本文详细介绍了通过在不连续蔗糖梯度中进行超速离心来富集与突触质膜相关的蛋白质。同时描述了突触后密度蛋白的后续制备方法。所获得的蛋白质样品适用于蛋白质印迹（Western blotting）或双向差异凝胶电泳（2D DIGE）分析。
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本文内容
摘要
摘要
神经元亚细胞分级分离技术可用于定量分析转运至突触及从突触转运出去的蛋白质。该方法最早于20世纪60年代末提出，通过蔗糖密度梯度超速离心法可分离与突触质膜相关的蛋白质。一旦分离出突触膜，由于突触后密度具有去垢剂不溶性，可进一步分离出被称为突触后密度的大型分子复合物。这些用于分离突触质膜和突触后密度蛋白的技术在40多年后基本保持不变，至今仍被现代神经科学研究广泛使用。本文详细描述了利用不连续蔗糖梯度分离与突触质膜及突触后密度相关蛋白的分级方法。所获得的蛋白质样品适用于蛋白质印迹（western blotting）或双向DIGE分析。
引言
神经元通过突触进行通信，而这种通信的质量在很大程度上受到突触处蛋白质组成变化的调控。特别是，位于突触后密度区的蛋白质通过将神经递质受体与其信号转导系统紧密地支架化，参与神经元间的通信1。此外，突触效能强度的持久性改变由突触后密度区受体的增加或移除所控制1-6。因此，分离和定量突触蛋白质是一种必要且有用的技术，有助于深入了解神经元如何响应刺激并调节突触效能7。本文描述了一种常用技术，即通过在不连续蔗糖梯度中进行超速离心，从啮齿类动物脑组织中分离突触蛋白质。可根据突触质膜组分在蔗糖中的密度（经验测定约为1.2 M蔗糖）对其进行富集和分离。
根据不同的生物学问题，亚细胞组分可通过连续或不连续的蔗糖或Percoll梯度进行分离。连续梯度可用于将蛋白质分离至多个组分中，这对于证明特定组分内蛋白质的共定位尤为有用8。然而，连续梯度的制备较为繁琐，且在许多应用中并非必需。相比之下，不连续梯度更易于制备，可用于将蛋白质分离为少数几个通常定义明确的组分。由三种摩尔浓度递增的蔗糖层组成的不连续梯度已被广泛用于分离与突触质膜（SPM）相关的蛋白质。通过去垢剂处理并分离去垢剂不溶性组分，可进一步将该突触质膜组分加工为突触后密度组分（PSD）。
当这一过程在20世纪60年代首次被描述时9,10，研究人员使用电子显微镜来观察大致界定突触质膜....
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方案
以下方案符合加拿大动物护理委员会的指南，并已获得多伦多大学医学院与药学院动物护理委员会的批准。
1. 按照表1所述配制所需试剂
- 根据表 1中列出的浓度，将蛋白酶和磷酸酶（如需要）抑制剂加入所有蔗糖溶液、缓冲液和ddH2O中。重要提示：所有步骤均需在4 °C下进行，实验开始前需预先冷却所有试剂和设备。使用永久性记号笔标记所有离心管，包括超速离心管。
2. 适当脑区的解剖
- 通过颈椎脱位或断头处死动物。饲养和实施安乐死应遵循机构和政府有关动物护理的政策。
- 迅速将脑组织从颅骨中取出，并置于预冷的解剖板上。
- 从新鲜组织中分离出相应脑区，进入第3步。
3. 使用电机驱动的玻璃-聚四氟乙烯匀浆器进行组织匀浆
- 将解剖的组织（SPM 为 50–100 mg，PSD 为 100–200 mg）放入已标记的 13 ml 聚丙烯管中，管内含 4 ml 0.32 M HEPES 缓冲蔗糖溶液。将样品转移至 15 ml 锥形玻璃-聚四氟乙烯（Teflon）组织研磨器/匀浆器中，将电机调至 900 rpm（设置为 7），在 30 秒内匀浆 12 次。样品之间应使用不同的玻璃-聚四氟乙烯匀浆器，或在样品之....
