体外合成修饰mRNA以诱导人细胞中蛋白质表达

摘要

在本视频文章中，我们描述了 体外 合成修饰mRNA以诱导细胞中蛋白质表达

摘要

将编码的合成信使RNA（mRNA）外源递送至特定细胞以诱导蛋白合成，在再生医学、基础细胞生物学、疾病治疗以及细胞重编程等领域具有巨大潜力。本文详细描述了一种逐步操作方案，用于制备免疫激活潜能降低且稳定性增强的修饰mRNA，包括所制备mRNA的质量控制、细胞转染以及通过流式细胞术验证目标蛋白的表达。在单次转染eGFP mRNA后长达3天内，转染的HEK293细胞可持续产生eGFP。本视频文章以eGFP mRNA的合成为例进行说明，但该方法同样适用于其他所需mRNA的制备。利用这种合成修饰mRNA，可诱导细胞瞬时表达其原本不表达的目标蛋白。

引言

在细胞中，信使RNA（mRNA）的转录及其后续翻译成所需蛋白质的过程，确保了细胞的正常功能。遗传性或获得性基因疾病可能导致蛋白质合成不足或功能异常，从而引发严重疾病。因此，一种新的治疗策略是将体外合成的修饰mRNA外源性递送至细胞，该mRNA编码目标蛋白，从而诱导缺失或缺陷蛋白的产生。通过这种方式，细胞被激活以合成其通常无法产生或生理上本不需要的功能性蛋白质。利用该策略，可通过导入编码缺陷或缺失蛋白的mRNA来纠正基因缺陷¹。mRNA疗法还可用于疫苗开发，以合成由肿瘤细胞或病原体表达的蛋白质抗原，从而激活宿主免疫系统，有效清除肿瘤细胞或预防感染^2,3。此外，近年来mRNA已成功用于生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。为此，成纤维细胞被转染mRNA以诱导重编程因子的表达^4-6，进而将其转化为具有巨大再生医学潜力的iPSCs。

此前，传统mRNA的应用受限于稳定性低和免疫原性强。因此，传统mRNA的临床应用受到限制。然而，Kariko及其同事通过在mRNA分子中用5-甲基胞苷和假尿苷取代胞苷和尿苷，使mRNA分子在生物液体中具有稳定性，并显著降低免疫激活^7-10，从而实现了修饰mRNA的临床应用。

通过使用人工合成的修饰mRNA，可在体内in vivo¹¹或体外in vitro临时递送目的基因转录本，以诱导蛋白表达。导入的mRNA可在生理条件下由细胞翻译机制进行翻译。由于与病毒基因治疗载体相比，修饰mRNA不会整合到宿主细胞基因组中，因而避免了致癌风险^12,13。因此，基于修饰合成mRNA的治疗手段在未来将获得更广泛的临床认可。

本文介绍了一种制备修饰mRNA（图1）、利用mRNA转染细胞以及检测转染细胞中蛋白表达的详细实验方案。

方案

1. 扩增含有必需编码DNA序列（CDS）的质粒

1. 将转化试剂盒中包含的 SOC 培养基预热至室温，并将含有 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板预热至 37 °C。将水浴锅平衡至 42 °C。
2. 在冰上解冻一管化学感受态 E. coli。
3. 向化学感受态 E. coli 管中加入 1–5 µl 含有目的 CDS 的质粒（10 pg 至 100 ng），轻轻混匀。切勿使用移液器吹打混匀细胞。加入质粒后，通过轻弹管壁进行混合。
4. 将混合物置于冰上孵育 30 分钟。
5. 将 E. coli 在 42 °C 水浴中热激 30 秒，期间不振荡。
6. 将管子放回冰上放置 2 分钟。
7. 向 E. coli 中加入 250 µl 预热的 SOC 培养基，在细菌培养箱中于 37 °C 以 300 rpm 水平振荡培养 1 小时。
8. 从转化混合物中取 100 µl 和 150 µl 涂布于预热的 LB 琼脂平板上，倒置平板并在 37 °C 过夜培养。
9. 待菌落可见后，从每块平板上挑取单个菌落接种至含有 5 ml LB 培养基（含 100 µg/ml 氨苄青霉素）的 15 ml 培养管中。在 37 °C 以 300 rpm 振荡培养过夜，直至菌液达到对数晚期或稳定期。
10. 对于转化后 E. coli 的长期保存，向冻存管中加入 75 µl 100% 甘油，再加入 225 µl 菌液（最终冻存液含 25% 甘油），充分混匀后于 -80 °C 保存。
11. 使用质粒纯化试剂盒，按照制造商说明书提取含有目标 CDS 的质粒。
12. 使用分光光度计测定质粒浓度。
13. 将质粒分装为每份 20 µl，于 -20 °C 长期保存。

