我们介绍了一种利用无线电遥测系统记录胚胎脑干神经干细胞移植至损伤部位八周后T4脊髓横断大鼠心血管参数的实验方案。遥测技术是一种先进的方法，可用于准确评估清醒、自由活动的脊髓损伤大鼠的心血管功能。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
高位胸段或颈段脊髓损伤（SCI）可导致心血管功能障碍。为了监测心血管参数，我们在接受T4脊髓完全横断手术的大鼠股动脉内植入了连接无线发射器的导管，部分大鼠同时移植了表达绿色荧光蛋白的胚胎脑干来源神经干细胞。与其他方法（如插管或尾套法）相比，遥测技术的优势在于能够对自由活动动物的血压和心率进行连续监测，并可实现长期、多次的数据采集。在脊髓损伤大鼠模型中，成功记录了无束缚状态下基础心血管数据以及对直肠结肠扩张诱发的自主神经反射异常反应。此外，若在脊髓横断前预先植入发射器，则可在同一只大鼠中比较脊髓损伤前后的心血管参数。该遥测技术的一个局限性在于，股动脉内植入可能影响同侧后肢的血液供应。
引言
脊髓损伤（SCI）高位损伤后会出现心血管功能障碍。其表现为静息状态下血压和心率紊乱、直立性低血压、运动诱发的低血压，以及自主神经反射异常，后者以下损伤平面的感觉刺激诱发高血压发作及压力感受器介导的反射性心动过缓为特征1,2。这些症状严重影响脊髓损伤患者日常生活。因此，建立有效的研究工具以评估脊髓损伤动物模型的心血管变化及实验性治疗手段显得尤为重要。
为了研究动物的心血管功能，已有多种技术用于监测血压和心率。中心心血管参数可通过插管法和遥测技术进行记录，而无创尾套法则可用于测量外周血压3。与其他方法相比，遥测技术的主要优势在于能够对自由活动的动物进行连续记录，并实现心血管功能的长期监测4。在脊髓损伤（SCI）动物模型中，实验刺激后外周血压的变化可能不够显著，难以被检测到。因此，应为脊髓损伤动物选择合适的心脏监测技术。
本研究中，采用遥测系统监测成年大鼠在完全性脊髓横断后的心血管功能。在损伤部位移植了同系大鼠胚胎第14天（E14）脑干来源的神经干细胞（BS-NSCs）。未移植的损伤大鼠以及未受伤的正常大鼠作为对照组。遥测操作流程包括发射器的灭菌与植入（图1）、基础心血管参数的记录、结直肠扩张诱导的反应检测，以及发射器的清洁与保存。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验方案均经机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）关于实验室动物护理与安全的指南。接受手术的动物均得到充分处理，以最大程度减轻疼痛与不适。
1. 脊髓手术与细胞移植
- 所有手术前均需对手术器械进行高压灭菌。在不同动物之间进行操作时，使用热珠灭菌器（Fine Science Tools）去除器械上的病原体和微生物污染物。手术过程中使用无菌外科手套、手术衣和手术单。每次手术均采用无菌外科技术。
- 通过腹腔注射（i.p.）给予雌性Fischer 344大鼠混合麻醉剂（2 ml/kg），包含氯胺酮（25 mg/ml）、赛拉嗪（1.3 mg/ml）和乙酰丙嗪（0.25 mg/ml）。
- 剃除背部毛发，并反复使用碘伏和乙醇清洁皮肤。
- 使用#10刀片切开皮肤，钝性分离肌肉层。用手术刀分离椎骨，暴露T3椎体，并使用精细咬骨钳行椎板切除术。
- 纵向切开硬脊膜，使用虹膜剪和微吸引器联合方法在T4水平横断脊髓，形成约1 mm的头尾向脊髓断端间隙。
- 等待约1–2分钟，直至出血完全停止，然后用3-0 Vycril缝线缝合肌肉层，并用伤口夹闭合皮肤。
- 术后立即皮下注射乳酸林格氏液（5 ml）、布托啡诺（0.035 mg/kg）和氨苄青霉素（33 mg/kg），并将大鼠置于温暖的孵育箱中直至苏醒。
- 术后每日皮下注射一次林格氏液和氨苄青霉素，持续至术后10天；布托啡诺每日两次，持续3天或直至疼痛和痛苦症状消失。动物未完全恢复前不得与其他动物合笼。
- 术后约两周内每日手动排尿两次，直至建立反射性排尿功能；此后根据需要每日排尿一次，持续至实验结束。
- 两周后，按照上述方法重新麻醉脊髓损伤大鼠，并重新暴露脊髓损伤部位。保持硬脊膜闭合，以保留植入细胞于损伤区域。
- 使用内径为40 µm的拉制玻璃微量移液管连接Hamilton注射器，将10 µl细胞悬液（3.5 × 105 µl），该细胞来源于E14期泛表达GFP转基因大鼠胚胎，并包埋于纤维蛋白原和凝血酶5,6中，注射至损伤腔中心以及损伤区头侧和尾侧交界处的多个位点。
