眼底摄影作为流行病学研究中用于观察心血管疾病危险因素对微血管反应影响的便捷工具

摘要

视网膜图像分析是一种用于可视化微循环的无创性操作。心血管疾病危险因素的影响可能导致视网膜血管管径发生变化。本文描述了获取眼底图像的操作流程以及计算血管管径的具体步骤。

摘要

微循环由直径小于150 µm的血管组成，占循环系统的很大一部分，在维持心血管健康方面起着重要作用。视网膜是眼球内壁的一层组织，也是唯一可用于无创分析微血管系统的组织。如今，可以使用数字相机获取高质量的眼底图像。即使不散瞳，也可在5分钟或更短时间内完成视网膜图像的采集。这种无创且快速的微循环可视化方法，适用于从儿童期到老年期的心血管健康监测，也适合应用于流行病学研究。

影响血液循环的全身性疾病可导致视网膜血管发生进行性形态学改变。例如，视网膜动脉和静脉管径的变化与高血压、动脉粥样硬化以及中风和心肌梗死风险增加相关。血管宽度通过图像分析软件测定，并将六条最大动脉和静脉的宽度分别汇总为中央视网膜动脉等效值（CRAE）和中央视网膜静脉等效值（CRVE）。这些指标已被证明可用于研究可改变的生活方式和环境因素对心血管疾病风险的影响。

本文描述了获取眼底图像的步骤以及分析中央视网膜动脉等效直径（CRAE）和中央视网膜静脉等效直径（CRVE）的方法。CRAE和CRVE重复测量的变异系数小于2%，且评定者内部的可靠性非常高。通过一项小组研究，报告了视网膜血管管径对颗粒物空气污染短期变化的快速反应，后者是心血管疾病发病和死亡的已知危险因素。综上所述，建议将眼底成像作为一种便捷且有效的工具，用于流行病学研究中探讨微血管对心血管疾病危险因素的反应。

引言

微循环由直径小于150 µm的血管组成，包括最小的阻力动脉、小动脉、毛细血管和小静脉。这些血管构成了循环系统的重要部分，在维持心血管健康方面发挥着关键作用。150 µm的血管直径是一个生理学和物理学上的界限。直径小于150 µm的血管其流变学特性与大动脉不同。此外，在具有血流自身调节能力的血管床中，大多数自身调节性的阻力变化发生在150 µm以下的下游血管中¹。微循环具有两个重要功能。首要功能是为细胞提供氧气和代谢底物，以满足组织的代谢需求，同时清除代谢废物和二氧化碳。交换血管数量的改变以及微血管血流模式的变化会减少有效的交换表面积，可能导致组织灌注不足，无法满足代谢需求²。此外，血管床内的静水压在此处下降，微循环在调节整体外周阻力方面也发挥着作用³。

视网膜是一层位于眼球内壁的组织。其主要功能是将进入眼内的光信号转化为神经信号，并进一步传递至视觉皮层以处理视觉信息。视网膜的作用是感知外部世界，而参与这一过程的所有眼部结构在光学上均是透明的。这使得视网膜组织可用于对微血管系统进行无创成像⁴。视网膜成像技术正被用于识别眼部疾病。例如，黄斑变性的晚期形式可因异常血管向黄斑区生长而导致视力丧失。这些血管通常通透性更高，容易发生出血，并向视网膜内或下方渗漏血液和蛋白质。这些事件是导致光感受器不可逆损伤的主要原因。青光眼的发生与视网膜神经节细胞及其轴突的损伤相关。这一过程会导致视盘凹陷（杯状改变），可在视网膜图像中观察到⁵。糖尿病性视网膜病变由高血糖引起，导致 视网膜血管壁受损。这可能引发缺血、新生血管形成以及血管几何网络的改变。此外，血-视网膜屏障可能发生破坏，导致扩张的高通透性毛细血管和动脉瘤出现渗漏⁶。

视网膜微血管与心脏、肺和脑中发现的微血管床具有同源性⁷。已知影响脑微循环的全身性疾病可导致视网膜发生平行变化。视网膜小动脉变窄及小动脉反光增强与脑小血管病引起的血管异常、白质病变和腔隙性病灶相关⁸。研究发现，视网膜静脉越细、视网膜微血管网络改变越明显，阿尔茨海默病的发生风险越高。这提示患者脑部存在脑微血管结构的改变，而这种改变也可在视网膜上被观察到⁹。

