共聚焦时间序列成像作为牙科复合材料细胞相容性评价的高效方法

摘要

对牙科复合材料生物相容性研究最多的是其细胞毒性。结合荧光信号定量的3D共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）延时成像，能够对细胞命运随时间的变化进行高灵敏度评估。利用该方法可能是评估牙科复合材料细胞相容性的有效工具。

摘要

普遍认为 体外 细胞与材料相互作用是评价牙科材料生物相容性的重要指标。本研究旨在利用三维共聚焦激光扫描显微镜（3D CLSM）延时成像技术来评估 体外 牙科复合材料的生物相容性。该方法可准确且灵敏地反映与牙科复合材料浸提液接触后细胞的存活率。以用于直接修复的牙科复合材料ELS extra low shrinkage为例进行说明。 体外 采用活/死染色法对培养的原代人牙龈成纤维细胞进行评估。使用FV10i共聚焦生物倒置系统获取图像，并通过FV10-ASW 3.1软件进行分析。图像分析显示，在接触测试复合材料5小时后，细胞毒性极轻微。与对照组细胞相比，接触测试复合材料浸提液的细胞显示出轻微的活力下降。研究结果突出了三维激光扫描共聚焦显微镜（3D CLSM）延时成像作为一种敏感方法，在定性和定量评估牙科复合材料生物相容性行为中的应用价值。

引言

ISO 推荐标准中用于定义生物相容性的主要标准之一，是材料对细胞无毒性。基于树脂的牙科复合材料可能从树脂基质中释放出某些成分，这种释放可能最初是由于聚合不完全，和/或随后随时间推移因降解过程所致^1-4。这些释放的成分会与口腔组织接触，可能带来多种不良影响，例如荨麻疹和黏膜反应⁵、患者发生过敏及超敏反应⁶、牙龈成纤维细胞形态改变以及 I 型胶原蛋白减少⁷、对有丝分裂原诱导的纯化 T 淋巴细胞和脾细胞增殖产生免疫抑制或免疫刺激作用⁸，以及对原代人牙龈成纤维细胞造成 DNA 损伤，提示其具有遗传毒性潜能⁹。多种因素可能影响牙科复合材料的毒性，例如材料的色号、光照固化方式、树脂单体的化学组成、填料类型以及转化程度^10-13。由于体外（in vitro）材料毒性潜能可预测体内（in vivo）情况，并可通过研究某些相关终点指标与临床情况相比较，因此牙科复合材料及其组分的细胞毒性已广泛采用细胞培养系统进行评估^14-16。

这些 体外 已开发出用于评估牙科复合材料生物相容性的系统，主要通过THP-1类单核细胞检测细胞增殖和细胞凋亡¹⁷人牙龈成纤维细胞的细胞毒性¹⁸，HaCaT 角质形成细胞样细胞中的炎症潜能²，成牙本质样MDPC-23细胞的细胞功能¹⁹，总RNA水平降低，以及人牙龈角质形成细胞凋亡显著增加²⁰ 牙龈和牙髓成纤维细胞中的DNA损伤²¹.

目前提出了多种方法用于评估牙科复合材料的生物相容性。其中，比色法因操作相对简单且成本较低，仍是最常用的方法，该方法涉及特定染料及光吸收度的测量^22-26。相比之下，利用明场对比的显微分析通常耗时更长且成本更高。然而，这些显微技术具有一些重要优势：通过观察细胞结构，可以获得有关毒性效应的更详细信息，从而提供更具相关性和敏感性的数据。特别是共聚焦显微镜技术的引入²⁷，相较于传统的宽场荧光显微成像，显著提高了轴向分辨率。因此，共聚焦成像已成为医学与科学研究多个领域中一种强有力的分析工具。与电子显微镜技术不同，扫描共聚焦显微镜可通过引入特异性荧光标记物，实现对细胞不同组分的可视化。大多数此类特异性示踪剂在水环境中稳定，可灵敏检测、价格低廉且无毒²⁸，因此既可用于临床研究，也可用于实验室研究。此外，与常规电子显微镜分析所需的样本干燥和固定步骤不同，时间序列共聚焦成像无需这些处理，因而可在样本上实现时间依赖性的连续图像采集。与二维成像相比，共聚焦成像原理能够实现样本亚表面的可视化，并通过获取不同深度的图像重建三维结构，从而获得更精确、更丰富的结构细节^{29, 30}。本视频研究即为三维时间序列共聚焦激光扫描显微技术（3D-CLSM）结合活/死细胞荧光标记及信号定量分析的一种创新性应用实例。本文所介绍的技术优势在于，能够在不改变待测细胞结构的前提下，实现对活细胞的高灵敏度评估和时间序列成像，且共聚焦分析前无需任何样本预处理步骤。此前，相同的染色方法曾用于评估培养的松质骨核心的存活率³¹，但未进行共聚焦时间序列追踪；类似的时间序列共聚焦方法也曾用于根据革兰氏染色类型，评估红霉素对活性污泥中细菌的时间-杀菌活性³²，所用为特异性细菌活/死染色法。这些方法近期已被改进并用于比较基于甲基丙烯酸酯单体的牙科复合材料的毒性¹¹。

