本文描述了一种研究与酒精相关的环境背景触发大鼠酒精寻求行为复现能力的实验方法。
本文内容
摘要
摘要
滥用药物的使用环境可引发渴求感，这是一种主观的巴甫洛夫条件化反应，可能促进觅药行为，并导致戒断中的药物使用者复吸。我们已建立一种实验程序，用于研究在大鼠中环境背景对酒精觅求行为影响的行为学与神经机制。在适应了在居住笼内饮用15%乙醇的味道及其药理作用后，雄性Long-Evans大鼠在条件化实验箱中接受巴甫洛夫辨别训练（PDT）。在每个每日（周一至周五）的PDT训练阶段中，分别呈现两种不同的10秒听觉条件刺激，每种各16次。在其中一种刺激（CS+）期间，向液体入口输送0.2 ml的15%乙醇，供动物口服摄入；另一种刺激（CS-）则不伴随乙醇给予。随着训练进行，大鼠在CS+期间进入液体入口的次数逐渐增加，而在CS-期间的进入次数则稳定在较低水平，表明CS+与乙醇之间形成了预测性关联。在每次PDT训练中，每个实验箱均配备特定的视觉、嗅觉和触觉背景刺激组合。PDT训练结束后，在同一实验箱中进行消退训练，但此时更换为另一组不同的背景刺激组合。CS+和CS-仍如前所述呈现，但不再提供乙醇，导致在CS+期间的入口次数逐渐减少。在测试阶段，将大鼠重新放回PDT训练时的背景环境中，并再次呈现CS+和CS-，但不给予乙醇。该操作会显著且特异性地增加在预示酒精出现的CS+期间的入口次数，而在CS-期间的行为反应则无变化。这一现象被称为“情境诱导的恢复”（context-induced renewal），说明与酒精摄入相关联的情境具有强大能力，可在巴甫洛夫式酒精线索作用下激发酒精觅求行为。
引言
保持清醒是酒精滥用障碍患者面临的一项重大挑战。戒断期间，个体容易受到与饮酒行为通常相伴的环境刺激所产生的行为、心理和生理影响，这些刺激通过巴甫洛夫条件反射作用，可能与醉酒状态形成关联1,2。接触预示酒精出现的线索可引发条件化反应，例如对酒精的渴求，这种渴求可能促发寻酒行为，从而增加复饮的风险3,4。
导致饮酒行为的刻板序列可能会使某些类型的刺激总是在酒精摄入的药理作用发生之前被反复体验。例如，酒精的视觉、气味和味道是可靠地预示着醉酒的感官特性。除了这类被称为“离散性”或“近端性”的提示外，药物经常被使用的环境背景也可能引发渴求5,6。因此，接触过去曾使用过药物的物理场所可能成为复吸的关键诱因7。
已开发出动物模型，用于研究介导与药物相关环境对觅药行为影响的神经机制8-13。本文所述方法可用于探究与酒精摄入相关的环境如何调节由特定的、可预测酒精出现的巴甫洛夫线索所诱发的觅酒行为。
在特定的环境背景下进行经典条件反射辨别训练，训练大鼠在行为上区分两种听觉条件刺激：一种与酒精配对的 CS+，以及一种不与酒精配对的 CS−。随后在不同的环境中进行消退训练，由于未给予酒精，动物对 CS+ 的反应逐渐减少。之后，当大鼠重新暴露于与酒精相关的经典条件反射训练环境时，由 CS+ 诱发的觅酒行为会出现选择性增强，而对 CS− 的反应则无变化。该结果已被我们多次重复验证9,14-16，并扩展了关于工具性条件反射的研究发现，即与药物相关的环境可促进与药物给予相关的操作性反应的恢复10,13。
方案
所有实验程序均经康考迪亚大学动物研究伦理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会的建议。
1. 动物
- 获取雄性 Long-Evans 大鼠（到货时体重为 220 – 240 g）。
- 将大鼠饲养于温度（21 °C）和湿度（44%）可控的动物饲养设施中，保持 12 小时光照-黑暗循环，光照时间为早上 7:00 开始。
- 大鼠到货后成对饲养。3 天后，将大鼠单独饲养于塑料鞋盒式笼具中，垫料使用 beta-chip，提供尼龙啃咬骨，并可自由获取标准大鼠饲料和饮水。使用带有双密封圈的笼盖，以便后续除水瓶外还可放置第二个瓶子。注：大鼠到动物饲养设施后也可立即开始单只单独饲养。
- 开始每天对大鼠进行抓取操作。注：一般而言，一周的抓取操作通常足以使大鼠适应被实验人员抓取和接触。
2. 在家笼中进行间歇性乙醇摄入