越来越多的证据表明视网膜血管变化与冠心病之间存在关联^10,11。视网膜动脉与视网膜静脉直径之比（A/V）已被证明是反映高血压和动脉粥样硬化的敏感指标¹²。动脉变窄和静脉增宽导致A/V比值降低，这与中风和心肌梗死的风险增加相关¹³。高血压可直接引起视网膜缺血和视网膜梗死，表现为棉絮斑和深层视网膜白色病灶¹⁴。Serre和Sasongko近期综述了相关文献，总结指出生活方式和环境危险因素（例如，饮食、体力活动、吸烟和空气污染）的暴露可诱导视网膜微血管床的形态学改变¹⁵。重要的是，这些视网膜改变已被证实与心血管危险因素相关，甚至在疾病出现临床表现之前即已存在¹⁶。

长期和短期暴露于颗粒物空气污染已被证实与心血管疾病发病率和死亡率的显著上升密切相关^17,18。研究表明，颗粒物（PM）作为空气污染的重要组成部分，可促进心血管疾病的发展并诱发心血管事件^19,20。微血管床功能受损被认为在上述关联中起着重要作用。在这方面，Adar 及其同事报道了空气污染暴露与视网膜小动脉狭窄之间的关联²¹。在多族裔动脉粥样硬化研究（MESA）的4607名参与者中，长期和短期暴露于较高浓度PM_2.5（直径≤2.5 μm的颗粒物）的人群表现出更窄的视网膜小动脉管径和更宽的静脉管径²¹。慢性空气污染暴露引起的全身性炎症可能导致静脉管径增宽²²。这一发现与报告吸烟对视网膜微血管床影响的研究结果相一致 ²³。最近一项发表的研究探讨了短期空气污染暴露与健康成人（22至63岁）视网膜眼底摄影所测得的微血管变化之间的关联²⁴。PM₁₀（直径≤10 μm的颗粒物）和BC（黑碳，一种燃烧副产物，可作为交通相关柴油尾气的替代指标）浓度升高与小动脉管径减小相关^24,25。

在本科学视频方案中，描述了采集眼底图像、进行图像分析以获取小动脉和小静脉管径，以及计算中央视网膜小动脉等效值（CRAE）和中央视网膜小静脉等效值（CRVE）的操作步骤。视网膜成像正受到越来越多的关注，因为视网膜是唯一可无创观察微血管系统的组织，且图像可从婴幼儿期直至老年期持续采集^26,27。CRAE和CRVE似乎是敏感的参数，能够反映可改变的生活方式和环境因素对心血管疾病风险所引起的微血管影响。本文展示了血管分析的可重复性，并通过总结我们在重复测量设计中关于颗粒物空气污染暴露影响的研究结果，进一步说明了视网膜微血管分析在流行病学研究中的应用价值²⁴。

方案

哈瑟尔特大学和安特卫普大学医院伦理委员会批准了本研究。参与者签署了书面知情同意书以参与研究。

1. 仪器设置

1. 从数字视网膜相机和设备主机上取下黑色保护外壳。
2. 打开电池仓，将电池放入相机中。请勿断开连接电池与主机的电线。
3. 将相机旋紧安装到主机上，并连接两条电线。使用提供的 USB 线缆将主机连接至电源和计算机。
4. 将主机的开关拨至“开”以启动主机。将相机的开关拨至“开”以启动相机。
5. 启动计算机。这可以防止主机与计算机之间出现连接错误。