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结果
蔗糖密度梯度的制备应实现三种摩尔浓度蔗糖溶液（0.8、1.0 和 1.2 M 蔗糖）的清晰分层。添加蛋白样品前的梯度示例见图3A。若梯度制备过早，或在因其他设备振动而产生震动的实验台面上操作，则梯度会受到破坏，无法实现有效分层。如果三种溶液之间未能观察到清晰的分层，建议在添加蛋白样品前重新制备新的梯度。添加蛋白样品后的蔗糖梯度示例如图3B所示（黑色箭头）。
离心后，各相界面处应出现清晰的蛋白质组分条带（0.32/0.8、0.8/1.0、1.0/1.2）。此外，管底应可见沉淀。超速离心后组分条带的示例见图3C。如果组分仅在相界面处弥散存在，则表明梯度可能已被破坏，不建议继续后续操作。
小鼠纹状体中总蛋白、SPM 和 PSD1T 蛋白样品的 Western 印迹检测方法演示 图2. 可通过上样等量蛋白质来可视化观察GluR1、PSD95和CaMKII等突触蛋白的富集情况（10 μg从总蛋白、SPM.......
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讨论
该实验步骤中有多个环节对成功获得结果至关重要。在第3步中，每个样本需达到一致的匀浆程度。使用电动匀浆器处理组织时，不仅要保持研杵旋转速度恒定，还需控制匀浆次数恒定。低渗休克过程中的孵育时间必须精确，因为过度匀浆或在低渗溶液中孵育时间过长会导致线粒体破裂，从而污染突触小体纯化膜（SPM）样本。
另一个关键步骤是试剂的配制，尤其是蔗糖溶液；如果蔗糖溶液的摩尔浓度不正确，实验将无法成功。因此，蔗糖溶液应通过称量蔗糖，溶解于4 mM HEPES溶液中，然后用4 mM HEPES溶液定容至精确的最终体积来配制。故障排除提示：使用配制好的蔗糖溶液构建测试梯度，以确保梯度正确形成。向三种蔗糖溶液中的两种加入不同浓度的溴酚蓝（例如，终浓度为0.005%-0.02% w/v），以帮助观察到三个清晰的分层。
在密度梯度构建完成与离心管上机离心之间的时间应尽量缩短。随着时间推移，正常的扩散作用会破坏梯度结构，若梯度储存台面存在振动，这一过程将被加速。预先将溶液分装为若干独立等份，可使用玻璃巴斯德吸管精确移取所需体积，同时也能缩短密度梯度构建与超速离.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 Mike Ehlers 博士及其实验室成员最初演示了突触浆膜亚细胞分级分离的实验方案。我们还感谢 Wendy Horsfall 对小鼠品系的管理工作。本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）运营基金（AJR 和 AS）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M HEPES，pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| 蔗糖 | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| 抑肽酶 | BioShop | APR600.1 | |
| 亮抑蛋白酶肽 | BioShop | LEU001.1 | |
| 胃蛋白酶抑制剂 | BioShop | PEP605.5 | |
| 苯甲脒 | BioShop | BEN601.25 | |
| 氟化钠 | BioShop | SFL001.100 | |
| 焦磷酸钠 | BioShop | SPP310.100 | |
| 正钒酸钠 | BioShop | SOV664.10 | |
| β-甘油磷酸 | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18 G × 1 ½” 针头 | BD | 305196 | |
| 1 cc 注射器 | BD | 309659 | |
| Kontes Duall 23 玻璃-聚四氟乙烯匀浆器 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 basic 搅拌器 | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 固定角转子 | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus 离心机 | ThermoScientific | 46910 | |
| 薄壁聚烯烃管（13.2 ml） | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti 摆桶式转子 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 地面型超速离心机 | Beckman Coulter | ||
| 厚壁聚碳酸酯管（3.5 ml） | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 固定角转子 | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 台式超速离心机 | Beckman Coulter |
参考文献
- Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
- Wang, Q., et al.
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重印与许可