方案

该方案包含三个主要步骤：第一步为在培养基中制备复合提取物；第二步涉及人原代牙龈成纤维细胞（HGF）的细胞培养、细胞与复合提取物的接触以及细胞染色；第三步包括共聚焦成像和荧光信号分析。关于牙龈组织的获取，本方案已根据法国法律法规，经知情同意并获得当地伦理委员会批准。

1. 复合提取物的制备

使用杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）作为浸提介质。确保试样表面积与浸提液体积之比达到 ISO 10993/12 要求的最低水平。该方法最近已有描述¹¹，简要步骤如下：

1. 使用定制夹具制备未固化牙科复合材料的球形样品。夹具半径为 2 mm，符合口腔临床治疗中建议的一般固化深度。
2. 准备培养板孔，每孔含有 1 ml 培养基（DMEM），添加 5% 青霉素/链霉素混合液和 1% 两性霉素，但不添加胎牛血清（FBS）。
3. 在含有 DMEM 培养基的孔中，使用 LED 光源灯（光强为 1,070 mW cm^-2，波长 λ = 465–475 nm）照射样品 40 秒以完成固化。确保固化探头与样品之间的距离在 0.5 mm 范围内。采用此固化模式模拟牙齿与未固化牙科复合材料之间的短暂接触。在临床情况下，这种接触发生在修复用复合材料被置入口腔时。
4. 将样品（含复合材料试件的 DMEM 培养基）在 37 °C、5% CO₂ 的湿润空气中孵育。同时，在相同条件下孵育不含复合材料样品的 DMEM 培养基，用于对照细胞实验。

2. HGF 细胞培养、复合提取物检测及细胞染色

1. 细胞培养的生长与维持
   从患者正畸常规拔牙过程中获取的健康牙龈组织活检样本中分离人口腔成纤维细胞。
   1. 在含有10% FBS、5%青霉素/链霉素和1%两性霉素B的DMEM培养基中培养人牙龈成纤维细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中维持培养。₂ 在空气中
   2. 每3天更换一次培养基，每5天传代一次细胞。待细胞达到汇合状态后，用胰蛋白酶消化法收集细胞。
   3. 在 90 × g 条件下离心细胞 5 分钟，并用培养基重悬。使用 Scepter 手持式自动细胞计数器进行细胞计数。
   4. 以 2.5 × 10 的细胞密度悬浮种子细胞⁴ 在腔室载玻片系统中以细胞密度为 cells/ml 接种。将细胞在 37 °C、5% CO₂ 气氛中孵育过夜。
2. 向培养细胞中添加复合提取物
   1. 更换腔室载玻片中两个孔的培养基，加入1 ml待测复合材料浸提液（经24小时孵育后）。
   2. 将剩余的两个孔（对照细胞）保持在相同的条件下。
   3. 将含有四个孔的腔室载玻片置于37 °C培养箱中，在5% CO₂的湿润环境下孵育₂ 在空气中
3. 荧光染色
   根据制造商说明书使用真核细胞活/死细胞毒性染色试剂。
   注意：该试剂盒提供一种快速的双色荧光检测方法，通过细胞膜完整性和酯酶活性来测定细胞群体的存活率。该染色法通过同时使用绿色荧光的Calcein-AM标记细胞内酯酶活性，以及红色荧光的碘化丙啶同源二聚体-1（EthD-1）标记细胞膜完整性的丧失，从而区分活细胞与受损细胞。
   1. 配制含有2 μM Calcein AM和4 μM EthD-1的工作液（该终浓度据报适用于成纤维细胞染色）。将染色液加入培养的贴壁细胞中，可同时加入或不加入选定的复合提取物。
   2. 至少在染色后15分钟内直接且快速地观察染色的细胞群体，并通过延时成像进行。不要离心，也不要固定染色后的细胞。

