一种高度可重复且简便的实验操作方法 体内 小鼠睁眼后的摘眼球术

摘要

摘除眼球，也称为去眼球术（enucleation），是一种研究哺乳动物视觉系统中视觉、跨模态及发育可塑性的重要策略，因为它可诱导不可逆的部分（单眼）或完全（双眼）视力丧失。本文介绍了一种高度可重复且简便的方法，用于实施活体（in vivo）去眼球术。

摘要

眼球摘除或手术切除眼睛通常可作为神经去传入的模型。该方法为研究哺乳动物视觉系统中视觉、跨模态及发育可塑性的各个方面提供了有价值的工具^1-4。

本文展示了一种优雅且简便的小鼠单眼或双眼摘除技术，该技术已在出生20天至成年小鼠中得到验证。简而言之，使用一把已消毒的弯头镊子夹住眼球后方的视神经，随后进行环形运动以收缩视神经并摘除眼球。该技术的优点包括高度可重复性、几乎无出血、术后恢复迅速，且实验人员的学习门槛极低。因此，可在最小工作量下对大量动物进行操作和处理。此技术在操作过程中可能对视网膜造成轻微损伤，若研究目标为收集和分析视网膜组织，则该方法相较于Mahajan et al. (2011)⁵ 的方法适用性较低。此外，本方法仅适用于睁眼后的年龄段（小鼠：P10–13及以上），因为摘除时需在不切开眼睑的情况下将眼球从眼窝中移出。本文所描述的体内眼球摘除技术近期已在大鼠中通过少量修改成功应用，表明其在研究啮齿类动物传入性视觉通路方面具有广泛适用性。

引言

摘除眼球从而不可逆地破坏感觉受体表面（视网膜），会导致视觉通路中的感觉输入显著丧失。在青少年和成年视觉系统中，眼球摘除模型已被证明对于理解不同视觉中枢的发育、可塑性及功能具有重要价值^1-4。这种感觉剥夺所引发的分子、细胞和生理学后果，有助于揭示正常发育过程是如何被调控的，以及既有的皮层环路如何应对并改变其结构与功能，以响应此类重大的经验改变。

存在多种视觉剥夺方法，每种方法在视觉相关研究中都有其特定优势。例如，暗室饲养可特异性消除视觉驱动的活动，但不影响视网膜的自发性活动。类似地，眼睑缝合或佩戴眼罩可去除模式化视觉输入，同时不干扰自发性活动，但允许弥散光透过闭合的眼睑进入眼内。这些方法具有可逆性，已被证明在理解模式化视觉以及双眼输入的低水平相关性在发育过程中塑造皮层环路中的作用方面具有重要价值^6-8。在青光眼研究中，成年动物的视神经 crush 模型被广泛使用，因为它可建立一种渐进性的视网膜神经节细胞输入丧失，而这些细胞构成了视神经的主要成分^9,10。另一方面，眼球摘除术（enucleation）通过完全且即时地移除眼球及视网膜，是在需要不可逆地同时消除自发性和模式化视觉输入时的合适选择。该方法还可诱导强烈的 intraocular 活动失衡，从而在活动图谱研究中增强信噪比^11,12。将眼球摘除后所引发的功能与结构变化，与眼睑缝合等较温和剥夺方法后的变化进行比较，可能进一步揭示自发性视网膜活动在稳态可塑性和突触可塑性中的作用。

去核术会引发直接视网膜靶区营养影响的丧失。例如，脑源性神经营养因子（BDNF）的水平在成年去核大鼠的外侧膝状体核（LGN）和上丘中显著下调¹³。作为介导结构重塑的信使分子的活性氧物质，也在成年大鼠视觉系统的皮层下结构中被检测到¹⁴。此外，在小鼠不同皮层下视觉靶区结构中，小胶质细胞和星形胶质细胞的活化发生在去核后特定的一周时间窗内¹⁵。综上所述，视神经去传入在胶质细胞、结构和分子水平上引起不同的皮层下反应。尽管存在这些皮层下效应，但并不必然意味着皮层水平也会受到影响¹⁶。值得注意的是，跨模态皮层可塑性在单眼（ME）^3,4,17,18和双眼（BE）^1,17去核术后均会发生，包括非视觉输入向被剥夺视觉皮层的强化以及邻近其他感觉区域的改变。