注意：在实验的行为训练阶段开始之前，需在大鼠的饲养笼内进行间歇性乙醇接触，以确保大鼠摄入生理学相关剂量的乙醇17-19。该操作可在光照期开始，尽管也可在光照期或黑暗期的任何时间启动。
- 为每只大鼠准备两个瓶子。
- 使用一个100 ml的塑料量筒作为乙醇瓶，一个473 ml的标准塑料水瓶作为水瓶。使用容量相对较小的乙醇瓶，并几乎装满至最大容量，以尽量减少因泄漏和蒸发造成的乙醇损失。
- 用自来水稀释95%乙醇，配制15%乙醇溶液，并将其中一个瓶子装满该溶液。注：也可使用其他浓度的乙醇（如10%或20%）替代15%乙醇。
- 将第二个瓶子装满自来水。
- 在每个瓶子中插入带有钢珠饮水管的橡胶塞，以减少泄漏。
- 设置两个对照笼，其处理方式与动物居住笼完全相同，唯一区别是对照笼中不放置大鼠或垫料。
- 按照步骤2.1.1–2.1.4所述方法为对照笼准备乙醇瓶和水瓶。
- 利用对照笼获得的数据，校正在整个乙醇可接触期间可能发生的液体洒漏和/或蒸发（具体见步骤2.8.1–2.8.2）。
- 称量所有乙醇瓶和水瓶的重量，并记录所有数据。
- 称量所有大鼠的体重，并记录所有数据。
- 在同一时间将乙醇瓶和水瓶分别放置于每只大鼠的居住笼及各对照笼上。两瓶均在笼上保留24小时。
- 24小时结束后，同时从各笼上移除两个瓶子。
- 再次称量所有乙醇瓶和水瓶的重量，并记录所有数据。
- 为确定在24小时内消耗的乙醇和水量，将每只大鼠居住笼中瓶子移除时的重量，从24小时前放置时的初始重量中减去。
- 对两个对照笼进行同样操作，然后计算每种液体的平均洒漏量。
- 分别从每只大鼠对应的乙醇和水消耗量中减去相应的平均洒漏量。
- 使用经洒漏校正后的差值计算乙醇消耗量（g/kg）、水消耗量以及乙醇偏好度。
- 为计算乙醇消耗量（g/kg），首先根据溶液总密度（乙醇+水组分）将消耗的乙醇溶液重量（g）换算为体积（ml），换算公式为：体积（ml）= 重量（g）/ 密度（g/ml）。注：溶液密度随乙醇浓度变化而变化。
- 接着，将消耗的乙醇溶液体积（ml）乘以所用特定浓度乙醇的密度（g/ml），得到实际消耗的乙醇重量（g）。
- 将大鼠消耗的乙醇重量（g）除以其体重（kg），得到乙醇消耗量（g/kg）。
- 为计算乙醇偏好度，将乙醇摄入量（ml）表示为总液体摄入量（乙醇+水，ml）的百分比。
- 仅将水瓶放回大鼠的居住笼。在接下来的24小时内，仅提供饮水，不提供乙醇。此时，在居住笼上放置一个预先称重的第二个水瓶，代替乙醇瓶。
- 24小时结束后，同时从笼中移除两个水瓶。
- 称量两组水瓶的重量，并记录所有数据。
- 将每个水瓶移除时的重量从其24小时前放置时的重量中减去，并如步骤2.8.1–2.8.2所述，扣除来自对照笼的平均洒漏量。
- 使用经洒漏校正后的差值计算水的消耗量。
- 按照步骤2.1至2.14所述方法，再次向大鼠提供乙醇瓶和水瓶，开始下一个循环。
- 重复此循环多个（约12个）周期，以诱导产生高水平且稳定的乙醇摄入。代表性结果参见图1中居住笼内乙醇消耗量（g/kg）的变化。
- 在不同周期中交替乙醇瓶和水瓶在笼盖上的空间位置，以防止形成位置偏好。
- 每周配制一次新鲜乙醇溶液，以确保各周期间乙醇浓度的准确性和稳定性。此方法可最大限度降低长时间放置导致的乙醇蒸发影响。
3. 仪器
- 将每个条件化实验箱放置于通风、隔音的隔间内。
- 每个 条件化实验箱由不锈钢金属栅栏地板、透明聚碳酸酯顶盖、透明聚碳酸酯后壁和前门，以及铝制金属侧板构成。
- 在右侧金属侧板靠近底部中央位置安装一个液体入口。在液体入口处配备一个红外光电传感器，用于检测动物进入该入口的行为。
- 从液体入口后部连接聚乙烯管至一个装有乙醇的20 ml注射器，使用钝头针连接。将注射器放入位于隔音隔间外的注射泵中。在进行经典条件化辨别训练前，将乙醇装入注射器并放入泵中。通过手动推进泵来预充填管路，然后用纸巾擦去液体入口处多余的乙醇。
- 在左侧侧板靠近顶部中央位置安装一个白色舱内灯。
- 在左侧侧板的左上角安装一个点击器（2 Hz循环）和一个带扬声器的白噪声发生器。
- 为每个条件化实验箱配备特定的视觉、嗅觉和触觉刺激组合，以构建独特的实验环境。
- 使用两种不同的环境，分别命名为环境1和环境2。将一半的条件化实验箱设置为环境1，另一半设置为环境2。
