶大豆琼脂平板上。
注意：使用血平板进行待测菌株的初始培养可显著提高实验的可重复性。此外，也可使用其他产细菌素的非肺炎链球菌菌株，但可能需要针对特定生物体调整培养条件。我们已成功在覆盖实验中使用Streptococcus mitis和Lactococcus lactis。 - 将平板置于37 °C、5% CO2条件下过夜（O/N）培养。
- 在产菌株培养后，通过移液将3,000至4,000单位的过氧化氢酶加入含有25 ml TSA的平板中，并使用无菌玻璃珠将过氧化氢酶溶液均匀涂布。将平板置于生物安全柜中干燥约10 min 。
- 用移液器吸头挑取可见量的细菌，将吸头刺入已干燥的TSA平板中。
注意：可在同一TSA平板上刺入多个产菌株。应注意合理分布刺种点，以避免最终形成的抑菌圈相互重叠。- 如有可能，应包括已知的细菌素产生菌作为阳性对照，并以将用于覆盖实验的菌株作为阴性对照。
注意：阳性与阴性对照菌株此前已有报道，可应要求提供10。
- 如有可能，应包括已知的细菌素产生菌作为阳性对照，并以将用于覆盖实验的菌株作为阴性对照。
- 将含有多个刺种点的TSA平板在37 °C、5% CO2条件下培养6小时。
2. 制备覆盖菌株的甘油菌种
- 在进行覆盖实验前一天，准备甘油菌种（将处于对数中期生长的菌液加入甘油后于 -80 °C 保存）。取5-10个待检测敏感性或信息素分泌能力的肺炎链球菌菌株单菌落，接种于含0.5%酵母提取物的Todd-Hewitt培养基（THY）中。
注意：BlpC诱导型报告系统的构建方法已有文献报道2，相关菌株可按需索取。 - 将5-10个菌落接种于玻璃试管中，每管加入5 ml THY培养基，盖紧管盖，在37 °C水浴中静置培养，不振荡。
- 在37 °C下培养菌液，直至其OD620 达到0.3至0.5。
注意：具体时间约为4-5小时，取决于所用菌株。- 测量OD值前，轻轻颠倒混匀试管数次。
- 若实验无法在当天进行，或该菌株将来需多次使用，可制备甘油菌种，并在日后继续实验。制备甘油菌种时，向菌液中加入甘油，使其终浓度为20%。将菌液分装至1.5 ml微量离心管中，于-80 °C保存。注意：样品可在-80 °C保存数月。若不制备甘油菌种，则直接使用菌液进行覆盖实验。
3. 覆盖实验
- 在添加覆盖层之前，立即混合覆盖层各组分。取一个15 ml的锥形离心管，加入5 ml THY培养基、3,000–4,000 U过氧化氢酶，以及200 µl覆盖层菌株的液体培养物（该培养物为当天培养的，或为室温下解冻的甘油保存菌种）。若使用报告菌株，则向覆盖层混合液中加入50 µl X-gal（40 mg/ml）。每个培养板使用一个独立的离心管。
- 在加入熔融的TSA前，将覆盖层混合液平衡至室温。
- 从培养箱中取出已接种穿刺菌株的TSA平板。将固体TSA在微波炉中融化后，置于55 °C水浴中保温备用。向覆盖层混合液中加入3 ml含1.5%琼脂、已冷却至55 °C的熔融TSA。
- 应在移液前立即配制覆盖层混合液，因为该混合液会迅速开始凝固。注意：若在接种前覆盖层已开始凝固，实验结果将无法解读。
- 使用5 ml移液器反复吹打数次，充分混匀覆盖层混合液，注意避免引入气泡。将混合液缓慢直接滴加至穿刺接种的TSA平板表面。将平板静置于实验台数分钟，使琼脂充分凝固。
- 切勿旋转平板以分散覆盖层混合液，否则会导致穿刺菌株的生长物被带入覆盖层中。
- 小心将加有覆盖层的TSA平板放入37 °C、含5% CO2的培养箱中过夜培养（约16–18小时）。
- 过夜培养后观察平板结果。除抑制区域或信息素信号作用区域外，平板应被覆盖层菌株的生长所覆盖而呈不透明状。这些区域分别表现为穿刺菌株周围的透明圈或蓝色圈。
注意：尽管可通过测量蓝色圈或透明圈的直径进行定量分析，但直径差异也可能受穿刺接种菌量的影响。覆盖层实验为定性实验，任何定量评估均需谨慎解读。与阴性对照相比出现任何可见的透明区域，均视为具有活性。
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结果
在覆盖实验中可能存在两种结果。经过过夜培养后，应能够观察到穿刺菌株的生长。在图1A中，覆盖菌株对产生的细菌素敏感，可在穿刺菌株周围观察到透明圈。此外，穿刺菌株在覆盖培养基中呈漩涡状扩散的现象也可能出现，如图1A所示。在图1B中，覆盖菌株对所分泌的细菌素具有免疫性，表现为穿刺周围无透明晕圈。也有可能是穿刺菌株本身并未分泌细菌素。在信号传导实验中，同样存在两种可能的结果。穿刺菌株能够分泌信息素，该信息素与覆盖菌株的组氨酸激酶相互作用，从而导致X-gal分解，如图2A所示。如果信息素未能激活报告菌株中blp位点的转录，或穿刺菌株未能分泌信息素，则不会发生X-gal的分解，如图2B所示。
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讨论
该覆盖实验是一种快速确定细菌素产生菌活性范围以及展示肺炎链球菌菌株间可能发生的竞争性相互作用的方法。该实验可进行调整，用于在单个平板上同时筛选多个菌株是否产生细菌素。我们已成功利用48针复制器从96孔板的一半孔中接种SBA平板，结合此方法对大量菌株库进行了筛选。经过一夜培养后，使用复制器将生长物转移至TSA平板，并通过复制器的针头刺穿平板的琼脂表面实现接种。
其他由细菌分泌的抗菌肽，如乳酸菌素，其表达受密度依赖性调控，也可通过覆盖法进行检测7,12,13。当细菌素或乳酸菌素的纯化较为困难时，该方法尤为有用。尽管可直接检测上清液的抗菌活性，但blp基因簇编码的细菌素在液体培养基中的表达极为有限甚至无法表达（数据未显示）。覆盖法检测允许细菌生长至更高密度，而这是液体培养所无法达到的。此外，在固体培养基上的生长可能更接近鼻咽部的体内生长环境。
覆盖实验还可用于检测被穿刺菌株分泌细菌素特异性信号信息素的能力。这需要构建一种报告菌株，该菌株表达信息素受体蛋白，并将信息素响应型启动...
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
本工作得到了伊丽莎白·E·肯尼迪研究奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂 | Fisher | B21261X | 从冷冻保存菌种的复苏培养 |
| 过氧化氢酶 | Sigma | C100-500mg | 每板 4,741 单位 |
| Todd-Hewitt 肉汤 + 酵母提取物（THY） | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g THB，5 g 酵母提取物，1 L ddH₂O2O autoclave |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 + 琼脂平板（TSA） | Fisher | B11768 | 30 g TS，15 g 琼脂，1 L ddH₂O2O型高压灭菌器 |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基 β-D-半乳吡喃糖苷（X-gal） | Sigma | B4252-50MG | 在二甲基甲酰胺中溶解 |
| 培养皿 | Fisher | FB0875712 | |
| 分光光度计 | 测量 OD620 培养物的 | ||
| 37 °C 水浴 | |||
| 37 °含5% CO2的C培养箱 | |||
| 15 ml 离心管 |
参考文献
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重印与许可
