成年秀丽隐杆线虫（C. elegans）的表皮是研究上皮伤口反应的可行模型，包括伤口闭合、瘢痕形成和先天免疫。
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本文内容
摘要
摘要
该 秀丽隐杆线虫 表皮和角质层构成了一层结构简单但功能复杂的皮肤屏障，能够修复因损伤造成的局部破坏。对此模型中伤口反应与修复过程的研究，加深了我们对组织损伤所引发的细胞骨架及基因组反应的理解。最常用于造成该组织损伤的两种方法 秀丽隐杆线虫 成年皮肤的损伤方式包括微注射针穿刺和局部激光照射。针刺损伤会局部破坏角质层、表皮及相关的细胞外基质，还可能损伤内部组织。激光照射则导致更为局限的损伤。损伤会引发一系列易于检测的反应，包括表皮钙离子水平升高2+ （数秒至数分钟）、伤口部位含肌动蛋白环的形成与闭合（1-2 小时）、抗菌肽基因转录水平升高（2-24 小时）以及瘢痕形成。几乎所有野生型成年动物均可在损伤后存活，而伤口修复或其他应答缺陷的突变体则表现出存活率下降。本文提供了针刺和激光损伤的详细实验方案，以及用于定量和可视化检测伤口应答与修复过程的检测方法（Ca²⁺ 动态、肌动蛋白动态、抗菌肽诱导及存活率）。
引言
皮肤伤口愈合机制具有基础生物学意义，并与人类健康密切相关。脊椎动物和哺乳动物的伤口愈合涉及多种组织和信号通路协调的一系列复杂反应1。许多简单的遗传模式生物也具备修复皮肤伤口的能力2。因此，研究易于进行遗传操作的皮肤伤口修复模型具有重要意义。我们及其他研究者已开始将秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为皮肤伤口愈合的新模型加以利用3,4。本实验方案的目标是使更广泛的研究人员能够使用C. elegans作为研究表皮伤口愈合分子与细胞机制的工具。
该 秀丽隐杆线虫 皮肤由表皮（也称为上皮层）和细胞外角质层组成5成年秀丽隐杆线虫的表皮由少数几个多核合胞体构成，其中最大的合胞体称为 hyp7。表皮是一种单层上皮，可在其顶端表面分泌角质层。皮肤能够主动防御穿透性病原体并修复微小伤口。4伤口修复的 秀丽隐杆线虫 皮肤具有较强的韧性，因为几乎所有野生型动物都能存活于由针头造成的小穿刺伤口或由激光照射引起的局部皮肤损伤。 秀丽隐杆线虫 皮肤损伤会引发一系列反应，包括表皮先天免疫反应、伤口闭合以及瘢痕形成4成体表皮处于有丝分裂后状态，其伤口愈合主要依赖局部细胞反应，而非表皮细胞增殖或细胞迁移。我们已证实，皮肤损伤可引发表皮钙离子水平显著且持续升高2+，需要膜上的TRPM通道GTL-2和胞内Ca2+ 储存3表皮Ca2+ 信号对于伤口部位F-actin环的形成与闭合是必需的。损伤还会诱导先天免疫反应，从而激活抗菌肽（AMPs）等基因的转录 nlp-29伤口诱导的抗菌肽（AMPs）转录依赖于表皮细胞自主作用的TIR-1/PMK-1 p38 MAP激酶级联反应4. 钙信号通路中任一环节的缺陷2+ 信号通路或先天免疫反应的异常将导致创伤后存活率降低。由于其结构相对简单， 秀丽隐杆线虫 表皮，其遗传可操作性及优势 在体内 成像使其成为研究伤口修复多个方面的理想体系。
本文介绍了两种常用的损伤方法：针刺损伤和激光损伤。针刺损伤无需特殊设备（除拉针仪外），经过练习后，每天可对数百条线虫进行操作。针刺损伤在生长于琼脂平板上的动物上进行。相比之下，激光损伤则在盖玻片下的琼脂垫上对麻醉的动物进行，适用于活体成像观察细胞对损伤的响应。
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方案
以下方案描述了秀丽隐杆线虫（C. elegans）皮肤损伤及伤口反应检测的详细步骤。
1. 针刺损伤3,4
- 在标准NGM（线虫培养基）平板上培养健康且未饥饿的线虫 E. coli 以OP50细菌作为食物，在20 °C培养箱中保存。
注意：NGM 琼脂平板的制备方法及常规培养方法 秀丽隐杆线虫 可在 www.wormbook.org 找到6. - 将25只L4期线虫挑至新鲜涂布的培养板上，于20 °C培养过夜，伤前1天进行。
- 在造伤前，使用拉针仪从毛细管上拉制针头。造伤所用的针头与显微注射所用的针头相同。 秀丽隐杆线虫.