3. 共聚焦时间序列成像与信号分析

该系统配备四个二极管激光单元，可对每个样本进行最多四种荧光染料的多重染色成像。系统可生成一张概览图像（10倍放大），用于显示测试样本的整体情况，并可在此基础上移动以观察感兴趣区域（600倍放大）。

1. 延时成像
   1. 将样品（含有染色样本的腔室载玻片）放置于共聚焦显微镜集成培养箱的暗室中（37 °C，5% CO₂，湿润环境）。
   2. 选择相应的激光器。使用473 nm（15 mW）和559 nm（18 mW）两个激光源分别激发Calcein和EthD-1。
   3. 采用双通道顺序扫描模式，通过逐行扫描获取图像，避免两种荧光染料成像时的串扰。
   4. 使用配备新型光谱检测器的系统，可依据扫描单元中的荧光染料自动设定检测条件。
   5. 将每个通道检测到的荧光带宽优化至最大。所有图像采集过程应按顺序进行，以避免潜在的信号串扰。
   6. 根据所选荧光染料，利用采集软件选择最合适的成像条件。
   7. 获取一张从中心开始以螺旋模式自动生成的全景图（Map图像），便于选择感兴趣区域进行更详细的观察。
   8. 选择观察模式。根据需要可选择最多五种观察模式，包括延时成像、Z轴层扫和多区域成像等。本研究中采用Z轴层扫与延时成像相结合的模式，并快速完成图像采集。
   9. 更换或切换荧光染料。也可将荧光图像与明场对比图像叠加显示。通过左下角地图界面上选定的位置实时观察活细胞图像。
   10. 利用框选和缩放功能确定成像区域。可选操作：在不同类型荧光染料的显示之间进行切换。
       注意：本实验所用显微镜在紧凑设计中具备与传统高性能共聚焦显微镜相同的功能。该显微镜配备倒置水浸物镜，结合简化的内置培养箱，非常适合活细胞的稳定延时成像。
2. 信号分析与定量
   1. 使用成像软件对荧光信号进行定量分析。对测试样本和细胞对照组均使用10倍物镜获取五张全景图（map images）。
   2. 获得分辨率为1,024 × 1,024像素的常规图像，像素尺寸为0.231 µm × 0.231 µm。将图像以Olympus图像格式（OIF）存储，用于信号分析。该格式可将多种参数设置与图像数据一并保存。使用不同的分析工具（如强度分布曲线测量、两个通道间的荧光强度比值分析）。
   3. 将最大投影图像以12位/像素的TIFF文件格式存储。
   4. 使用R Commander软件进行统计分析。采用单因素方差分析（ANOVA）结合重复性检验分析组间差异。结果以均值±标准差（±SD）表示，统计学显著性定义为p<0.05。