- 构建环境1时，在实验箱的顶盖、前壁和后壁上覆盖黑色纸板，在培养皿中喷入柠檬气味（10% v/v，通过将柠檬油用自来水稀释制得），并将培养皿置于箱体下方金属废物托盘中央位置，并在金属栅栏地板上插入一块透明聚碳酸酯地板板。在废物托盘内铺上吸水纸巾或实验台防护垫。
- 构建环境2时，保持实验箱的顶盖、前壁和后壁不加覆盖，使其保持透明，将杏仁气味（10% v/v，通过将苯甲醛用自来水稀释制得）喷入培养皿并置于箱体下方金属废物托盘中央位置，并在金属栅栏地板上插入一块带孔金属地板板。在废物托盘内铺上吸水纸巾或实验台防护垫。
4. 习惯化
使大鼠适应行为训练室以及条件化箱内的两种不同环境。在此实验阶段，不要将乙醇装入20 ml注射器中。
- 通过两次短暂的适应性训练，使大鼠适应从动物饲养设施转移到实验室行为训练室的过程。
- 在第一次训练中，将大鼠连同其居住笼装载到动物饲养设施内的带轮推车上，运送至实验室的行为训练室。打开房间照明，开启每个隔音箱内的风扇，离开房间并关闭房门，让大鼠在推车上的居住笼中适应这一新环境20分钟。20分钟结束后，将大鼠送回动物饲养设施。
- 在第二次训练中，将大鼠运送至实验室的行为训练室。与之前相同，保持房间照明和隔音箱风扇开启。实验人员留在房间内，关闭房门以尽量减少干扰，在行为训练室内逐一抓取并称量每只大鼠的体重。记录体重数据后，将大鼠送回动物饲养设施。
- 通过两次短暂的适应性训练，使大鼠适应条件化实验箱环境。
- 将大鼠运送至行为训练室，记录每只大鼠的体重，并将其分别放入指定的条件化实验箱中。
- 在第一次适应性训练中，将一半的实验箱设置为情境1（Context 1），其余设置为情境2（Context 2）。
- 在第二次适应性训练中，将每个实验箱设置为上一次训练中未使用的情境。
- 采用交叉平衡的方式进行适应性训练，即一半大鼠先暴露于情境1，随后暴露于情境2，另一半则先暴露于情境2，随后暴露于情境1。理想情况下，两次适应性训练应在同一天完成，必要时也可分两天进行。
- 在适应性训练期间，使用计算机程序控制，在程序启动1分钟后 开启箱内照明灯。记录大鼠在20分钟训练期间进入液体入口的总次数。训练结束时，通过程序关闭照明灯。在适应性训练期间，不提供乙醇或任何提示性刺激。
- 将大鼠从实验箱中取出，放回其居住笼，并运回动物饲养设施。
- 清洁设备（例如，地板板、废物托盘、培养皿）。更多细节请参见步骤5.7。
5. 经典条件反射辨别训练（PDT）
训练大鼠在行为上区分两种听觉线索：一种与乙醇配对，另一种不与乙醇配对。在此实验阶段，用15%乙醇填充20 ml注射器。
- 根据步骤 3.3.2 和 3.3.3 的描述，为每个条件化腔室配置特定的视觉、嗅觉和触觉刺激，以创建独特的环境背景。
- 根据大鼠在家庭笼乙醇获取程序最后两个阶段中乙醇消耗量和偏好的平均值，以平衡方式将一半大鼠分配至情境 1，另一半分配至情境 2。将 PDT 期间使用的情境称为情境 A。注意：每只大鼠在此训练阶段仅应经历一种情境。
- 确保嗅觉刺激是最后添加到每个条件化腔室的环境刺激。关闭腔室门和隔音箱门，以限制嗅觉刺激扩散，并尽量减少不同气味之间的混合。
- 将大鼠带入行为训练室，记录每只大鼠的体重，并将其放入指定的条件化腔室中。
- 启动控制每次 PDT 实验阶段事件序列的计算机程序。
- 程序启动 5 分钟后，点亮笼内灯。
- 白噪声刺激和滴答声刺激各呈现 16 次。在两种情境中以平衡方式指定其中一种听觉刺激为条件刺激+（CS+），另一种为条件刺激-（CS-）。
- 使每次 CS+ 和 CS- 刺激持续 10 秒。
- 在 CS+ 的最后 6 秒内向液体入口输送 0.2 ml 乙醇。在 CS- 期间不输送任何乙醇。
- 每次 PDT 实验阶段平均持续 58 分钟。CS+ 和 CS- 均按照可变时间间隔 67 秒的程序进行呈现。
- 记录在 CS+ 和 CS- 呈现期间，CS 刺激间隔内的液体入口次数（CS 呈现期间的 10 秒）、CS 前间隔内的入口次数（CS 开始前立即的 10 秒）以及 CS 后间隔内的入口次数（CS 结束后立即的 10 秒），同时记录整个实验阶段的总液体入口次数。此外，记录在这些时间段内每次入口的持续时间。
