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方法文章

使用不连续蔗糖梯度制备突触浆膜和突触后密度蛋白

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DOI：

10.3791/51896

⸱

2014年9月3日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文详细介绍了通过在不连续蔗糖梯度中进行超速离心来富集与突触质膜相关的蛋白质。同时描述了突触后密度蛋白的后续制备方法。所获得的蛋白质样品适用于蛋白质印迹（Western blotting）或双向差异凝胶电泳（2D DIGE）分析。

摘要

神经元亚细胞分级分离技术可用于定量分析转运至突触及从突触转运出去的蛋白质。该方法最早于20世纪60年代末提出，通过蔗糖密度梯度超速离心法可分离与突触质膜相关的蛋白质。一旦分离出突触膜，由于突触后密度具有去垢剂不溶性，可进一步分离出被称为突触后密度的大型分子复合物。这些用于分离突触质膜和突触后密度蛋白的技术在40多年后基本保持不变，至今仍被现代神经科学研究广泛使用。本文详细描述了利用不连续蔗糖梯度分离与突触质膜及突触后密度相关蛋白的分级方法。所获得的蛋白质样品适用于蛋白质印迹（western blotting）或双向DIGE分析。

引言

神经元通过突触进行通信，而这种通信的质量在很大程度上受到突触处蛋白质组成变化的调控。特别是，位于突触后密度区的蛋白质通过将神经递质受体与其信号转导系统紧密地支架化，参与神经元间的通信1。此外，突触效能强度的持久性改变由突触后密度区受体的增加或移除所控制1-6。因此，分离和定量突触蛋白质是一种必要且有用的技术，有助于深入了解神经元如何响应刺激并调节突触效能7。本文描述了一种常用技术，即通过在不连续蔗糖梯度中进行超速离心，从啮齿类动物脑组织中分离突触蛋白质。可根据突触质膜组分在蔗糖中的密度（经验测定约为1.2 M蔗糖）对其进行富集和分离。

根据不同的生物学问题，亚细胞组分可通过连续或不连续的蔗糖或Percoll梯度进行分离。连续梯度可用于将蛋白质分离至多个组分中，这对于证明特定组分内蛋白质的共定位尤为有用8。然而，连续梯度的制备较为繁琐，且在许多应用中并非必需。相比之下，不连续梯度更易于制备，可用于将蛋白质分离为少数几个通常定义明确的组分。由三种摩尔浓度递增的蔗糖层组成的不连续梯度已被广泛用于分离与突触质膜（SPM）相关的蛋白质。通过去垢剂处理并分离去垢剂不溶性组分，可进一步将该突触质膜组分加工为突触后密度组分（PSD）。

当这一过程在20世纪60年代首次被描述时9,10，研究人员使用电子显微镜来观察大致界定突触质膜和突触后密度组分的细胞器和膜结构9-14。这些研究表明，SPM组分中包含了突触前和突触后的膜结构以及突触小泡；经去垢剂处理后，主要可见电子致密的突触后密度结构。该方法中，通过低渗休克使突触过程从细胞体上脱落10。此步骤利用了线粒体对渗透休克更具抗性并能保持完整的特性，因此它们会在蔗糖梯度底部沉淀（图1）。

利用相同的富集技术，SPM 和 PSD 组分首先通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及主要蛋白质组分的测序实现了生物化学定义15-17。随后，通过蛋白质印迹（western blot）分析检测并定量突触蛋白的水平，进一步明确了这些组分（图2）。我们在实验室中应用该技术，定量分析了当小鼠 Slc6a3 位点发生重复时，多巴胺转运体在突触水平上的变化18。我们还利用该技术在NMDA受体缺陷型小鼠中发现，属于DISC1相互作用组（interactome）的蛋白质在突触部位出现特异性减少19。

Western印迹分析结果表明，SPM组分含有突触小泡膜蛋白、内体标志物、线粒体蛋白、膜相关合成酶和信号转导分子，以及突触后密度和突触质膜的内在组分20-23。即使是PSD组分也可能被大量线粒体蛋白污染，可能需要进行第二次梯度沉降或额外的纯化步骤以去除这些污染物13。最近，定量质谱分析仅在突触后密度中就鉴定出超过100种蛋白质，并提供了这些组分相对丰度的信息24,25。