- 缝合肌肉层，并用伤口夹闭合皮肤。
- 按照步骤1.6–1.8所述进行术后注射和膀胱护理。
- 灌注前一周，腹腔注射0.5% Fluorogold（FG，0.4 ml溶于蒸馏水）以逆行标记脊髓中的交感前节神经元7。
2. 发射器植入
- 将发射器浸泡于2%戊二醛溶液（4 ml 50%戊二醛加入96 ml蒸馏水中）中，室温下至少1–2小时（最长可达10小时），以进行消毒。
- 用无菌0.9%生理盐水彻底清洗发射器3次，并将其保存在生理盐水中直至使用（不超过1小时）。
- 在E14细胞移植后第八周（损伤后第十周），对接受脊髓损伤（SCI）并进行或未进行细胞移植的大鼠以及未处理的对照大鼠重新实施麻醉。
- 剃除腹部及后肢区域的毛发，使用碘伏清洁皮肤，并将大鼠仰卧位固定于手术台上。
- 使用#15刀片在右侧腹侧腹部及大腿内侧切开皮肤。
- 用小型剪刀剪开皮下结缔组织，暴露股动静脉束及神经。
- 使用尖端弯曲的精细镊子将股动脉与静脉及神经分离。
- 在动脉下方放置三条丝线缝合线，并在每条缝线上打松结。
- 向动脉表面滴加0.1 ml利多卡因（2%），以促进血管扩张，便于后续插管。
- 远端用永久性丝线结扎固定血管，近端通过拉紧一条松结丝线实现暂时性阻断。
- 使用20号弯曲针穿刺动脉，并借助导管插入工具将遥测导管（长8 cm）的尖端插入血管。
- 将导管向头侧插入至4 cm深度，使导管尖端位于胸主动脉内。
- 通过在股动脉周围结扎三条丝线，将导管固定于血管内。
- 用钝头剪刀在肋缘后端与膝关节活动范围最前端之间沿体侧皮下制作一个皮下囊袋。
- 将发射器本体置入囊袋中，并用缝线将其固定于周围结缔组织，以防止过度移动。
- 使用6号丝线缝合皮肤。
- 术后立即皮下注射乳酸林格液（5 ml）、布托啡诺（0.035 mg/kg）和氨苄青霉素（33 mg/kg），并将大鼠置于温暖的孵育箱中直至苏醒。
3. 基础平均动脉压（MAP）和心率（HR）记录
- 在植入发射器后最早一天，将单个动物放置在接收垫上并打开发射器。等待约 10 - 15 分钟，使动物适应环境并稳定心血管参数。
- 使用计算机化数据采集系统，持续记录至少 1 小时由脉动脉压导出的静息平均动脉压（MAP）和心率（HR），每 5 秒采集一次数据。
- 持续监测动物，并在出现明显痉挛时剔除相应数据点。对每只动物的数据点进行平均，以获得平均值。
4. 结直肠扩张诱发的自主神经功能异常
- 将NSC移植大鼠或脊髓损伤对照组大鼠用毛巾固定，并在发射器接收器内提供食物颗粒。通常大鼠在操作过程中能够合作保持不动。
- 将带有乳胶球囊的导管插入直肠约2 cm，并用胶带将其固定于尾巴上8。
- 打开发射器，等待10–15分钟，使血压恢复至插入导管前的基线水平。
- 通过在10秒内缓慢向球囊注入1.4 ml空气并维持1分钟，诱导直肠结肠扩张，产生约30 mmHg的压力。
- 记录直肠结肠扩张前1分钟、扩张期间1分钟及扩张后1分钟的平均动脉压（MAP）和心率（HR）；在3分钟操作过程中每3秒采集一次数据。
- 每只动物进行2–3次试验，每次试验之间至少间隔15分钟以确保恢复。
- 若无需进一步评估，则给予动物上述麻醉剂双倍剂量进行腹腔注射（i. p.）处死 ；随后用生理盐水灌注，继之以4%多聚甲醛灌注。
- 对每只动物，分别计算直肠结肠扩张前和扩张期间各项指标的平均值；计算每次试验中基线与扩张引起的MAP和HR变化差值；对2–3次试验的结果取平均，获得均值。
5. 发射器清洁
- 在麻醉动物后、灌注前，将发射器从动物体内取出。立即浸入盛有蒸馏水的烧杯中，直至进行清洗；避免遥测装置干燥。
- 将遥测仪转移至1% Terg-A-Zyme酶清洗液（10 g/L水）中，在室温下浸泡24小时。
- 使用连接至注胶注射器的钝头30号针头，对发射器导管尖端进行注胶处理。
- 用折叠的软纸巾小心擦干发射器，并将其存放于原始塑料托盘中。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
