本视频展示了如何在小鼠中获取全身和肝脏血流动力学参数。整个监测过程包括获取小鼠的生命体征参数、全身血压、中心静脉压、肝总动脉血流速率、门静脉压力以及门静脉血流速率。
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本文内容
摘要
摘要
在实验研究中，小鼠模型对于研究肝脏生理学及病理生理学紊乱具有极其重要的意义。然而，由于小鼠体型微小，适用于小鼠的术中监测技术细节很少被详细描述。此前我们已报道了一种用于获取大鼠血流动力学参数的监测方法。现在，我们将该方法改进并应用于小鼠，以获取这一比大鼠小十倍的物种的全身及肝脏血流动力学参数。本视频展示了动物的仪器连接过程以及评估小鼠全身和肝脏血流动力学所需的数据采集流程。在整个操作过程中，持续记录了体温、呼吸 频率 和心 率等生命体征参数。全身血流动力学参数包括颈动脉压（CAP）和中心静脉压（CVP）。肝脏灌注参数则包括门静脉压（PVP）、门静脉血流速率以及肝总动脉的血流速率（表1）。记录正常值所需的仪器连接和数据采集在1.5小时内完成。在此操作过程中，全身及肝脏血流动力学参数均保持在正常范围内。
该操作具有挑战性，但切实可行。我们已将此方法应用于评估正常小鼠、70%部分肝切除术期间以及肝叶阻断实验中的肝脏血流动力学。切除术后（n=20）的平均门静脉压为11.41±2.94 cmH2O，显著高于切除前（6.87±2.39 cmH2O）（P<0.05）。肝叶阻断实验的结果表明，该监测方法灵敏且适用于检测门静脉压力和门静脉血流速率的微小变化。综上所述，该操作在经验丰富的显微外科医生操作下是可靠的，但应仅限于必须使用小鼠的实验研究。
引言
本视频的总体目标是展示一种用于实时监测小鼠全身及肝脏血流动力学参数的方法。开发该方法的依据在于其对小鼠实验干预具有重要价值 需要 获取全身及肝脏血流动力学参数。该方法可应用于未经处理的动物，也可在特定肝胆外科实验性手术干预期间或之后使用，例如部分肝切除术、门静脉结扎术和肝移植术。
在啮齿类动物中获取肝脏血流动力学数据需要采用本文所述的侵入性操作。肝脏灌注无法通过非侵入性方法获得。然而，系统性血压的测量存在替代方法。诸如尾套法8等监测技术已被用于大鼠和小鼠的血压测量。尾套法可用于清醒动物。在测量血压时，动物需要被固定于特定的不适体位。根据尾套仪使用手册，制造商指出小鼠可能会因紧张和应激而导致尾部血液循环减少。在此情况下，于尾部测得的外周血压可能显著低于中心血压。
完整的监测过程采用集成的多通道监测仪，并通过一系列传感器进行数据采集。在显微镜下经精细显微外科分离和暴露相应血管后，通过将导管插入血管内获取血压。通过将超声血流探头放置于每条血管周围来测量血流速率。
我们此前已报道过一种用于大鼠的类似术中监测方法，该方法可获得一系列全面的生理血流动力学数据，这些数据与其他研究团队报道的单个数据具有可比性7。因此，我们认为该方法为将其改进应用于小鼠提供了良好的基础，而小鼠的体型仅为大鼠的十分之一。与大鼠操作方法的关键区别在于，采用Millar导管获取血压数据，而非基于液体的导管系统。血流数据也使用Transonic血流探头获取，但所用探头比用于相应大鼠血管的探头小得多。
由于动物体型较小，对小鼠进行仪器操作在技术上具有挑战性，但可行。一旦完成仪器操作，数据采集和初步生命数据的分析就变得简单，因为可以使用预定义的设置文件。该设置文件只需在一系列实验开始时定义一次，之后可保存并用于所有后续实验。
迄今为止，我们已应用该方法在急性实验中评估肝脏血流动力学效应。我们在70%部分肝切除术（PH）前后以及夹闭/松解实验中立即测量了肝动脉压（CAP）和门静脉压（PVP）。我们首先夹闭代表肝脏质量20%的右叶肝十二指肠韧带，随后短暂夹闭（5分钟）中叶和左外侧叶，总计阻断90%的肝脏血流。松解过程首先从释放右叶的夹子开始，随后松开中叶和左外侧叶。最长夹闭时间少于10分钟。
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方案
饲养及所有操作均符合德国动物福利法规。
1. 传感器校准 （请遵循制造商提供的传感器校准说明）
1.1）Millar 导管校准。在平衡（调零）和校准前，将导管尖端预先浸泡于无菌水或生理盐水中 30 分钟。
- 将Millar传感器连接至桥式放大器的millar1通道，并将Millar传感器的探头插入水柱中。
- 将水柱值设为0 cmH2O。在数据分析软件窗口中选择桥式放大器并将其调零，可设定基线值为0 cmH2O。