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方案

以下方案符合加拿大动物护理委员会的指南，并已获得多伦多大学医学院与药学院动物护理委员会的批准。

1. 按照表1所述配制所需试剂

  1. 根据表 1中列出的浓度，将蛋白酶和磷酸酶（如需要）抑制剂加入所有蔗糖溶液、缓冲液和ddH2O中。重要提示：所有步骤均需在4 °C下进行，实验开始前需预先冷却所有试剂和设备。使用永久性记号笔标记所有离心管，包括超速离心管。

2. 适当脑区的解剖

  1. 通过颈椎脱位或断头处死动物。饲养和实施安乐死应遵循机构和政府有关动物护理的政策。
  2. 迅速将脑组织从颅骨中取出，并置于预冷的解剖板上。
  3. 从新鲜组织中分离出相应脑区，进入第3步。

3. 使用电机驱动的玻璃-聚四氟乙烯匀浆器进行组织匀浆

  1. 将解剖的组织（SPM 为 50–100 mg，PSD 为 100–200 mg）放入已标记的 13 ml 聚丙烯管中，管内含 4 ml 0.32 M HEPES 缓冲蔗糖溶液。将样品转移至 15 ml 锥形玻璃-聚四氟乙烯（Teflon）组织研磨器/匀浆器中，将电机调至 900 rpm（设置为 7），在 30 秒内匀浆 12 次。样品之间应使用不同的玻璃-聚四氟乙烯匀浆器，或在样品之间用冷蒸馏水冲洗匀浆器，并用无尘纸（Kimwipe）擦干。注意：最多可将 4 g 组织在 4 ml 0.32 M HEPES 缓冲蔗糖溶液中进行匀浆，但建议使用较少组织以确保适当的组分分离。
  2. 将匀浆后的样品转移回同一 13 ml 聚丙烯管中。保留 100 μl 匀浆液，于 -80 °C 保存，用于后续总蛋白组分的蛋白定量及蛋白质印迹（western blot）分析。

4. 低速离心去除核组分（获得上清液 S1）

  1. 将匀浆液在固定角转子中以 900 × g 在 4 °C 下离心 10 分钟。将上清液（S1）转移至一个新的、标记好的 13 ml 管中，并将核组分沉淀（P1）重悬于 500 μl 的 0.32 M HEPES 缓冲蔗糖溶液中。注意：（P1）组分可在 -80 °C 下保存，并用于核组分的蛋白质印迹分析。

5. 粗突触体组分的富集（获得沉淀 P2）

  1. 将上清液（S1）在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 15 分钟。移除上清液（S2），保留 500 μl 于微量离心管中，储存于 -80 °C，用于后续细胞质/轻膜组分的蛋白质定量和 Western 印迹分析。将剩余的粗突触体组分沉淀（P2）重悬于 1 ml 0.32 M HEPES 缓冲蔗糖溶液中，然后加入另外 3 ml 0.32 M HEPES 缓冲蔗糖溶液。
  2. 在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 15 分钟。移除上清液（S2’），保留 500 μl 于微量离心管中，储存于 -80 °C，用于后续细胞质/轻膜组分的蛋白质定量和 Western 印迹分析。将洗涤后的粗突触体沉淀（P2’）保存在聚丙烯管中。

6. 粗突触体组分的裂解（低渗休克）

  1. 在聚丙烯管中通过加入 1 ml ddH2O 重悬粗制突触体沉淀（P2’）以进行裂解。再加入 3 ml ddH2O，转移至玻璃-聚四氟乙烯组织匀浆器中，手动匀浆 3 次。注意：此步骤应尽快完成，并立即进入步骤 6.2。
  2. 将匀浆后的样品重新转移回同一支 13 ml 聚丙烯管中，迅速加入 16 μl 1 M HEPES 溶液，使样品中 HEPES 浓度恢复至 4 mM，倒置混匀。
  3. 在 4 °C 下旋转孵育样品 30 分钟，以确保完全裂解。

7. 突触体膜组分（P3）的富集

  1. 在 4 °C 条件下，以 25,000 x g 离心 20 分钟。移取粗制囊泡组分上清液（S3），收集至 5 ml 离心管中，并于 -80 °C 保存，用于后续蛋白质定量和蛋白质印迹分析。将突触体膜组分（P3）用 1 ml 0.32 M HEPES 缓冲蔗糖溶液重悬。