利用上述遥测技术，我们成功记录了脊髓损伤动物的心血管参数。在仅发生脊髓损伤（SCI）的动物中，平均动脉压（MAP）显著降低，而心率（HR）升高，与未受干预的对照动物相比，结果与既往报道一致9。在接受脑干来源神经干细胞（BS-NSC）移植的动物中，MAP和HR接近未受干预动物的水平（图2）。在进行直肠结肠扩张时，若有害刺激引起MAP升高和HR降低，则认为该大鼠出现自主神经反射异常3,8。所有动物均不可避免地出现阵发性高血压及压力感受器反射介导的缓脉，但不同组别之间反应程度存在差异。接受BS-NSC移植动物的MAP升高幅度明显低于仅受损伤动物（16.9 ± 3.1 mmHg，n = 3 对比 64.1 ± 1.6 mmHg，n = 3）（图3）。然而，在直肠结肠扩张期间，各组间HR的下降程度无显著差异。由于缓脉主要由压力感受性反射机制介导，该差异可能源于脊髓损伤后压力感受器敏感性降低10。无论接受何种处理，大多数大鼠在直肠结肠扩张期间均出现肌肉痉挛。
经...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
传统上，将充满液体的套管插入动脉并连接至压力传感器，以在每只动物身上记录心血管参数的终末快照11。为了长期连续监测心血管功能，许多实验室采用无线电遥测系统。这种更为精细的工具可在清醒、自由活动的动物中记录血压。与充满液体的导管相比，遥测技术被认为是一种更先进的方法，可准确评估脊髓损伤（SCI）动物的心血管功能。尽管在本研究中，发射器仅在记录前1天植入，但根据实验需求，其可在脊髓损伤前或损伤后植入，以实现多次数据采集12。对于基础血压和心率（HR），既可通过中枢也可通过外周方式进行记录。然而，根据我们的经验，基于无创尾套法无法检测到对直肠结肠扩张引起的心血管反应。近期的遥测分析证实，在大鼠完全性高位胸段脊髓横断后，低血压和心动过速可长期持续存在9,13。我们在SCI对照组大鼠中观察到的基础平均动脉压（MAP）较低、心率较高，与先前使用相同记录技术的研究报道一致。接受细胞移植的大鼠中，直肠结肠刺激诱发的自主神经反射异常有所缓解。根据我们的组织学证据，多节段脊髓内去甲肾上腺素能和5-羟色胺能纤维向脊髓中间外侧核（SPNs）的投射增加，可能是生理功能改善的原因。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS，项目号NS054883）、克雷格·H·尼尔森基金会（Craig H. Neilsen Foundation，项目号280072）、退伍军人事务部以及加拿大脊髓研究组织的资助。我们感谢位于密苏里州哥伦比亚市的密苏里大学大鼠资源与研究中心（Rat Resource and Research Center）提供GFP大鼠。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 纤维蛋白原（大鼠） | Sigma | F6755-25MG | 37℃下2小时 oC 以溶解 |
| 凝血酶（大鼠） | Sigma | T5772-100UN | 在10 mM CaCl2中溶解 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | 用于遥测仪清洁的酶解溶液 |
| Fluorogold | 荧光染料 | 用蒸馏水溶解，避光保存 | |
| 遥测仪 (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| 遥测记录与分析系统 | Data Sciences International | 信号刺激器，数据交换矩阵，接收器，环境压力参考监测仪 | |
| 球囊导管 | 爱德华生命科学 | 111F7-P | 用于结直肠扩张 |
参考文献
- Krassioukov, A. V., Furlan, J. C., Fehlings, M. G. Autonomic dysreflexia in acute spinal cord injury: an under-recognized clinical entity. J Neurotrauma. 20, 707-716 (2003).
- Lindan, R., Joiner, E., Freehafer, A. A., Hazel, C. Incidence and clinical features of autonomic dysreflexia in patients with spinal cord injury. Paraplegia. 18, 285-292 (1980).