2. 通过聚合酶链式反应（PCR）扩增质粒插入片段并添加Poly T尾

1. 注意：为了获得用于后续实验的DNA模板， 体外 体外转录（IVT）过程中，通过PCR扩增目的编码序列（CDS），此处为eGFP。同时，利用带有poly T尾的反向引物，在插入片段末端添加由120个胸腺嘧啶（T）组成的poly T尾。₁₂₀ 从而，体外转录（IVT）后生成的mRNA在3'端获得一段长度明确的poly A尾。
2. 按照所述详细步骤配制PCR混合液 表1.
3. 充分混匀反应体系。注意：PCR产物可用于4-5次体外转录（IVT）反应。如需增加IVT的DNA模板量，可增加PCR体系的总体积。可使用多个PCR管，每管含100 µl PCR反应体系，以获得足够的PCR产物产量。
4. 将PCR管放入热循环仪中，并按照PCR扩增程序运行PCR表 2).
5. 使用PCR纯化试剂盒按照制造商说明书纯化PCR反应产物，并用20 µl无核酸酶水洗脱DNA。
6. 使用分光光度计测定DNA浓度。注意：检测到的DNA浓度约为300 µg/ml，因此预期总产量应约为6 µg。其他蛋白的DNA产量可能因CDS长度、用于PCR的质粒用量、引物退火温度及循环次数的不同而有所差异。
7. 将 DNA 在 -20 °C 长期保存，或直接用于体外转录（IVT）。

3. 对照步骤：PCR 产物质量

1. 通过DNA凝胶电泳检测PCR产物的质量。
2. 将所需量的琼脂糖与1x TBE缓冲液混合于烧瓶中。制备1%琼脂糖凝胶时，将0.5 g琼脂糖加入50 ml的1x TBE中。
3. 放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解，避免沸腾，并确保琼脂糖完全溶解于溶液中。
4. 向50 ml琼脂糖凝胶中加入5 µl核酸凝胶染料。
5. 将凝胶倒入琼脂糖凝胶模具中，插入梳子，并静置约1小时，直至凝胶完全凝固。
6. 移除梳子，将凝胶模具放入电泳槽中。
7. 分别取2 µl（200 ng）80–10,000 bp DNA Ladder和200 ng PCR产物，各自与2 µl 6x上样缓冲液混合，总体积为12 µl。
8. 小心将DNA样品加入琼脂糖凝胶的加样孔中。
9. 以1x TBE作为电泳缓冲液，在100 V电压下电泳运行1小时。
10. 使用成像系统观察DNA条带（图2）。