除了对视觉神经科学做出贡献外，去传入（去神经传入）作为一种去传入类型，还可用于研究中枢神经系统神经保护¹⁹与神经退行性特性^20-22之间的平衡。

文献中已描述了多种进行去核操作的不同方法。某些去核技术 体内 由于需要对眼眶肌肉和组织进行不必要的切片，大鼠和小鼠的ME操作较为复杂^23-25. 其他出版物，例如 Mahajan 等 (2011)⁵ 提供一种使用钝性解剖法高效收集眼球的详细方案，用于研究基因型-表型关联，可能在死后进行。该方法因其便捷和快速，适用于其特定目的。然而，此方法较不适用于 体内 去眼球术，当研究者选择在活体动物中研究去眼球术后传入视觉通路而非眼球本身时。在这种情况下，去眼球术后的存活率至关重要。此外，应尽量减少 体内 视神经和眶内组织的损伤较小且保存良好。在此，我们介绍一种改良的眼球摘除方法，该方法更接近Faguet所描述的方法 等 (2008)²⁶，具有某些优势特性：术后恢复迅速，且研究人员的学习门槛极低。通常情况下，不同方法可根据后续研究的重点——眼部形态学或视觉通路研究——相互补充。

总之，去核技术可应用于从视觉研究到稳态及跨模态脑可塑性、胶质细胞反应特性以及轴突稳定性的研究。在本可视化文章中，我们展示了一种可行且可靠的去核方法 体内 小鼠眼球摘除术

方案

所有实验均经鲁汶大学（KU Leuven）伦理研究委员会批准，严格遵守2010年9月22日欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）以及比利时法律法规（2013年5月29日皇家法令）。我们尽一切可能减轻动物痛苦，并尽量减少动物使用数量。

1. 动物处理与麻醉

1. 通过腹腔注射盐水配制的盐酸氯胺酮（75 mg/ml）和盐酸美托咪啶（1 mg/kg）混合物麻醉小鼠。
2. 用镊子轻夹脚趾检查反射，确认小鼠已完全镇静。
3. 使用棉签蘸取70%乙醇消毒眼睑及眼部周围区域。检查眼睑反射以进一步评估镇静程度。

2. 摘除眼球

1. 确保动物处于平坦、干燥且光滑的表面上。
2. 使用镊子（推荐使用带锯齿的弯曲尖端，尖端尺寸：0.5 × 0.4 mm）并进行灭菌处理。
3. 用镊子轻轻按压眼角（眼睛的外角），直至眼球从眼窝中移位，视神经暴露可及。
4. 将镊子引导至眼球后方，牢固夹住视神经， 建议使用镊子弯曲处的起始部分而非最尖端进行夹持。这有助于将眼球完全从眼窝中提起，并夹紧整个视神经。
5. 保持小鼠位于平坦表面上，用手持镊子做圆周运动，沿阻力最小的方向旋转。小鼠会随着手部运动方向在表面上随之摆动。
6. 逐渐加快旋转速度，直至视神经被完全绞断（通常需7至15次圆周运动，每秒约半圈至一圈）。此时，眼球即被完全摘除。

3. 术后护理

1. 若发生出血（罕见情况），用黏稠的凝固剂和止血剂填充眼眶。
2. 通过腹腔注射盐水溶解的1 mg/kg阿替美唑盐酸盐来逆转麻醉作用。
3. 每24小时腹腔注射1 mg/kg美洛昔康以缓解疼痛 。
4. 对保留的眼睛涂抹眼膏，以防止角膜脱水。
5. 将动物置于加热板上，或用隔热材料包裹后放入单独的笼子中，以控制体温。
6. 至少连续2天每天测量小鼠体重 。体重下降可能提示动物痛苦，在此情况下应持续给予美洛昔康治疗，直至动物完全恢复。

结果

图1展示了使用所述方案成功摘除眼球的结果，其特征是无出血，且眶内组织或眼窝无任何明显的物理损伤（图1A，1B）。此外，摘除的眼球角膜、脉络膜及视盘表面光滑，表明眼球结构完整无损（图1C）。由于本方案包括在眼球后方夹闭视神经并进行机械旋转，因此摘除的眼球在视网膜基底部可见视神经受压变窄（图1D）。采用该操作方法可获得整齐切断的视神经，同时不损伤周围脑组织区域（图1E）。

单眼摘除结合活动图谱绘制（图2），可清晰界定小鼠对侧视觉皮层中的功能特异性或眼源性输入区域^12,27，甚至可在灵长类等高等哺乳动物中界定眼优势柱²⁸。

在小鼠实验中，通过摘除单眼（ME）或双眼（BE），并结合特定的视觉刺激以及检测zif268 mRNA 或 c-Fos 蛋白的表达水平，以揭示视觉皮层中的区域性神经元激活情况^12,27。与接受视觉刺激的对照组相比（图2A），双眼摘除小鼠由于完全缺乏视觉输入，在视觉皮层中仅表现出基础水平的活动（图2B）。因此，可以清晰分辨出视觉皮层与非视觉皮层之间的边界（即在更靠前的脑区为体感皮层，而在更靠后的脑区为听觉皮层）。单眼摘除小鼠在术后存活一周的结果显示，对侧视觉皮层中存在与特定眼输入对应的区域。这两个由单眼驱动的区域活性较低，分别位于中央双眼区的内侧和外侧（图2C）。