- 实验阶段结束时，关闭笼内灯。
- 将大鼠从腔室中移出，放回其家庭笼中，并送回动物饲养设施。
- 检查液体入口，确保大鼠消耗了每次 PDT 实验阶段提供的 3.2 ml 乙醇。
- 使用装有少量水的 60 ml 注射器冲洗聚乙烯管路中的乙醇。然后，使用第二个空注射器向管路中通入 60 ml 空气，确保管路干燥。
- 清洁设备。日常清洁时，清洗地板板、废物托盘和培养皿。每周清洁一次整个条件化腔室。请勿使用有香味的清洁产品，以免将不必要的气味引入实验装置。
- 持续每日进行 PDT 实验阶段，直到大鼠对 CS+ 与 CS- 的入口反应表现出稳定的辨别能力。注意：对 CS+ 的入口次数应随实验阶段增加，而对 CS- 的入口次数应保持较低水平。实现可辨别条件反应所需的 PDT 实验阶段确切次数可能有所不同，但作为参考，计划约 20 次实验阶段。
6. 灭绝
- 为每个条件化室配备视觉、嗅觉和触觉刺激，以创建一个与大鼠在PDT阶段所经历的环境不同的背景。例如，如果在PDT中使用了情境1，则在消退阶段将条件化室设置为情境2。将消退阶段使用的情境称为情境B。
- 消退阶段的操作程序与PDT阶段完全相同，但在CS+呈现期间不给予任何乙醇。
- 使用在PDT阶段所用的同一计算机程序来呈现CS+和CS-。
- 为了保持实验各阶段之间的一致性，将一个空注射器装入注射泵中，并保持泵处于开启状态。确保聚乙烯管路在消退阶段开始前不含乙醇。
- 每日持续进行消退训练，直到大鼠对CS+和CS-的反应不再表现出可区分的差异为止。注意：在消退阶段中，对CS+引发的端口进入次数应逐渐减少，直至其与对CS-引发的端口进入次数之间无显著差异。完全消除条件化反应所需的消退训练次数可能有所不同，但一般可参考约8次作为指导。
- 每次训练结束后，按照步骤5.7所述方法清洁设备。
7. 情境诱导的恢复测试
- 为每个条件化箱室配备视觉、嗅觉和触觉刺激，以重现PDT阶段期间所经历的环境背景。例如，如果某只大鼠在PDT阶段中经历的是背景环境1，则在测试阶段将其箱室配置为背景环境1。将用于恢复测试的背景环境称为背景环境A。
- 进行背景环境诱导的恢复测试，其流程与PDT阶段完全相同，但在恢复测试期间不给予任何乙醇。在测试期间像PDT阶段一样呈现
CS+ 和 CS-，但不给予乙醇。- 使用与PDT阶段相同的计算机程序来呈现CS+和CS-。
- 为保持各阶段之间的一致性，将空的注射器装入注射泵中，并保持泵处于开启状态。确保测试开始前聚乙烯管路中不含乙醇。
- 观察经典条件化饮酒寻求行为的背景环境诱导恢复效应。注：该恢复效应表现为对CS+引发的探口进入次数选择性增加，而对CS-引发的探口进入行为无明显变化，与消退训练结束时的CS+和CS-反应相比可明显看出。
- 在测试阶段结束后，按照步骤5.7所述方法清洁设备。
结果
在饲养笼中进行间歇性乙醇摄入：在饲养笼中进行间歇性乙醇摄入期间，乙醇消耗量（g/kg）和乙醇偏好随实验次数增加而上升，通常在8–12次实验后达到稳定水平（图1）。在图1所示的数据集中，个体大鼠在饲养笼中乙醇摄入阶段最后两次实验的平均稳定乙醇消耗量介于1.33–6.44 g/kg之间。当g/kg摄入量达到平台期，并且大鼠在多次实验中维持在此稳定饮酒水平时，即可停止实验的饲养笼乙醇摄入阶段。
为分析此阶段的数据，需针对乙醇摄入量（g/kg）和乙醇偏好分别进行独立的重复测量方差分析（ANOVA），以会话作为被试内因素。
情境诱导恢复过程的示意图：实验过程的每个阶段（PDT、消退、恢复测试）均在图2中展示。详见图注。
反应测量与数据分析：在下述所有行为阶段中，对条件刺激 CS+ 和 CS- 期间的探口进入反应均以 CS 前基线期的探口进入反应为参照进行标准化。为获得标准化的 CS 测量值，需用 CS+ 和 CS- 呈现期间的探口进入次数减去 CS 前基线期（CS 起始前 10 秒）内的探口进入次数。标准化后的 CS+ 和标准化后的 CS- 测量值可作为特异性由 CS 呈现所引发的行为指标，反映超出基线水平的行为变化。