- 确保所有线虫均处于年轻成虫阶段。将线虫培养板置于冰上约30分钟。低温会使线虫活动减缓，便于针刺损伤操作。
注意：线虫从冰上取出后5分钟内将开始正常活动。活动中的线虫仍可进行损伤操作，但难度较大。有经验者可在5分钟内完成25条线虫的损伤。可使用左旋咪唑等药物使其 immobilize（如激光损伤中所用，见下文），但动物恢复时间将相应延长。 - 将琼脂平板从冰上移至解剖体视显微镜下。使用线虫挑取工具，将25条线虫转移至琼脂平板中央。
- 将针插入100 µl移液枪头中，以便更方便地持握针具。用针刺穿线虫体壁的前部或后部，注意避开性腺。通常应尝试在咽部后端与性腺前端之间，或性腺后端与直肠之间区域造成伤口。针具可重复使用多次，直至断裂。
注意：确保伤口为短暂而轻柔的穿刺，刺破角质层和皮肤，深入动物体内约5-10 µm。针头应大致以直角刺入皮肤。伤口不应造成内部器官明显损伤，或导致身体立即破裂。伤口后可观察到少量细胞质渗出，持续数秒；但如果细胞内容物长时间持续泄漏，动物将无法存活。为获得最佳成像效果，可损伤侧部表皮合胞体（hyp7）或侧部缝线细胞。
注意：本实验步骤涉及使用玻璃针。 - 让线虫在室温下恢复 然后在 20 °C 下培养。通过下述多种检测方法判断针刺损伤是否成功。野生型动物在幼成虫阶段经针刺损伤后，超过 95% 可存活 24 小时。目前尚未对幼虫或更年老的成虫阶段的损伤效应进行广泛分析。
2. 激光损伤3
采用飞秒激光辐照（800 nm）进行更精确的损伤处理。
- 在载玻片上制备含熔化的2%琼脂的琼脂垫7。确保琼脂垫与用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）活体成像的琼脂垫相似。
- 用线虫挑取工具将10条年轻成虫转移至琼脂糖垫上，并加入2 µl的12 mM 左旋咪唑溶液。用盖玻片覆盖线虫及液体。静置1–2分钟，直至线虫完全麻痹。
- 将载玻片置于转盘共聚焦显微镜上。移动载物台以定位线虫，并使用100X 物镜（数值孔径NA 1.4–1.46）对焦于侧部前段或后段的合胞体表皮。
- 将飞秒激光功率设置为140 mW（在物镜前测量）。飞秒激光的重复频率设为80 MHz。
注意：在本实验条件下，每次200毫秒、间隔20毫秒的两个脉冲足以完成损伤操作。 - 对焦至表皮细胞的顶端表面，并对表皮进行激光损伤。观察胞质局部的破裂现象（起泡）或所用荧光标记物的局部漂白现象。
注意：使用飞秒激光时，应遵循相应的激光安全操作规程。在双光子显微镜等设备中使用飞秒激光进行线扫描或点扫描，可提供足够的激光损伤能量。
注意：尽管我们未直接使用其他类型激光器的经验，但原则上常规紫外激光（如用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞消融的激光）也可实现损伤。此外，可选使用转盘共聚焦显微镜的荧光漂白后恢复（FRAP）模块对表皮进行损伤（N. Pujol，个人通讯）。
3. 伤口刺激下表皮Ca2+ 响应的可视化
- 使用在成年表皮特异性启动子 col-19 控制下于表皮表达 Ca2+ 传感器（例如 GCaMP 系列）的转基因 C. elegans 品系（图 1A；转基因品系列于 表 1）。使用表达红色荧光蛋白（如 tdTomato）的转基因作为转基因表达水平的内部对照。
注：我们使用 tdTomato 作为转基因表达的内部对照，因为表皮中的 tdTomato 荧光相对稳定，且不会干扰 GCaMP 成像。 - 针刺和激光损伤均可在表皮中引发 Ca2+ 升高。然而，由于针刺损伤难以在转盘共聚焦显微镜上便捷实施，因此激光损伤更适用于对 Ca2+ 反应进行定量分析（图 1）。
- 使用配备 100X 物镜（NA 1.4–1.46）和适当滤光片组（GFP 滤光片适用于 GCaMP3）的转盘共聚焦显微镜，以多维采集模式获取时间序列图像（时间间隔 2 秒，激发激光曝光时间 114 毫秒）。
注：为观察损伤后较长时间内的 Ca2+ 反应，建议每 30 秒采集一次时间序列图像，持续约 2 小时 。 - 利用图像分析软件，测量十个等效感兴趣区域（ROI）中的平均 GCaMP 荧光强度，其中五个 ROI 位于表皮细胞胞质中心，另五个位于背景区域。