2. 拍摄照片

1. 启动视网膜成像控制软件（并输入所需密码）。该软件是数字视网膜相机的一部分（参见材料表中的链接）。
2. 点击屏幕左上角的“Study”图标以开始研究。对于新患者，请填写患者ID、姓名、出生日期等所有详细信息。如果患者已在系统中，填写“患者ID”后使用“Search history list”功能，然后双击患者姓名以开始研究。
3. 请患者在相机前就座，将下巴置于下巴托上，前额紧贴额托，并固定头部以进行拍摄。
4. 请患者直视相机镜头。在水平（X-Y）平面内移动相机，对准右眼或左眼。
5. 使用下巴托调整患者角膜位置，使其位于相机显示屏上出现的两个圆圈内。通过操纵操纵杆上的滚轮进行微调。
6. 在X-Y平面内前后、左右移动相机，使患者的瞳孔位于圆圈内。确保瞳孔呈现为一个完整的圆形。此时，患者的虹膜将被分为两部分。
7. 使用操纵杆上的“后部触发器”从角膜切换至视网膜成像模式。此时患者应能看到一束绿光，请患者注视该绿光。
8. 通过旋转操纵杆底部滚轮弹出的两条线进行对焦。旋转滚轮直至两条线连成一条连续的直线。
9. 利用绿光将眼睛调整至最佳拍摄位置。如有需要，使用相机右侧的箭头按钮移动绿光，使视盘在相机显示屏上居中。
10. 寻找切换至视网膜模式后（步骤2.7）出现的两个白点。为找到白点，需在X-Y平面内移动设备。白点最初表现为模糊的斑点，前后移动设备直至模糊斑点变为明亮、清晰的白点。白点越明亮、越圆润，图像质量越高。调整位置直至两个白点均可见，并使用操纵杆上的小滚轮将白点移至相机显示屏中央。
11. 确认两条线（步骤2.8）已连成一条连续直线，视盘在显示屏上居中，且两侧各有一个明亮的白点。按下操纵杆顶部的拍摄按钮，获取视网膜图像。
12. 点击计算机屏幕右下角的“Study Complete”按钮保存图像。完成研究后，图像将自动保存至指定文件夹，并关闭当前研究。

3. 眼底照片分析

1. 通过测量黄斑中心（中央凹）与视盘中心（盲点）之间的距离，确定比例尺比值。解剖学上该距离被确定为 4,500 µm，或视盘直径的 2.5 倍，后者约为 1,800 µm。确保以像素为单位测量该距离。将 4,500 除以黄斑与盲点之间的距离（以像素为单位），计算出比例尺比值。
2. 打开视网膜血管分析软件“IVAN”。
   注：该软件由威斯康星大学麦迪逊分校开发。有关 IVAN 使用的详细信息来自其使用手册。
3. 输入比例尺比值，并完成配置步骤。
4. 确认在眼底照片上出现三个黄色圆环。比例尺比值决定内圆的半径，并将视盘包围在内。验证内环的中心点是否位于视盘的中心。若不重合，可使用光标键调整圆环位置。中圆和外圆的半径分别为内圆半径的 2 倍和 3 倍。通过此方式，在距视盘固定距离处形成 A 区和 B 区。
5. 检查眼底图像是否将视盘置于照片中心。这可确保 B 区图像具有清晰的焦点，有助于分级过程（图 4A）。
6. 观察软件是否已自动检测出血管，并将这些血管识别为小静脉（图 4B）。
7. 根据生理差异区分小动脉和小静脉。小动脉以红色标示，小静脉以蓝色标示（图 4C）。使用以下指南识别每条血管：
   1. 判断血管颜色。小动脉呈较浅的橙红色，具有明显的中央光反射；静脉呈较深的紫红色，中央光反射微弱或无。
   2. 判断血管走行。小动脉通常走行较直，轮廓更平滑，路径和外形均较规则；小静脉通常更为迂曲，轮廓和管径不规则。在视盘边缘，小静脉的管径比相应的小动脉更宽。
   3. 通过观察前一条血管的标注来识别当前血管。原则上，小动脉与小静脉交替排列。因此，若已明确测量了一条小静脉，则下一条血管更可能是小动脉。
   4. 判断交叉模式。通常情况下，小动脉不与小动脉交叉，小静脉也不与小静脉交叉。若一条身份不明的血管在 B 区内或远端与一支静脉分支交叉，则该未知血管为小动脉；若其与一支小动脉分支交叉，则为小静脉。
   5. 通过向近端追溯较小分支的起源，识别其来自哪一支主干血管，主干血管的身份可根据前两条指南判断。利用血管间夹角区分交叉与分支。
      注：交叉通常接近垂直（90°），或当两支血管平行走行时，交叉角度较浅（小于 30°）；分支通常略小于垂直角度（两分支间夹角为 30° 至 45°）。
   6. 在分级区域内选择血管的完整长度。确保所选血管的标准差不超过 10。较小的标准差表明测量质量良好。
8. 使用软件工具选择软件未自动识别的血管。这些血管的识别规则与软件自动选择的血管相同。
9. 在 IVAN 中自动计算中央视网膜小动脉当量和小静脉当量（CRAE 和 CRVE）。
10. 使用 Parr 和 Hubbard 修订的公式²⁸，根据其分支血管计算 CRAE 和 CRVE。
    注：主干与分支之间的关系通过经验导出的分支系数，由以下两个公式近似估算血管当量。IVAN 使用六条最宽的小动脉和小静脉来计算 CRAE 和 CRVE。该公式通过迭代过程将六条最宽的小动脉（或小静脉）两两配对，直至获得中央小动脉（或小静脉）当量。
    小动脉： （1）
    小静脉： （2）
    其中 w₁、w₂ 和 W 分别为较窄分支、较宽分支和主干血管的宽度。
    注：假设在一张眼底照片中，六条最宽的小动脉宽度分别为 120、110、100、90、80 和 70 µm。将 120 与 70、110 与 80、100 与 90 分别代入公式（1）。第一次迭代后得到三个值：122.2、120.0 和 118.4。第二次迭代时将 122.2 与 118.4 配对，得到 149.8；将中间值（120.0）保留至最终迭代。将 149.8 与 120.0 配对，最终得到 CRAE 为 168.7。