对PDT阶段和消退阶段分别进行重复测量方差分析，组内重复因素为会话（session）和条件刺激类型（CS+ 与 CS-）。为比较不同阶段（PDT、消退、再巩固测试），采用重复测量方差分析，数据取PDT和消退阶段最后两次会话的平均值以及再巩固测试阶段单次会话的数据。对于显著的主效应和交互作用，进行后续分析时使用 事后检验 独立样本或配对样本的 t 检验，经多重比较校正。显著性标准设定为 α = 0.05。
PDT：在PDT训练过程中，对CS+的端口进入反应随着训练次数的增加而上升，而对CS-的端口进入反应则整体保持在较低且稳定的水平。需要注意的是，在PDT训练的早期阶段，对CS-的端口进入反应可能会略有上升；然而，由CS-引发的端口进入行为最终会稳定在一个远低于CS+引发反应的水平。CS+期间的端口进入次数显著高于CS-期间，且差异具有统计学意义，表明动物已成功形成辨别能力（图3）。该结果说明，巴甫洛夫式条件反射诱导的酒精寻求行为已针对CS+建立，而对CS-则未建立。
消退：在消退训练过程中，对条件刺激+（CS+）的探鼻反应逐渐减少。在消退训练期间，对条件刺激-（CS-）的探鼻反应始终保持在较低且稳定的水平。理想情况下，在消退训练结束时，辨别性反应应被完全消除，表现为对CS+和CS-的探鼻反应之间无统计学显著差异。然而，在消退训练结束时仍保留一定程度的辨别性反应也并不罕见。在此情况下，重要的是需验证消退训练结束时对CS+的探鼻反应显著低于消退训练开始时以及PDT结束时对CS+的探鼻反应（图3）。该结果模式表明，巴甫洛夫条件化驱动的酒精寻求行为已得到显著消退。
情境诱导的复现测试：在情境诱导的复现测试中，动物对条件刺激+（CS+）的探鼻次数相较于消退训练末期显著增加。这种增加具有选择性，因为对条件刺激-（CS-）的探鼻次数保持不变。此外，在情境诱导的复现测试中，对CS+的探鼻次数在统计学上显著高于对CS-的探鼻次数（图4）。对消退阶段与测试阶段之间CS+探鼻次数的统计比较，以及测试阶段内CS+与CS-探鼻次数的统计比较，共同表明：在测试时，由与酒精相关的环境诱发了巴甫洛夫条件性觅酒行为的选择性复现。
图1. 在饲养笼内间歇性乙醇接触诱导的乙醇摄入量和偏好的递增。 平均值 ± 标准误 (A) 乙醇摄入量（g/kg）和 (B) 在饲养笼内进行12次间歇性乙醇接触期间的乙醇偏好。这两项指标通常随实验次数增加而上升，随后趋于稳定。个体大鼠在饲养笼内乙醇接触最后两次实验中的平均稳定摄入量范围为1.33 – 6.44 g/kg。这些数据来自雄性Long-Evans大鼠饮用15% (v/v) 乙醇的实验结果。
图 2. 实验流程示意图。 该实验流程包括三个阶段：经典条件反射辨别训练（PDT）、消退训练和情境诱导的复现测试。在每次PDT训练阶段，大鼠接受16次一种提示乙醇递送的听觉条件刺激（CS+）和16次另一种不提示乙醇递送的听觉刺激（CS-）。PDT训练在情境A中进行，该情境由特定的视觉、嗅觉和触觉刺激组合构成。消退训练在情境B中进行，该情境包含与情境A不同的视觉、嗅觉和触觉刺激组合，期间呈现CS+和CS-，但不给予乙醇。在情境诱导的复现测试中，大鼠被重新放回情境A，并再次呈现CS+和CS-，但不给予乙醇。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 乙醇辨别性巴甫洛夫条件反应的获得与消退。 在情境A中进行辨别性条件训练（PDT，第1–18次会话）期间，以及在情境B中进行消退阶段（第19–26次会话）期间，CS+和CS−呈现过程中大鼠标准化的端口进入次数（均值±标准误）。这些数据来源于雄性Long-Evans大鼠，采用10%（v/v）乙醇作为非条件刺激（US），在PDT期间与CS+配对呈现。*p <0.05，CS+与CS−比较。该图最初发表于Chaudhri, Sahuque, & Janak（2008）。经Elsevier许可使用。