8. 不连续蔗糖梯度的制备

  1. 用移液器准确吸取 3.5 ml 的 1.2 M HEPES 缓冲蔗糖溶液，以及分别准确吸取 3.0 ml 的 1.0 M 和 0.8 M HEPES 缓冲蔗糖溶液，加入不同的 6 ml 带盖离心管中。注意：此步骤用于预先量取用于制备蔗糖梯度的缓冲液体积。精确量取体积对于确保最终梯度在超速离心时能够平衡至关重要。
  2. 使用玻璃巴斯德吸管和吸球，将 1.2 M HEPES 缓冲蔗糖溶液转移至 12 ml 聚碳酸酯超速离心管中。小心地将 1.0 M HEPES 缓冲蔗糖溶液铺加在 1.2 M HEPES 缓冲蔗糖溶液上方。最后，将 0.8 M HEPES 缓冲蔗糖溶液铺加在 1.0 M HEPES 缓冲蔗糖溶液上方。每种蔗糖溶液均需使用新的巴斯德吸管，并注意避免扰动蔗糖梯度。来自实验台涡旋振荡器或微量离心机的振动会破坏梯度的完整性。
  3. 使用巴斯德吸管，将重悬的突触体膜组分（P3）铺加在已制备的不连续蔗糖梯度上方。通过将梯度管放入摆桶转子吊桶中称重，确保梯度管之间保持平衡。如果吊桶不平衡，使用 P200 移液器小心地向梯度顶部添加 0.32 M HEPES 缓冲蔗糖溶液，以平衡转子吊桶。

9. 突触浆膜（SPM）的分级分离

  1. 在4 °C条件下，使用摆桶转子以150,000 × g超速离心2小时。小心地从超速离心管桶中取出蔗糖梯度液。使用18号针头和1 ml注射器，在1.0 M / 1.2 M HEPES缓冲蔗糖溶液的界面底部刺穿离心管，吸取突触浆膜层（SPM）。
  2. 记录每个SPM样品在1 ml注射器中所占的体积。将收集的SPM层转移至3.5 ml厚壁超速离心管中，加入精确为2.5倍体积的4 mM HEPES溶液，使蔗糖浓度从1.2 M调整至0.32 M。每个样品调整至0.32 M蔗糖浓度后，用0.32 M HEPES缓冲蔗糖溶液平衡离心管。
  3. 在4 °C条件下，使用固定角转子以200,000 × g超速离心30分钟。移除并弃去上清液。将突触浆膜沉淀（SPM）重悬于300 μl的50 mM HEPES / 2 mM EDTA溶液中。将样品储存于-80 °C，待后续用于Western印迹实验。

10. 突触后密度组分（PSD）的制备

  1. 将SPM样品置于冰上解冻。
  2. 配制含有0.54% Triton X-100的50 mM HEPES / 2 mM EDTA溶液。
  3. 在5 ml聚苯乙烯管中，加入2.7 ml Triton X-100/HEPES/EDTA溶液和300 μl SPM组分，于4 °C旋转孵育15分钟。
  4. 将样品转移至3.5 ml厚壁超速离心管中，于4 °C以32,000 x g离心20分钟。
  5. 保留上清液（Triton X-100可溶性组分[TS]），并于-80 °C保存。注意：此步骤的沉淀物代表“PSD-1T”组分。若进行第二次去垢剂处理，则可获得“PSD-2T”组分。如需获得PSD-1T组分，请继续进行步骤10.6。
    1. 为获得PSD-2T组分，将沉淀物重悬于3 ml含0.5% Triton X-100的50 mM HEPES / 2 mM EDTA溶液中，于4 °C旋转孵育15分钟。于4 °C以32,000 x g离心20分钟，然后继续进行步骤10.6。
  6. 弃去上清液，将突触后（PSD）沉淀物重悬于50 mM HEPES / 2 mM EDTA溶液中。注意：重悬体积可依据沉淀物大小而定，建议体积为50–75 μl。由于PSD组分为去垢剂不溶性组分，通常需加入1–2 μl 0.5% SDS以实现蛋白的完全重悬。样品可于-80 °C保存，直至用于Western blot检测。