结果

图1展示了对照组和暴露于测试复合材料提取物（ELS 超低收缩率）的细胞在获取的成像图（10倍物镜）中的活/死染色细胞整体情况。在600倍放大倍数下可观察到细胞的三维结构。图2展示了从对照组培养室以及含有测试复合材料提取物的培养室中收集的细胞的可视化图像。最大投影（60倍物镜）显示了选定细胞群体在延时成像开始时（15分钟）和结束时（5小时）的状态。在此期间共获取了57组图像堆栈（xyzt模式扫描，每组包含39张图像，体素深度为1.00 μm）。在暴露组细胞中观察到绿色荧光信号轻微下降，红色荧光信号变化极小。对照组细胞未观察到显著变化。暴露于复合材料提取物的细胞呈现出与对照组细胞相似的纺锤形形态；在这些实验条件下，细胞形态未发生改变（尽管在测试复合材料存在下绿色信号下降而红色信号上升）。针对绿色和红色荧光信号，分别对测试复合材料组和阴性对照组中五组不同细胞群体对应的五组选定图像堆栈进行了图像分析。染色细胞的强度分布如图3所示；与测试复合材料接触的细胞的绿色和红色荧光信号变化趋势与对照组细胞相当。测量了对照组细胞和暴露于复合材料的细胞中钙黄绿素（Calcein）和碘化乙啶-1（EthD-1）的荧光发射强度，测量间隔为每小时一次，持续五小时。在延时成像期间计算了绿色/红色荧光比值（基于绿色495-515 nm和红色620-650 nm信号的积分强度）。对照组细胞和暴露于ELS超低收缩率提取物的细胞的活力比值见表1。在测试复合材料存在下，活细胞比例在接触1小时后从100%轻微下降至93.9%。在指定的延时成像5小时后，测试复合材料组与阴性对照组（未添加任何复合材料提取物的细胞）之间观察到显著差异。

图1： 10倍物镜下的成像图概览，显示染色细胞，（A） 对照组细胞和 （B） 在延时成像初期（t = 15 分钟）暴露于复合材料提取物（ELS 超低收缩率）的细胞。绿色区域为活细胞，红色区域为受损细胞。在此实验条件下，与阴性对照组细胞相比，暴露于复合材料的细胞未观察到荧光信号（绿色和红色）的变化。

图2： 在暴露时间序列的起始和结束时（I：15分钟，II：5小时），分别来自(A)对照组腔室和(B)复合材料提取物腔室的细胞群体在60倍物镜下的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。绿色区域为活细胞，红色区域为受损细胞。图像面板显示荧光信号强度仅有轻微变化（绿色信号轻微减弱，红色信号极轻微增强）。在复合材料提取物存在下，未观察到细胞形态的改变；暴露组细胞与对照组细胞一样，保持其纺锤形和成纤维细胞样形态。

图 3： 延时显微镜下观察到的细胞线轮廓分析。 (A) 对照组细胞 (B) 复合提取物处理的细胞，(I) 接触15分钟时，(II) 接触5小时时。无论接触时间长短，在测试复合物存在下，绿色信号的变化均无明显差异。然而，在接触复合物5小时后，观察到红色信号略有增强。

接触时间（小时）	细胞活力（%）
	1	2	3	4	5
对照细胞	100	100	100	100	100
ELS extra low shrinkage®	93.9 ±7	91.3±5*	89.5±3*	87.6±2*	87.7±3*

表1：人牙龈成纤维细胞与复合材料浸提液接触1、2、3、4和5小时后活细胞率的变化。 细胞活力通过Live/Dead细胞毒性检测试剂盒染色进行测定。数据为五组图像堆栈分析的平均值±标准差。与对照组细胞相比，差异具有统计学意义（p <0.05）。

讨论

生物相容性材料的行为是医疗器械在临床应用前必须评估的首要参数。国际标准 ISO 10993 涵盖了医疗器械的相关要求。³³ 以及特定牙科材料 ISO 7405³⁴周围细胞无毒性反应是评价此类材料生物相容性的关键标准。因此，细胞毒性试验在牙科材料生物相容性评估中具有重要意义^35-37ISO 建议的检测方法可基于代谢活性或膜完整性。所选的检测终点应遵循特定条件，以对受试材料引起的不良效应进行排序，从而最大限度地减少评估实验所需的时间和成本。当前采用的研究方法（3D 共聚焦延时成像）基于膜完整性。细胞毒性评价 通过 该终点似乎是评估细胞与受试材料生物相容性的有价值指标，且已被ISO批准作为检测终点。 体外 检测旨在确定材料样本对特定细胞类型的影响。比色法 MTT 检测最初由 Mossman（1983）描述，作为一种用于测量细胞活性的有用方法 体外 细胞毒性和细胞增殖。MTT 法基于活细胞将四唑盐转化为甲臜结晶，以此测定线粒体活性，该活性可反映细胞活力。³⁸古普塔及其合作者报道，MTT试验是测定复合树脂细胞毒性的最常用方法。此外，琥珀酸脱氢酶和碱性磷酸酶反应也已被用于相同目的。³⁹然而，由于 MTT 实验需要在每个测量时间点杀死细胞，因此无法对细胞命运进行连续追踪。为了在本研究中更密切地监测染色细胞的行为，通过结合短时染色方案、延时共聚焦激光扫描显微成像（CLSM）、自动图像分析及荧光信号定量，实现了对活细胞的直接观察。