图4. 乙醇巴甫洛夫条件化反应的情境诱导恢复。 在情境A中进行提示辨别训练（PDT）阶段、情境B中进行消退阶段以及情境A中进行恢复测试阶段，大鼠在条件刺激+（CS+）和条件刺激-（CS-）期间的平均±标准误（SEM）标准化端口进入次数。数据为PDT和消退阶段最后两次会话的平均值；恢复测试为单次会话。这些数据来自使用雄性Long-Evans大鼠的实验，其中以10%（v/v）乙醇作为非条件刺激（US），在PDT期间与CS+配对呈现。*p <0.05；**p <0.001，CS+ 与 CS- 比较。#p <0.05，CS+ PDT 与 CS+ 消退比较。^p <0.05，CS+ 消退与 CS+ 测试比较。该图最初发表于Chaudhri, Sahuque, & Janak（2008）。经Elsevier许可使用。
讨论
本实验结果表明，通常伴随酒精给予的特定环境刺激能够获得驱动饮酒寻求行为的能力。同时，结果还证明，与先前酒精可获得性或不可获得性相关的背景刺激，能够引导个体对特定预示酒精的线索产生条件化的行为反应。
方案中的关键步骤
本任务中的情境包含来自大鼠外部的刺激。然而，测试时大鼠的内感受状态也可构成一种能够影响复现的“情境”20。因此，重要的是应让大鼠对复现测试前可能进行并改变其内感受状态的操作（如颅内微量注射或系统性注射）进行习惯化。此外，对颅内微量注射或系统性注射的习惯化应在消退训练和PDT阶段之前均进行，以防止这些操作与实验的某一特定阶段形成关联。
时间参数（如条件刺激持续时间、条件刺激-非条件刺激间隔以及试次间间隔）长期以来已知会影响多种条件化范式中的条件反应21-26。类似地，这些时间参数可能会影响本实验流程中再现效应的观察。除本方案中明确指定的参数外，任何其他参数组合均应在开展大规模研究前，通过预实验进行验证。
修改与故障排除
既往研究发现，大鼠在饲养笼中摄入的乙醇量可能因其购买来源供应商的不同而有所差异17,27。因此，供应商是本研究阶段需要重点考虑的因素。同样，大鼠品系的选择也应慎重，因为已有大量报道显示不同品系在乙醇摄入量上存在差异28-31。
在厌恶性条件反射范式中的先前研究表明，大鼠的发育年龄会影响巴甫洛夫条件性恐惧反应恢复现象的观察结果32。有研究认为，幼龄大鼠（出生后20天以内）缺乏恢复效应可能是由于对情境信息的编码能力受损所致33。因此，在本实验程序中应考虑所使用大鼠的发育年龄。
当在实验的家笼乙醇接触和PDT阶段使用10%9,16、15%14或20%15乙醇溶液时，已观察到巴甫洛夫条件性酒精寻求行为的恢复。研究人员可在其实验室中建立该实验流程时选用上述任一浓度的乙醇。
在进行经典条件分辨训练（Pavlovian discrimination training）期间，每次训练结束后需检查液体入口，以确保所有递送的乙醇均已被摄入。在训练初期，可将大鼠在条件箱中额外保留10至15分钟，以促进其摄入训练期间未饮完的乙醇。随着分辨训练的推进，未能完全摄入乙醇的大鼠数量应逐渐减少。若在分辨训练结束时，大鼠仍存在（a）未能完全摄入乙醇和/或（b）对条件刺激+（CS+）无反应的情况，则应将这些动物从研究中剔除。大多数大鼠对CS+的反应显著高于对CS-的反应。然而，部分大鼠可能对两种刺激均表现出较高水平的反应，因而未显示出分辨能力。在分辨训练期间对CS+和CS-均表现出高反应水平的大鼠不应被剔除。根据我们的经验，这些动物在无乙醇条件下进行的首次消退训练中会表现出显著的分辨行为，提示其在分辨训练期间对CS-的高反应水平是由液体入口中乙醇的存在所驱动的。这些动物通常也会表现出明显的复现效应。
该操作步骤的局限性
由于复现测试是在无乙醇的条件下进行的，由条件刺激 CS+ 引发的条件化端口进入行为会随着测试过程的进行而逐渐减少。因此，可用于评估实验干预所引起变化的整体行为水平相对较低。由于在此任务中，测试开始阶段的行为反应通常高于结束阶段，因此有必要逐次试验地考察实验处理对条件化反应的影响。
进入液体接收口的行为是本实验的主要依赖性测量指标。然而，如果动物靠近液体接收口，其胡须可能触破液体端口开口处的红外光束，从而记录为一次错误的端口进入。尽管此类错误反应并不常见，但会明显表现为端口总进入次数相较于受试动物先前实验阶段行为的急剧增加。对动物进行录像有助于发现可能的错误反应，并允许对大鼠在整个训练和测试过程中表现出的行为进行更精细的分析。
该技术相对于现有/替代方法的重要性