- Inskip, J. A., Ramer, L. M., Ramer, M. S., Krassioukov, A. V. Autonomic assessment of animals with spinal cord injury: tools, techniques and translation. Spinal Cord. 47, 2-35 (2009).
- Mayorov, D. N., Adams, M. A., Krassioukov, A. V. Telemetric blood pressure monitoring in conscious rats before and after compression injury of spinal cord. J Neurotrauma. 18, 727-736 (2001).
- Hou, S., Tom, V. J., Graham, L., Lu, P., Blesch, A. Partial restoration of cardiovascular function by embryonic neural stem cell grafts after complete spinal cord transection. J Neurosci. 33, 17138-17149 (2013).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Akhavan, M., Hoang, T. X., Havton, L. A. Improved detection of fluorogold-labeled neurons in long-term studies. J Neurosci Methods. 152, 156-162 (2006).
- Maiorov, D. N., Fehlings, M. G., Krassioukov, A. V. Relationship between severity of spinal cord injury and abnormalities in neurogenic cardiovascular control in conscious rats. J Neurotrauma. 15, 365-374 (1998).
- Laird, A. S., Carrive, P., Waite, P. M. Cardiovascular and temperature changes in spinal cord injured rats at rest and during autonomic dysreflexia. J Physiol. 577, 539-548 (2006).
- Phillips, A. A., Krassioukov, A. V., Ainslie, P. N., Warburton, D. E. Baroreflex function after spinal cord injury. J Neurotrauma. 29, 2431-2445 (2012).
- Osborn, J. W., Taylor, R. F., Schramm, L. P. Determinants of arterial pressure after chronic spinal transection in rats. Am J Physiol. 256, 666-673 (1989).
- Rabchevsky, A. G., et al. Effects of gabapentin on muscle spasticity and both induced as well as spontaneous autonomic dysreflexia after complete spinal cord injury. Front Physiol. 3, 329(2012).
- Hou, S., Lu, P., Blesch, A. Characterization of supraspinal vasomotor pathways and autonomic dysreflexia after spinal cord injury in F344 rats. Auton Neurosci. 176, 54-63 (2013).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