- 将水柱值设为20 cmH2O。运行数据分析软件窗口中的进程，然后停止。在桥式放大器窗口中选择“单位”，相应地设置0和20 cmH2O两个基线值，并将“单位”调整为cmH2O。
- 以相同方式校准用于测量CAP的millar2通道（设定两个基线值分别为90和110 cmH2O）。
1.2）血流探头校准
- 将探头放入去离子水中，连接探头与超声血流探头系统。
- 在数据分析软件窗口中，选择输入放大以归零血流探头，并调整单位。
- 按下“测试通道”按钮以采集信号：若信号显示3-4格条，则表明信号良好。若获得良好信号，可继续后续操作。
- 按下“归零通道”按钮并调整通道量程，以确认数值是否已完成校准。
- 按下“测量通道”按钮，为后续测量做好准备。
2. 手术前小鼠的准备
- 将小鼠放入诱导室，使用 2% 异氟烷和 0.3 ml/min 氧气进行麻醉。当小鼠的脚趾夹捏回缩 反射消失时，即可开始手术操作。
- 剃除手术区域的毛发，手术区域包括左侧颈部和腹部。
- 将小鼠置于手术台上，用胶带固定。在眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止手术期间角膜干燥。
- 在颈部下方放置纱布垫，以充分暴露颈部手术视野。
- 对手术区域进行消毒，并用无菌纱布覆盖小鼠身体，仅暴露手术区域。
3. 生命体征测量
- 将心电图针电极插入小鼠的脚掌皮下。
- 将呼吸传感器置于小鼠背部下方。
- 将体温探头插入小鼠直肠内。
- 使用数据分析软件记录小鼠的体温、心电图和呼吸频率。
4. 用于全身心血管监测的颈部手术
4.1）血管解剖
- 确定颈部中线、锁骨中点及下颌角的位置。
- 从下颌角至锁骨中点做一长度为 2 cm 的纵行切口，切口位于颈部中线左侧 0.5 cm 处。
- 解剖下颌下腺，将其翻转并用生理盐水浸湿的纱布覆盖。
- 识别颈静脉，进行解剖，并在静脉下方放置三根 6-0 丝线，用于后续结扎与固定。
- 识别胸锁乳突肌，将其与肩胛舌骨肌上腹及二腹肌后腹分离，并用拉钩牵开，以便充分暴露颈总动脉。
- 解剖颈总动脉，并在动脉下方放置三根 6-0 丝线，用于后续结扎与固定。
4.2）颈动脉血流测量
- 将超声探头放置于颈动脉周围，保持稳定，并使用超声耦合凝胶或生理盐水优化接触。
- 使用数据分析软件记录超声设备小屏幕上显示的颈动脉血流速度。
- 测量完成后移除探头。
4.3）颈动脉压测量（CAP）
- 结扎颈动脉远端，并夹闭其近端。
- 在颈动脉周围放置两根固定缝线。使用10-0 Prolene缝线作为固定缝线。
- 在血管前壁做一个小切口。
- 插入Millar导管，并用预先放置的缝线固定。
- 在数据分析软件中记录CAP。
4.4）颈静脉血流测量
- 提起颈静脉，放置Transonic血流探头以测量血流速率。
- 在数据分析软件中记录血流速率。
4.5）中心静脉压测量（CVP）
- 夹闭颈静脉近端，并结扎远端。
- 使用显微剪刀在血管前壁剪开一个小切口。
- 插入充满液体的导管，并用预先放置的缝线固定。
- 在数据分析软件中记录中心静脉压（CVP）。
5. 获取肝血流动力学参数的腹部手术
5.1）血管识别
- 在腹部做一横向切口。
- 将肠管移向左侧，并用湿纱布覆盖。
- 辨认下腔静脉、门静脉、肝总动脉和肝固有动脉。
- 在整个监测过程中，每隔 5 分钟向腹腔及肠管表面滴加一些温盐水。
5.2）门静脉血流量的测量
- 解剖门静脉。
- 在门静脉下方放置6-0丝线，以便放置血流探头时抬起血管。
- 将Transonic血流探头环绕门静脉，并测量其血流速率。
- 记录门静脉的血流速率。
5.3）测量肝总动脉血流
- 小心解剖肝总动脉。
- 在血管周围放置一根6-0丝线缝合线，以便抬起血管。
- 将血流探头置于动脉周围。
- 测量其血流量并采集数据。
5.4）门静脉压力（PVP）的测量
- 选择一条侧支较少、直接汇入门静脉的肠系膜静脉分支。
- 结扎所选肠系膜静脉的远端，确保结扎位置靠近肠管，并结扎其细小分支。
- 使用6-0 Prolene线在静脉周围放置两针固定缝线。该操作的关键是结扎静脉时避免触碰肠系膜动脉。
- 夹闭门静脉的近端。
- 使用10-0 Prolene线放置两针牵拉缝线。由于牵拉缝线需穿透细小肠系膜静脉的血管壁，因此会出现少量出血。
- 用显微剪刀以45度斜角在静脉上做一小切口。
- 将Millar导管经肠系膜静脉插入门静脉并固定。
- 记录门静脉压力。操作结束后，在麻醉状态下通过放血法处死小鼠。
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结果