通过工具性条件任务研究情境诱导的觅药行为恢复，其中主要的因变量是操作性反应，例如压杆8,34或鼻触12。在本实验流程中，觅药反应表现为对液体给药口的“条件性接近”，该反应由条件刺激（CS+）的呈现所诱发。这种反应可能通过经典条件反射学习获得，而经典条件反射正是介导人类环境中刺激与滥用药物药理作用之间形成关联的学习过程。
未来应用
该任务可与神经药理学、光遗传学和神经化学方法结合使用，以研究参与情境诱导的巴甫洛夫条件性酒精寻求行为恢复的神经机制16。此外，还可用于探究调节巴甫洛夫条件性酒精寻求行为的习得与消退的行為和神经机制。最后，该任务可用于探索对消退过程的干预手段，以防止行为恢复，这对于转化研究具有重要意义，旨在减少药物相关环境线索对人类成瘾者在接受线索暴露治疗后对药物预测性线索反应性的影响。
披露
所有实验程序均经康考迪亚大学动物研究伦理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会的指导方针。本文的开放获取出版由Med Associates Inc. 赞助实现。
致谢
本研究工作得到了美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（资助号：RO1 AA014925，授予美国加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学 Patricia H. Janak 博士）、魁北克健康研究基金会（NC）以及自然科学与工程研究理事会（NC，资助号：387224-2010）的支持。本文的开放获取出版得益于Med Associates Inc.的赞助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 重型多功能推车 | Rubbermaid | #4520-88 | 用于将大鼠连同其饲养笼从饲养室运送至行为学实验室或其他设施 |
| 大鼠，Long-Evans | Harlan | 大鼠到达时体重为220-240 g | |
| Ohaus 天平 | Fisher | #S402421 | 用于称重大鼠；先将塑料容器底部去皮归零，然后将大鼠放入容器中进行称重 |
| β-芯片，山杨 | Harlan | #7090A | 家庭笼具垫料 |
| Nylabone | Bio-Serv | #K3580 | 家庭笼具中提供的丰富化环境 |
| 可高压灭菌的啮齿类动物饲料 | 阿格瑞品牌，查尔斯河 | #5075 | 用于喂养大鼠 |
| 金属丝栏杆笼盖 | Ancare | #R20SS2B | 定制设计，带有两个插槽 瓶子 |
| 笼底 | Ancare | #R20PC | 饲养大鼠 |
| 塞子 | Ancare | #8.5 | 用于堵塞水瓶开口的橡胶塞 &和量筒；与圆珠吸管配套使用 |
| 圆珠点样管，1.5" 长度 | Ancare | #TD-99 | 插入瓶塞中，使大鼠能够从水瓶和量筒中饮水 |
| 水瓶 | Ancare | #FSPC8HT | 473 ml（16 oz）容量，需用塞子封闭 |
| 量筒，100 ml | Fisher | #0300741 | 用于在家庭笼具中进行酒精暴露时盛装乙醇；需剪掉带嘴端，以便用塞子封闭 |
| Mettler 天平 | Mettler Toledo | #MS6001S | 用于称量水瓶和乙醇瓶 |
| 聚乙烯管，1/32" 内径， 1/32" 壁厚，3/32" 外径 | Fisher | #14-169-1A | 将20 ml乙醇注射器连接至液体端口 |
| 18号针头，1.5英寸" 长度 | Fisher | #B305199 | 将聚乙烯管连接至乙醇注射器；需要进行打磨处理 |
| 20 ml 注射器，鲁尔锁扣式，非无菌 | Fisher | #1482316J | 用于在液体泵中盛装乙醇；需通过18 G 1 1/2针头连接聚乙烯管 |
| 60 ml 注射器，鲁尔锁扣式，非无菌 | Fisher | #14-820-11 | 光动力治疗（PDT）疗程后冲洗聚乙烯导管 |
| 单速注射泵，3.33 转/分钟 | Med Associates Inc. | #ENV-018MD | 用于固定20 ml乙醇注射器并输送乙醇 |