图 1. 眼球摘除后眼眶状态、摘除眼球及视神经的定性评估。 使用弯头镊子摘除眼球后（A），眼眶内未见出血或损伤（B）。摘除的眼球完整无损，角膜和脉络膜形态正常（C,D）。视神经在离开眼球的视盘处变窄（D）。对脑腹侧部分进行检查，可见视神经被整齐切断（星号），其他结构无明显损伤（E）。C、D 中的比例尺：1 mm；E 中的比例尺：5 mm。A：前部；L：左侧；P：后部；R：右侧。

图 2. 通过去眼球术揭示的小鼠视觉皮层中功能性的、眼输入特异性分区。连接眼睛与皮层的黑色和灰色线条代表视网膜传入纤维的交叉以及眼特异性输入区域。通过放射性原位杂交（ISH）检测zif268（灰度图像），在Bregma水平约-3.40 mm的冠状切面上可视化对照组（A）、单侧去眼球（BE）（B）和双侧去眼球（ME）（C）小鼠的神经活动。在对照组动物（A）中，双侧半球的视觉皮层在视觉刺激后均表现出高水平的活动。当一只或两只眼睛被摘除后，相应的去传入皮层区域中活动信号明显减弱。单侧去眼球（C）小鼠在视觉皮层的双眼区显示出一个高活性区域，其周围单眼区的信号降低，这些单眼区位于被摘除眼睛的对侧。比例尺：2 mm。经Van Brussel 等¹²许可重印。

讨论

根据我们的方法进行成功的去核操作时，需考虑最关键的步骤包括：1）使用尖端呈适当尺寸的弯曲且带齿的镊子；2）在光滑且干燥的表面上进行去核操作；3）沿摩擦最小的方向逐渐加快环形运动的速度。

为获得理想效果，必须使用具有弯曲且带齿尖端的镊子（推荐尖端尺寸：小鼠：0.5 × 0.4 mm；大鼠：2.15 × 1.3 mm）。弯曲设计有助于眼球移位后顺利接触视神经，并在执行环形操作时确保手部正确放置。不推荐使用光滑尖端的镊子，因其在夹持视神经时无法提供足够的抓握力。若在环形操作过程中未能稳妥夹持视神经，可能导致眼动脉破裂、眼球剥离不充分，从而影响实验的可重复性。 因此，建议首先在已实施安乐死的动物上练习该技术，以优化镊子的操作手法，从而在实际应用该方法时确保动物福利的最大化 体内在本实验室，近期已采用相同技术成功完成大鼠的眼球摘除手术，唯一不同之处在于手动转动动物体位，而保持镊子固定不动。

该技术的一个局限性是可能对视网膜造成损伤。因此，该方法不太适用于采集视网膜进行组织学分析⁵。此外，我们的方法仅限于眼睑张开后的年龄段，因为需要在不移除或切割眼睑的情况下将眼球从眼窝中移位。

在不同物种（包括啮齿类动物）中进行眼球摘除手术通常采用多种替代方法，这些方法往往需要切除眼睑并切断视神经^18,23-25。与本文所述技术相比，这些方法更具侵入性，且学习难度更高。本方法无需切除或缝合眼睑，从而最大限度地缩短了术后恢复时间，提高了动物福利，并获得更可重复的实验结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸氯胺酮（Anesketin）	Dechra Veterinary Products (Eurovet)	BE-V136516
盐酸美托咪啶（Domitor）	Orion Corporation (Janssen Animal Health)	BE-V151742
盐酸阿替米唑（Antisedan）	Orion Corporation (Elanco Animal Health)	BE-V153352
抗生素（头孢唑啉，Kefzol）	Eurocept Pharmaceuticals	BE 106267
眼膏（Fucithalmic）	Leo Pharma nv-sa	BE 144654
Moria MC31 镊子 - 带齿弯头	Fine Science Tools	11370-31	适用于小鼠。只要镊尖呈弯曲且带齿，任何尺寸相似的镊子均可使用。
窄头型弯镊	Fine Science Tools	11003-13	适用于大鼠。只要镊尖呈弯曲且带齿，任何尺寸相似的镊子均可使用。
止血棉球	Qualiphar	N/A	其他止血剂同样适用（例如，Viscostat，#649，Ultradent Products）