牙科复合材料会与口腔组织密切接触，尤其是与牙龈细胞和牙髓细胞。成纤维细胞可能是这些修复用复合材料释放成分的作用靶点^40-41。此外，已有若干研究报道，永生化细胞与原代细胞在接触生物材料时可能表现出不同的细胞反应。研究发现，原代细胞更适用于评估生物材料的影响⁴²。因此，本研究采用原代人牙龈成纤维细胞作为细胞模型，用于评估受试牙科复合材料的细胞毒性。牙科复合材料释放物质的潜在毒性已被广泛研究^43-44。为评估材料的细胞毒性潜力，可采用两种接触模型：在直接接触模型中，材料直接与靶细胞接触；而在间接接触模型中，靶细胞则与生物培养基中的浸提液接触。在临床应用及修复操作中，牙科复合材料通常以间接方式接触牙龈组织。因此，本实验方案重点采用间接接触系统，即人牙龈成纤维细胞与受试复合材料浸提液接触。如 Dahl 及其合作者先前所述，细胞毒性反应根据相对于对照组测得的活性水平分为重度（<30%）、中度（30–60%）、轻度（60–90%）或无细胞毒性（>90%）⁴⁵。因此，根据该分级标准并结合所得结果（表1），ELS 超低收缩复合材料可归类为极轻微细胞毒性，在整个观察期间其表现与对照组细胞相当。采用完全相同的实验方法，本研究结果可与近期发表的一项研究进行比较。ELS 超低收缩复合材料相较于先前测试的两种用于相同临床应用（即直接修复）的复合材料，表现出更优的生物相容性¹¹。未来仍需进一步研究以建立更全面的比较。

在确定批准用于特定终点评估的细胞毒性检测方法时，了解每种检测方法的优势与局限性至关重要。共聚焦成像的主要目的是获得细胞和器官的三维结构。该技术不仅能够揭示样本的表面，还能呈现其内部亚表面结构。本文所述方案强调采用3D共聚焦激光扫描显微（CLSM）延时成像技术，作为一种灵敏的方法来评估 体外 牙科复合材料的生物相容性行为。然而，为避免本研究中遇到的局限性，可采用防振工作台以实现更稳定且更长时间的延时成像；该工作台可使所用共聚焦系统免受实验室振动带来的不利影响。此外，用于口腔内的材料理想情况下应对牙龈组织无害，且不应含有可引起全身毒性的物质。根据本研究所采用的方法及获得的结果，可以得出结论：在当前实验条件下，所测试的复合材料（ELS extra low shrinkage）无细胞毒性。由于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）方法能够灵敏地提供活细胞的初始速率，因此可预见其他方法用于评估更多终点指标。特别是，近期已有报道指出，复合材料的单体可通过活性氧（ROS）对细胞产生影响^46-48，还需要进一步研究以评估细胞毒性信号网络与活性氧（ROS）生成之间可能存在的相关性。未来的实验方案可设计为同时检测ROS生成（H₂O₂ 和/或 O₂^- 染色）和细胞毒性比率（活/死染色），采用时间推移共聚焦激光扫描显微成像技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
奥林巴斯 Fluoview FV10i	Olympus		共聚焦显微镜
O2/CO2 培养箱	Panasonic	MCO 5M	细胞培养
活/死细胞染色试剂盒	Invitrogen	MP 03224	染色剂
ELS 超低收缩率牙科复合材料	Saremco		牙科复合材料
DMEM 培养基	Sigma	D 6046	培养基
胰蛋白酶	Sigma	T1426	细胞收获
腔室载玻片系统	PAA	14220040X	培养腔室
青霉素/链霉素	PAA	P11-010	细胞培养
两性霉素 B	PAA	P11-001	细胞培养
胎牛血清	PAA	A11-101	细胞培养
细胞计数仪	Merck Millipore	00110230TP1	细胞计数