小鼠的呼吸频率和心率等生命参数明显高于大鼠。平均体循环血压和颈静脉压与大鼠数值相似，甚至与人类数据相近。
肝脏血流动力学数据明显不同。我们从8只小鼠中获得了正常值。正常小鼠门静脉血流量在1.6至2.3 ml/min之间。肝总动脉血流量范围为0.10至0.35 ml/min。正常动物门静脉压范围较宽，为4.4至11.2 cmH2O，平均值为8.09 ± 2.47 cmH2O（表1）。这种较宽的范围可能导致在比较少量正常动物组的平均值时出现微小但无统计学意义的差异。
由于我们观察到个体间差异较大，尤其是在门静脉压力方面，因此我们检测了该技术是否能够发现较小的个体内差异。我们在两种不同的实验条件下评估了这一操作流程：部分肝切除和肝叶夹闭/松开。同一动物在70%部分肝切除前与切除后即刻的门静脉压力（n=20）相比（图1），升高了2倍，从6.87±2.39升至11.41±2.94 cmH2O（P =<0.001）。这些结果与其他物种...
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讨论
监测肝脏血流动力学是肝病学和肝胆外科研究中的重要工具。获取肝脏血流动力学数据有助于表征肝胆手术对循环系统的影响。此外，在研究影响门脉压力和门脉血流量的药物效应时也需要获取肝脏血流动力学数据，例如，在评估血管活性药物的研究中即需如此。
尽管小鼠体型较小，但仍可对其生命体征、全身及肝脏血流动力学进行监测。该实验方案中的关键步骤如下：首先，整个操作过程中必须将动物置于加热垫上，以防止低体温，因为低体温可能导致循环功能障碍。其次，在解剖小鼠血管时需格外小心，因为小鼠的血管壁非常脆弱且纤薄。最佳做法是通过夹取血管表面的脂肪组织来固定血管壁，而不是直接夹取血管壁本身。第三，在肠系膜静脉周围放置固定缝线时，必须避免意外结扎肠系膜动脉，以免影响动脉供血。
然而，这种侵入性监测技术存在一些局限性。第一，其本身具有侵入性。该监测方法属于侵入性技术，需要进行外科手术干预，因此监测过程本身可能对动物造成副作用。基于此，我们仅在正常动物和急性实验中使用该方法获取血流动力学参数，而未将其用于存活实验。下...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由德国联邦教育与研究部（BMBF）资助的“虚拟肝脏网络”项目支持。感谢耶拿大学医院媒体中心的 Frank Schubert 和 Rene Gumpert 在视频制作和动画创作方面提供的帮助，以及 Isabel Jank 在音频录制方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PowerLab 16/30 | ADInstruments | PL3516 | |
| 四通道桥式放大器 | ADInstruments | FE224 | 桥式放大器 |
| 动物生物放大器 | ADInstruments | FE136 | |
| FE136用针状电极（3个装） | ADInstruments | MLA1213 | |
| 血管周围血流计模块 | Transonic | TS420 | |
| 流量探头 MA0.5PSB/MA1PSB | Transonic | MA0.5PSB/MA1PSB | |
| SPR-1000 小鼠压力导管 | Millar instruments | 841-0001 | |
| 液体填充导管 | Terumo | SR+DU2619PX | 26G, 0.64×19mm |
| 显微剪刀 | F·S·L | No. 14058-09 | |
| 显微止血钳 | F·S·L | No.18055-05 | |
| 显微夹持器施加器 | F·S·L | No. 18057-14 | |
| 直头显微镊 | F·S·L | No. 00632-11 | |
| 弯头显微镊 | F·S·L | No. 00649-11 | |
| 持针器 | F·S·L | No. 12061-01 | |
| 6-0 丝线 | ethicon | ||
| 6-0 普理灵缝线 | ethicon | ||
| 7-0 普理灵缝线 | ethicon | ||
| 10-0 普理灵缝线 | ethicon | ||
| 尾部切除装置 | Kent Scientific | www.kentscientific.com | |
| LabChart7 | ADInstruments | 数据 分析软件 |
参考文献
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