结果

CRAE 与 CRVE 测定的重复性

招募了61名年龄在22至56岁之间、无临床诊断心血管疾病的个体，用于研究中央视网膜小动脉等效值（CRAE）和中央视网膜小静脉等效值（CRVE）测定的技术重复性及评定者内部变异。使用眼底相机对每位个体的右眼眼底在5分钟内连续拍摄两张照片（图1 和 图2）。该操作在连续4天的大致相同时间进行。在5分钟内拍摄的照片所测得的CRAE和CRVE的平均变异系数±标准差分别为1.76 ± 1.71和1.78 ± 1.51。CRAE和CRVE测量值的平均值±标准差分别为151.31 ± 13.53和213.20 ± 18.44。连续4天所获得的CRAE和CRVE值之间未观察到显著差异。

右眼的CRAE和CRVE值被平均为每天一个CRAE值和一个CRVE值。随后，通过组内相关系数（Intraclass Correlation Coefficient, ICC）评估测量的重复性。ICC是一种无量纲统计量，取值范围为0到1，用于描述在人群中的重复测量...

讨论

视网膜图像分析被提议作为一种便捷的工具，用于流行病学研究中微血管反应的观察。当操作者经验丰富时，拍摄一张眼底图像所需时间少于5 min 。此外，这种无创的微循环可视化方法可用于从婴幼儿到老年人各年龄段的受试者。

关于视网膜血管形态学改变（例如血管管径、几何模式等的变化）与可改变的生活方式及环境危险因素之间关联的文献日益增多^15,16。实验性和流行病学研究显示，短期和长期暴露于空气污染与心血管疾病的发病率和死亡率密切相关。然而，像视网膜眼底摄影这样一种便捷的技术，在研究空气污染物可能引起的微循环效应方面却极少被应用。

本视频方案详细解释了获取高质量眼底图像所需的各个步骤。随后介绍了获取小动脉和小静脉管径测量值的方法，特别是中央视网膜小动脉等效值（Central Retinal Arteriolar Equivalent, CRAE）和中央视网膜小静脉等效值（Central Retinal Venular Equivalent, CRVE）^13,28。重复测量分析结果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
佳能CR-2免散瞳眼底相机	Hospithera（比利时布鲁塞尔）		http://www.usa.canon.com/cusa/healthcare/products/eyecare/digital_non_mydriatic_retinal_cameras/cr_2。任何其他具有可比分辨率和规格的视网膜相机均可用于视网膜微血管的分析。兼容性应  在开始研究之前应进行检查。
IVAN：血管测量软件			该软件可用于科学研究目的，且免收费用。可通过联系 Nicola Ferrier 博士（麦迪逊工程学院和眼底照片读片中心）获取该软件。 威斯康星大学眼科与视觉科学系中心–麦迪逊）。http://directory.engr.wisc.edu/me/faculty/ferrier_nicola。电话：(608) 265-8793 传真：(608) 265-2316 或电子邮件：ferrier@engr.wisc.edu