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结果

蔗糖密度梯度的制备应实现三种摩尔浓度蔗糖溶液（0.8、1.0 和 1.2 M 蔗糖）的清晰分层。添加蛋白样品前的梯度示例见图3A。若梯度制备过早，或在因其他设备振动而产生震动的实验台面上操作，则梯度会受到破坏，无法实现有效分层。如果三种溶液之间未能观察到清晰的分层，建议在添加蛋白样品前重新制备新的梯度。添加蛋白样品后的蔗糖梯度示例如图3B所示（黑色箭头）。

离心后，各相界面处应出现清晰的蛋白质组分条带（0.32/0.8、0.8/1.0、1.0/1.2）。此外，管底应可见沉淀。超速离心后组分条带的示例见图3C。如果组分仅在相界面处弥散存在，则表明梯度可能已被破坏，不建议继续后续操作。

小鼠纹状体中总蛋白、SPM 和 PSD1T 蛋白样品的 Western 印迹检测方法演示 图2. 可通过上样等量蛋白质来可视化观察GluR1、PSD95和CaMKII等突触蛋白的富集情况（10 μg从总蛋白、SPM...

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讨论

该实验步骤中有多个环节对成功获得结果至关重要。在第3步中，每个样本需达到一致的匀浆程度。使用电动匀浆器处理组织时，不仅要保持研杵旋转速度恒定，还需控制匀浆次数恒定。低渗休克过程中的孵育时间必须精确，因为过度匀浆或在低渗溶液中孵育时间过长会导致线粒体破裂，从而污染突触小体纯化膜（SPM）样本。

另一个关键步骤是试剂的配制，尤其是蔗糖溶液；如果蔗糖溶液的摩尔浓度不正确，实验将无法成功。因此，蔗糖溶液应通过称量蔗糖，溶解于4 mM HEPES溶液中，然后用4 mM HEPES溶液定容至精确的最终体积来配制。故障排除提示：使用配制好的蔗糖溶液构建测试梯度，以确保梯度正确形成。向三种蔗糖溶液中的两种加入不同浓度的溴酚蓝（例如，终浓度为0.005%-0.02% w/v），以帮助观察到三个清晰的分层。

在密度梯度构建完成与离心管上机离心之间的时间应尽量缩短。随着时间推移，正常的扩散作用会破坏梯度结构，若梯度储存台面存在振动，这一过程将被加速。预先将溶液分装为若干独立等份，可使用玻璃巴斯德吸管精确移取所需体积，同时也能缩短密度梯度构建与超速离...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Mike Ehlers 博士及其实验室成员最初演示了突触浆膜亚细胞分级分离的实验方案。我们还感谢 Wendy Horsfall 对小鼠品系的管理工作。本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）运营基金（AJR 和 AS）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M HEPES，pH 7.4BioShopHEP003.100
HEPESBioShopHEP001.500 
蔗糖 BioShopSUC507.1
EDTABioBasicEB0185
PMSFBioShopPMS123.5
抑肽酶BioShopAPR600.1
亮抑蛋白酶肽BioShopLEU001.1
胃蛋白酶抑制剂BioShopPEP605.5
苯甲脒BioShopBEN601.25
氟化钠BioShopSFL001.100
焦磷酸钠BioShopSPP310.100
正钒酸钠BioShopSOV664.10
β-甘油磷酸BioShopGYP001.10
Triton X-100BioShopTRX506.500
18 G × 1 ½” 针头BD305196
1 cc 注射器BD309659
Kontes Duall 23 玻璃-聚四氟乙烯匀浆器VWRKT885450-0023
IKA Model RW 16 basic 搅拌器IKA Works2572100
Sorvall SM-24 固定角转子ThermoScientific29017
Sorvall RC 6 Plus 离心机ThermoScientific46910
薄壁聚烯烃管（13.2 ml）Beckman Coulter331372
SW 41 Ti 摆桶式转子Beckman Coulter331362
Beckman L-80 地面型超速离心机Beckman Coulter
厚壁聚碳酸酯管（3.5 ml）Beckman Coulter349622
TLA-100.3 固定角转子Beckman Coulter349481
Beckman TL-100 台式超速离心机Beckman Coulter

参考文献

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