- 通过取损伤前表皮内 5 个 ROI 的荧光强度平均值，减去背景区域 5 个 ROI 的平均值，获得基线荧光强度（F0）。将荧光变化量 ΔF 表示为相对于基线的变化比率 [(Ft−F0)/F0]。
4. 损伤后F-肌动蛋白动态的可视化
- 注意：在针刺损伤后，观察伤口部位出现的肌动蛋白环，该环会逐渐向伤口中心收缩。本实验方案通过测量肌动蛋白环的直径来评估伤口闭合情况。
- 构建表达F-肌动蛋白标记物的转基因线虫，例如在表皮特异性启动子（如col-19）驱动下表达果蝇moesin肌动蛋白结合结构域与GFP的融合蛋白（转基因株系juIs352）（图2A）。
注意：使用其他肌动蛋白结合结构域标记物（如Lifeact或F-tractin）也获得了类似结果（未发表数据）。 - 对Pcol-19-GFP-moesin转基因线虫进行针刺损伤。损伤后约5分钟，可在伤口周围观察到GFP-moesin形成的环状结构。在野生型动物中，该肌动蛋白环的直径随时间逐渐缩小，并在损伤后2–3小时最终闭合（图2A）。
- 在载玻片上制备2%琼脂糖垫，将10条线虫转移至琼脂糖垫上，加入2 µl 12 mM左旋咪唑溶液。使用常规共聚焦显微镜在损伤后1小时对GFP-moesin环进行成像。
注意：使用共聚焦显微镜在损伤后1小时采集肌动蛋白环的z轴层扫图像（13层，每层0.5 µm）。 - 测量损伤后的肌动蛋白环直径。为定量表皮中的GFP-moesin信号，首先对z轴层扫图像生成最大强度投影，然后在GFP-moesin环上绘制4条相互成45°角的线扫描。肌动蛋白环的直径定义为4条线扫描中峰对峰距离的平均值（图2B）。对于已经完全闭合的环，其直径定义为0 µm。
注意：在野生型线虫中，损伤后1小时测量F-肌动蛋白环较为合适，因为此时大致处于伤口闭合过程的中期。也可在多个时间点进行测量，以获得伤口闭合的动力学曲线。可利用左旋咪唑固定的线虫结合转盘共聚焦显微镜采集伤口闭合的延时成像视频。
5. 表皮抗菌肽的检测诱导
注意：损伤也会在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的皮肤中触发先天免疫反应。编码抗菌肽（AMPs）的基因在表皮中被诱导转录。神经肽样蛋白基因 nlp-29（nlp-29）是一种在损伤后强烈诱导表达的抗菌肽4。为了检测表皮在损伤后如何调控AMP的表达，可利用转基因报告系统或实时PCR来测定单个AMP转录本的水平。
- 用于检测创伤引起的先天免疫反应的转基因报告基因实验4.
- 对表达转基因报告基因的成年动物进行针刺损伤（如方案1所述） frIs7 含有 Pnlp-29-GFP和 Pcol-12-DsRed 作为内参对照。在 GFP 长通滤光片下观察未受伤的成年动物，呈现深红色或橙色。
注意：损伤野生型蠕虫将诱导 Pnlp-29-GFP 表达，但不会影响 Pcol-12-dsRed，使得线虫在GFP长通滤光下呈现橙色、黄色或绿色。p38 MAPK通路中基因功能的丧失，例如 pmk-1 或 nsy-1 将被阻止 nlp-29- 伤口后GFP诱导4. Pnlp-29-幼虫阶段高水平表达GFP - 在年轻成年动物中进行AMP诱导实验。确保未受伤的对照动物中GFP水平较低。
注意：Pnlp-29-GFP 表达也由渗透压胁迫诱导8，并可能对其他环境胁迫敏感。 - 损伤后6小时，记录具有P表型的线虫数量nlp-29-GFP 诱导（图3)9 使用带有GFP长通滤光片的荧光解剖显微镜。
注意：在损伤后1小时nlp-29-GFP 表达明显被诱导，在损伤后约 6 小时达到峰值，随后在损伤后 24 小时内持续维持在较高水平。通过视觉评分对表达水平进行定量分析4,9. 或者，使用荧光激活蠕虫分选仪定量表达水平4对于线虫分选仪，至少需要损伤50只动物。 - 实时荧光定量 PCR 检测各抗菌肽基因转录水平。检测多个基因的转录水平： nlp-29, nlp-30, cnc-1 和 cnc-5.