4. 体外 体外转录（IVT）

1. 注意：PCR 后，质粒插入片段被扩增，并添加 poly T 尾。在体外转录（IVT）过程中，遗传信息从 DNA 转录为 RNA。生成的 mRNA 转录本用于在细胞中产生蛋白质。
2. 使用 RNase 去污染溶液清洁工作区域和移液器。使用经 PCR 清洁处理且无菌的双滤芯移液吸头，并频繁更换手套，以尽量减少反应混合物被 RNase 污染。
3. 按照表3所述配制 NTP/帽类似物混合液。
4. 通过涡旋充分混匀 NTP/帽类似物混合液，然后短暂离心。
5. 按照表4所述配制 IVT 反应混合液。
6. 通过轻柔吹打充分混匀 IVT 反应混合液，然后短暂离心 PCR 管，使混合液沉至管底。
7. 在 37 °C 下于恒温混匀仪中孵育 3 小时。
   注意：最佳孵育时间取决于插入片段的长度以及模板的转录效率。对于较短的插入片段（<500 nt），延长孵育时间可能更有利。可通过时间进程实验确定获得最大产量所需的最佳孵育时间。例如，可设置 IVT 反应分别孵育 1、2、3、4、6 小时及过夜，测定 mRNA 产量。体外转录生成 eGFP mRNA 的动力学见图3。
8. 为去除模板 DNA，向 IVT 反应混合液中加入 1 µl DNase（2 U/µl），充分混匀后于 37 °C 孵育 15 分钟。
9. 根据制造商说明书，使用 RNA 纯化试剂盒纯化反应混合液。用 40 µl 无核酸酶水对离心柱膜进行两次洗脱。注意：检测到的 RNA 浓度约为 1,500 µg/ml，因此预期总产量应约为 120 µg。合成其他蛋白的 mRNA 产量可能因编码序列（CDS）长度及用于 IVT 的 PCR 产物量不同而有所差异。

5. 使用南极磷酸酶处理纯化的 mRNA

1. 注意：生成的 mRNA 需用磷酸酶处理以去除 5' 三磷酸基团，这些基团可被 RIG-I 识别并导致免疫激活。此外，磷酸酶处理可防止在自连接反应中重新环化。
2. 向 79 µl 纯化的 mRNA 溶液中加入 9 µl 10x Antarctic 磷酸酶反应缓冲液，随后加入 2 µl Antarctic 磷酸酶（5 U/µl），并轻轻混匀样品。将反应体系在 37 °C 下孵育 30 分钟。
3. 使用 RNA 纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化反应体系。用 50 µl 无核酸酶水对离心柱膜洗脱两次，以回收修饰后的 mRNA。
4. 使用分光光度计测定修饰后 mRNA 的浓度。检测 260 nm 与 280 nm 处吸光度比值（A₂₆₀/A₂₈₀）是否 ≥ 1.8，以及 A₂₆₀/A₂₃₀ 比值是否为 2.0，以判断其纯度。
   注意：预期总产量约为 90 µg，足以进行约 36 次 mRNA 转染。
5. 通过添加无核酸酶水将 mRNA 浓度调整至 100 ng/µl。
6. 将修饰后的 mRNA 分装成转染所需的单次使用量，于 -80 °C 保存。避免反复冻融。正确制备和储存的 mRNA 可稳定保存多年。操作过程中应始终将修饰后的 mRNA 置于冰上。

6. 对照步骤：合成修饰mRNA的质量

1. 通过RNA凝胶电泳检测修饰mRNA的质量。
2. 将所需量的琼脂糖与1x TBE缓冲液加入烧瓶中混合。制备1%琼脂糖凝胶时，将0.5 g琼脂糖加入50 ml的1x TBE中。
3. 微波加热至琼脂糖完全溶解，避免沸腾，并确保琼脂糖完全溶解于溶液中。
4. 向50 ml琼脂糖凝胶中加入5 µl核酸凝胶染料。
5. 将凝胶倒入琼脂糖凝胶模具中，插入梳子，并静置约1小时，直至凝胶完全凝固。
6. 移除梳子，将凝胶模具放入电泳槽中。
7. 分别取3 µl（3 µg）0.5–10 kb RNA Marker和200 ng合成的修饰mRNA，各自与7 µl上样缓冲液混合，总体积为10 µl。上样缓冲液的组成见表5。
8. 将RNA Marker和mRNA样品于70 °C变性10分钟。
9. 小心地将RNA Marker和mRNA样品上样至1%琼脂糖凝胶中。
10. 以1x TBE作为电泳缓冲液，在100 V条件下电泳1小时。
11. 在紫外透射仪上观察RNA Marker和mRNA条带，并使用凝胶成像系统拍照（图4）。

7. 转染前细胞的准备

1. 在12孔板的每个孔中接种 2 × 10⁵ 个细胞（HEK293 细胞）。
2. 将细胞置于细胞培养箱中，于 37 °C 培养过夜。注意：转染当天，细胞应达到 80–90% 汇合度。