| 液体端口 | Med Associates 公司 | #ENV-254-CB | 为在光动力治疗（PDT）期间实现乙醇输送；通过聚乙烯管路连接至乙醇注射器 |
| 端口进入式红外探测器 | Med Associates 公司 | #ENV-215M | 固定于两侧 流体端口；每个流体端口需要2个 |
| Houselight，28 V，100 mA | Med Associates Inc. | #ENV-135M | 为条件化室提供常规照明 |
| 点击器模块 | Med Associates 公司 | #ENV-225SM | 用于条件化室的听觉刺激 |
| 带有扬声器的白噪声发生器 | Med Associates Inc. | #PHM-100 | 用于条件化室的听觉刺激 |
| 吧台地面 | Med Associates 公司 | #ENV-009A-GF | 与模块化测试室配套使用 |
| 实验服，吸水性 | VWR | #89126-790 | 用于金属托盘中的吸水纸，需裁剪至适合托盘大小 |
| 聚碳酸酯板，1/8" 厚，12-5/8" ×10" | 约翰斯顿塑料公司 | #30102515 | 用于情境1的光滑透明地板嵌板制作。需切割为11.5" × 12.25" 片 |
| 铝板穿孔，0.063" 厚，48" × 96", 0.250" 孔径 × 0.375" 中心 | Anica Steel | 用于情境2的带孔地板插件制作。需切割为11.5" × 12.25" 碎片 | |
| 黑色纸板，0.053" 厚，28" × 44" | Omer DeSerres | #P1909 | 在情境1中，用于构建条件箱天花板、门和后墙的面板需要裁切成合适尺寸。每个条件箱需要三个面板，尺寸约为11.5" x 13.25"面板可通过较窄的一侧使用胶带连接。 |
| 通用型强力胶带，1.88" 45码 | Duck Tape | 用于连接黑色纸板面板的粘合材料，这些纸板用于覆盖情境1中的后墙、天花板和门。 | |
| 模块化测试室 | Med Associates 公司 | #ENV-009A | 条件化室 |
| 隔音消声舱 | Med Associates 公司 | #ENV-200R3AM | 配备已安装的 28 V 直流风扇（#ENV-025F） |
| 培养皿 | Fisher | #08748B | 仅底部使用，用于盛装提供气味刺激的喷雾溶液；在条件化室的金属托盘中需居中放置 |
| PCI接口模块 | Med Associates 公司 | #DIG-700P2-R2 | 连接台式接口机柜与计算机；包含1个接口卡、1个解码卡、1根带状电缆和1根28 V直流电源电缆 |
| 大型台式机柜及电源供应 | Med Associates 公司 | #SG-6510D | 用于容纳 SmartCrtrl 8 输入、16 输出套件中包含的 12 张卡片 |
| SmartCtrl 8输入，16输出套件 | Med Associates Inc. | #DIG-716P2 | 用于连接和控制条件化室内的设备。包装包含所有电缆、接口模块和连接面板。 |
| Med PC IV 软件 | Med Associates 公司 | #SOF-735 | 运行程序所需的软件，需安装在计算机上。 |
| Monitor LG，19" LCD | 康考迪亚电脑商店 | #W1942TQ-BF | 计算机显示器；需与运行 Med PC IV 的计算机配套使用 |
| HP Z200 立式工作站 | 康考迪亚电脑商店 | #BZ788US#ABA | 运行 Med PC IV 的计算机 |
| 苯甲醛, ≥99% | OMEGA Chemical Company Inc. 化学品 | #B37-50 | 用自来水稀释以制备杏仁气味环境 |
| 加州冷压柠檬油 | Sigma Aldrich | #W262528-1KG-K | 用自来水稀释以产生柠檬气味 |
| 乙醇，95% | 商业酒精 | 用自来水稀释至所需浓度 |
参考文献
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