- 在野生型或突变型线虫上进行针刺损伤（参见方案1）
- 在所需时间点收集 50 条受伤的蠕虫和 50 条未受伤的蠕虫（例如 3、6、24 小时
- 使用商业试剂盒，按照制造商说明书提取RNA。
- 使用商业逆转录酶试剂盒进行逆转录反应，获得总量为20 µl的cDNA。
- 对于RT-PCR，每个样本使用0.2 µl cDNA（1/40），并结合含荧光素的绿色预混试剂和0.2 µM引物。为比较RNA质量，使用 ama-1 或 snb-1 以RT-PCR为参照；通过归一化至内参对照，比较AMP的相对表达水平ama-1 或 snb-1），或通过归一化至内参对照，比较损伤后的诱导倍数（损伤 worms 中的 AMP 诱导量 / 未损伤 worms 中的 AMP 诱导量）。
注意： cnc-1 和 cnc-5 是受损伤诱导转录激活的caenacin家族抗菌肽10通常，针刺损伤会诱导表达（约500倍） cnc-14 小时的时间过程中10已发表研究中使用的引物列于 表 2.
6. 创伤后存活率的检测
- 注意：损伤会激活表皮中至少两条独立的信号通路：依赖 Ca2+ 的伤口修复通路和先天免疫反应通路。这两条通路对于无菌损伤后的完全存活均是必需的。为检测某种突变体或 RNAi 处理是否影响伤口愈合，应在损伤后 24–48 小时测量存活率。可选地，可使用常规寿命测定法来确定损伤对寿命的影响4,9。
- 按照上述方案 1，对年轻成虫期（L4 后 24 小时）的线虫进行针刺损伤（每次 50 条线虫，重复多次）。同时维持相同数量未损伤的线虫作为对照。
- 每 24 小时检查一次存活情况（将损伤的线虫每 24 小时转移至新的琼脂平板上）。在伤口修复缺陷的突变体（如 gtl-2 或 tir-1）中，与未损伤的对照动物归一化后，通常在损伤后 24 小时观察到约 50% 的存活率。死亡定义为线虫用挑虫针触碰后无运动反应。
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结果
激光或针刺损伤会引发表皮钙离子水平迅速且持续升高，可通过GCaMP等钙离子传感器观察到这一现象（图1）。钙离子水平的升高在数秒内发生，并可持续数十分钟。针刺损伤可重复性地在伤口部位形成F-肌动蛋白环（图2）；这些肌动蛋白环在数分钟内出现，并在损伤后1–2小时内逐渐闭合 。相比之下，更为精确的激光损伤较少引发肌动蛋白环的形成。无论是针刺还是激光损伤，均可诱导表皮抗菌肽（AMPs）如nlp-29的表达，该现象可通过转录报告系统检测到（图3）。AMP的诱导在损伤后2–4小时内即可显现，持续约24小时。对野生型进行针刺损伤不应显著影响其存活率（在损伤后24小时测定）或寿命。
图1. 激光损伤在秀丽隐杆线虫（C. ele...
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讨论
本文介绍的针刺和激光损伤方法为评估表皮上皮修复损伤的能力提供了互补的手段。激光损伤相对局限，且（根据激光配置的不同）可仅限于表皮层，而针刺损伤则会破坏表皮、角质层以及可能的内部基底膜。针刺损伤可能更准确地模拟了自然环境中病原体或机械损伤所造成的伤口。通常情况下，针刺损伤需要更多练习才能实现既精确又不影响动物存活的伤口。细胞对针刺和激光损伤的反应存在许多相似之处。但需要注意的是，在飞秒激光损伤后，肌动蛋白环的形成并不能被稳定重复观察到。
针刺法的一个局限性在于其造成的伤口并不精确：针头还会损伤内部组织，而这些组织对线虫存活的影响尚未得到研究。对该方案的一个可能改进是结合基于微流控的显微注射系统11与荧光报告基因，以实现更精确的物理损伤。
本文所述的针刺和激光损伤方法虽然简单，但劳动强度较大，通量最多仅为中等水平，因此难以采用基因组学或生物化学方法对损伤反应进行表征。能够穿透角质层的病原体（如真菌或原生动物）12,13 可用于较大规模的动物群体，可能引发与损伤反应部分重叠的反应，但同时会...
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披露
作者们未意识到存在任何利益冲突。
致谢
用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的针刺损伤方法最初由 Nathalie Pujol 和 Jonathan Ewbank 建立；我们感谢 Nathalie Pujol 对本文手稿提出的建议。我们实验室关于秀丽隐杆线虫（C. elegans）表皮损伤修复的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）向 A.D.C. 提供的资助（项目编号：R01 GM054657）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| 塑料培养皿 | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| 左旋咪唑 | Sigma | L9756 | 12 mM |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| 拉针仪 | Sutter Instrument | P-2000 | |
| 线虫挑取针（铂金丝） | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 溶液 | 自制 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O 定容至 1 升。高压灭菌处理 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | 每 50 条线虫使用 500 µl |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR 仪 | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96 孔 PCR 板 | Bio-Rad | MLL9601 | |
| 图像分析软件 | Molecular Devices | Metamorph |
参考文献
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 Forthcoming.
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 Forthcoming.
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
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