8. 进行细胞mRNA转染

1. 解冻修饰后的 mRNA。
2. 制备用于转染的脂质复合物（lipoplexes）。
3. 将 25 µl（2.5 µg）修饰 mRNA 和 2 µl 阳离子脂质转染试剂加入 473 µl Opti-MEM（最低必需培养基）I 低血清培养基中，以制备用于转染 12 孔板一个孔的转染混合液。根据需要转染的孔数按比例扩大体积。作为阴性对照，制备不含 mRNA 的转染混合液。
4. 用移液器轻轻混匀各组分。将转染混合液在室温下孵育 20 分钟，以形成用于转染的脂质复合物。
   注意：转染混合液中不含抗生素，因此在处理细胞时需注意保持无菌操作。
5. 用 500 µl DPBS/孔洗涤细胞。
6. 将 500 µl 转染混合液加入 12 孔板的一个孔中。
7. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育细胞 4 小时。
8. 吸除转染混合液，并向细胞中加入 1 ml 完全细胞培养基。
9. 将细胞在细胞培养箱中继续孵育 24 小时。
10. 使用荧光显微镜进行荧光显微分析（图 5）。注意：若需检测由非 eGFP 编码 mRNA 转染后在细胞中表达的其他蛋白，可将细胞培养在盖玻片上，随后进行转染，并用相应的抗体染色，再通过荧光显微镜进行分析。

9. 细胞中 eGFP 表达的流式细胞术分析

1. 从孔中移除细胞培养基，每孔用 1 ml DPBS（不含钙和镁）洗涤一次。每孔加入 500 µl 胰蛋白酶/EDTA 溶液，使细胞从细胞培养板表面脱落。随后，每孔加入 500 µl TNS 溶液以灭活胰蛋白酶。
2. 将脱落的细胞在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，仅保留沉淀。将细胞沉淀重悬于 150 µl 细胞固定液中，并将细胞悬液转移至流式细胞管中。
3. 使用 Geo Mean（荧光强度的几何平均值）分析表达 eGFP 的细胞百分比及荧光强度（图 6）。

10. 随时间测量蛋白质表达量

1. 按照步骤8所述，在12孔板的3个孔中进行mRNA转染。另外，将3个孔的HEK293细胞与转染混合物共同孵育，但不加入mRNA。
2. 转染后第1、2、3天检测eGFP的表达，以评估蛋白表达的持续时间（图7）。

结果

使用含有eGFP编码序列（CDS）的pcDNA 3.3质粒，建立了修饰型eGFP mRNA的合成方法（图1）。经PCR扩增插入片段并添加poly T尾后，检测到一条长度约为1,100 bp的清晰条带（图2）。延长体外转录（IVT）时间可提高mRNA的产量（图3）。IVT反应完成后，检测到一条长度约为1,100 bp的清晰mRNA条带，与预期生成的eGFP mRNA长度一致（图4）。

通过转染HEK293细胞来检测所生成的eGFP mRNA的功能。为此，使用阳离子脂质转染试剂制备转染复合物（脂复合物）。转染实验在12孔板中进行，每孔接种2 x 10⁵个细胞。转染24小时后，采用荧光显微镜（图5）和流式细胞术（图6）检测细胞中eGFP的表达情况。

将 eGFP mRNA 转染至 HEK293 细胞中。在转染后...

讨论

mRNA 疗法在再生医学、疾病治疗和疫苗接种领域具有巨大潜力。本视频中，我们演示了稳定化修饰 mRNA 的制备方法，用于诱导细胞中的蛋白质表达。通过本方案，也可制备其他所需的 mRNA。 体外 修饰mRNA的合成使得将特定mRNA转染入细胞成为可能，从而诱导目标蛋白的表达。在此过程中，目标蛋白在生理条件下瞬时表达，直至外源导入的mRNA被完全降解。

在此视频中，展示了HEK293细胞经eGFP mRNA单次转染后连续3天的eGFP表达。编码其他蛋白质的mRNA分子可能导致更短的蛋白表达周期。由于外源性递送的mRNA会逐渐降解，蛋白表达水平随之下降。因此，该技术在某些应用中的局限性在于蛋白表达的瞬时性。为在细胞中维持更长时间的蛋白表达，需重复递送mRNA。尽管mRNA转染具有不整合入宿主基因组的优势，与病毒载体相比可避免插入突变以及癌症和白血病的发生， 体内 转染效率可能低于使用病毒载体的效果。

对于每种不同的细胞类型，所需的mRNA浓度和转染试剂用量均需进行优化¹⁴，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养
DMEM，高糖	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
青霉素/链霉素	PAA	P11-010	100倍
L-谷氨酰胺	PAA	M11-004	200 mM
不含钙和镁的DPBS	PAA	E15-002
0.04% 胰蛋白酶 / 0.03% EDTA	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	胰蛋白酶中和液，含0.05%胰蛋白酶抑制剂和0.1% BSA
HEK-293细胞	ATCC	CRL-1573
耗材
组织培养板，12孔	Corning	3512
细胞培养瓶（75 cm2）	Corning	430641
无DNase和RNase的1.5 ml无菌微量离心管	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock，Biopur
15 ml锥形管	greiner bio-one	188271
PCR级洁净无菌epT.I.P.S.双滤芯移液器吸头	Eppendorf	10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253
冻存管	greiner bio-one	122279-128	Cryo.s
用于细菌培养的14 ml聚丙烯圆底管	BD Falcon	352059
质粒扩增与纯化
pcDNA 3.3_eGFP 质粒	Addgene	26822
One Shot Top10 化学感受态大肠杆菌	Invitrogen	C4040-10
无菌水（Ampuwa）	Fresenius Kabi	1636071
LB培养基（Luria/Miller）	Carl Roth	X968.1	将25 g溶于无菌水中 L-1 。
LB琼脂（Luria/Miller）	Carl Roth	X969.1	将40 g溶于无菌水中 L-1 。
氨苄青霉素现成溶液	Sigma Aldrich	A5354	100 mg/ml
甘油	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27104
mRNA 制备
HotStar HiFidelity 聚合酶试剂盒	Qiagen	202602
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28106
MEGAscript T7 试剂盒	Life Technologies	AM1334
5-甲基胞苷-5´-三磷酸	Trilink	N1014	5-甲基-CTP
假尿苷-5´-三磷酸	Trilink	N1019	假-UTP
3´-O-甲基化-m7G(5´)ppp(5´)G RNA 帽结构类似物	New England Biolabs	S1411L
RiboLock RNase 抑制剂	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µl
TURBO DNase	Life Technologies	AM1334	2 U/µl（来自MEGAscript T7试剂盒）
南极磷脂酶	New England Biolabs	MO289S
RNeasy 小量试剂盒	Qiagen	74104
RNaseZap 溶液	Life Technologies	AM9780
转染
Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen	11668-019	阳离子脂质转染试剂
Opti-MEM I 减血清培养基	Invitrogen	11058-021	改良的最低必需培养基（MEM），可减少胎牛血清（FBS）的添加量
凝胶电泳
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539
Gelred 核酸染色剂	Biotium	41003	水溶液中10,000倍
peqGOLD Range Mix DNA 标准分子量标记	Peqlab	25-2210
流式细胞术分析
CellFIX（1x）	BD Biosciences	340181	10倍浓缩液
用于插入片段扩增和poly(T)尾PCR的引物
正向引物（HPLC级）10 µM	Ella Biotech		5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´
反向引物（HPLC级）10 µM	Ella Biotech		5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´
设备
细胞培养箱	Binder		CO2（5%）和O2（20%）
CASY 细胞计数器	Schärfe System
无菌操作台	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
细菌培养箱	Incutec
水浴锅
ScanDrop 分光光度计	Analytic Jena
PCR仪	Eppendorf
微量离心机	Eppendorf
涡旋振荡器	peqlab
恒温混匀仪	Eppendorf
电泳用凝胶装置	Bio-Rad
凝胶成像系统	Bio-Rad
FACScan 系统	BD Biosciences
荧光显微镜	Nikon
相差显微镜	Zeiss