一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

摘要

RNA-Seq 分析在揭示非模式生物适应性状分子基础方面正变得越来越重要。本文介绍了一项从蚊子饲养、RNA测序到RNA-Seq数据的生物信息学分析，用于鉴定滞育与非滞育状态的白纹伊蚊（Aedes albopictus）之间差异表达基因的实验方案。

摘要

光周期滞育是一种重要的适应性机制，它使个体通过一系列生理变化（尤其是发育停滞和代谢降低）来逃避严酷的季节性环境。通过RNA-Seq进行全基因表达谱分析，可深入揭示光周期滞育的转录调控机制。亚洲虎蚊Aedes albopictus是研究滞育转录基础的理想模式生物，因其易于饲养、滞育可高效诱导，并具有丰富的基因组资源。本文稿提供了一个通用的实验流程，用于鉴定A. albopictus中由滞育诱导引起的转录差异。文中详细记录了蚊虫的饲养技术、诱导滞育与非滞育发育所需的条件、种群滞育率的估算方法，以及蚊虫RNA的提取与完整性评估。从Illumina测序仪获取的RNA-Seq数据处理流程最终生成一组差异表达基因列表。代表性结果表明，该方案可有效识别因光周期差异而在A. albopictus中转录水平上差异调控的基因。通过适度调整，该流程可便捷地应用于其他蚊类中滞育或其他重要生活史特征的转录基础研究。

引言

下一代测序（NGS）技术的快速发展为研究多种非模式生物中遗传上复杂的生态适应现象的分子基础提供了令人振奋的机遇^1–3。这一方法具有极强的推动力，因为它为具有特别有趣和/或已有详尽描述的生态学或进化历史的生物，以及具有实际意义的生物（如农业害虫和疾病传播媒介）的群体基因组学和功能基因组学研究奠定了基础。因此，NGS 技术正推动生态学领域的快速发展，并有望解决诸如理解生物对当前快速气候变化的响应机制⁴、入侵物种的扩散⁵以及宿主-病原体相互作用^6,7等重要问题。

下一代测序（NGS）技术在生态学和进化生物学基础与应用研究中具有巨大潜力，部分原因在于这些方法能够以适中的成本应用于任何生物体，且成本水平在大多数研究实验室可承受范围内。此外，这些方法能够提供全基因组范围的信息，而无需预先具备 先验的 基因资源，例如微阵列芯片或完整基因组序列。然而，为了最大化高通量测序（NGS）实验的产出效率，必须仔细考虑实验设计，包括RNA取样的发育时期和组织特异性等问题。此外，分析这些实验所产生的海量数据（通常多达数亿条DNA序列读段）所需的技术技能一直是一个特殊挑战，并限制了NGS技术的广泛应用。

近年来，关于入侵性且具有重要医学意义的蚊子Aedes albopictus滞育转录....

方案

1. 两种幼虫的培育 A. albopictus 从幼年到成年

1. 将两个光周期培养箱的可编程光照设置为 21 °C，以实现最佳的滞育表达¹⁶ 相对湿度约为80%。
   1. 将一个培养柜设定为16小时光照：8小时黑暗的光周期（非诱导滞育的光周期）；将第二个培养柜设定为8小时光照：16小时黑暗的光周期（诱导滞育的光周期）¹³.
   2. 在同一时间启动两个培养柜的“开灯”程序，以同步不同光周期之间的昼夜节律时间。 
2. 计算实验所需的卵量，每个笼子准备300-500个卵。为进行RNA制备，至少需要三个重复的滞育组笼子和三个重复的非滞育组笼子。总计需 约 每次实验产卵 1,800–3,000 枚。
   1. 将卵纸浸入水中以孵化卵 约 500 ml 去离子 H₂O.
   2. 添加 约 1 ml 食物浆液，由磨碎的狗粮和卤虫组成，制备方法同前文所述²⁴用网罩盖住容器，并用橡皮筋固定网罩。
   3. 放入LD光周期培养柜中 约 24 小时
3. 将孵化的幼虫转移至盛有10 x 10 x 2 cm的培养皿中 约 90 ml 去离子 H₂O. <....

结果

两种代表性RNA样品的荧光测定结果显示，在约2,000 nt处出现两条条带（图1A、B）。昆虫28S核糖体RNA由两条通过氢键连接的多核苷酸链组成，这些氢键易被短暂加热或破坏氢键的试剂所打断³⁵。由此产生的两个组分大小均与18S核糖体RNA相近。第二种RNA样品显示出高度降解（图1B）。

对一组代表性的白纹伊蚊（A. albopictus）进行光周期处理后，短日照条件下饲养的蚊虫滞育率较高，而长日照条件下饲养的蚊虫滞育率较低，尽管不同重复组之间存在一定的变异（表2）。例如，重复组SD2的滞育率（80%）低于其他重复组（87.18%–97.67%）。该重复组的样本量也最小，因此建议为滞育率测定保留足够数量的卵（>150枚），以获得准确的结果。

对成年雌性 A. albopictus 的一个代表性文库进行测序后读段清洗，去除了大量读段（读段总数从 83,853,32.......

讨论

本方案介绍了由于光周期诱导的白纹伊蚊（A. albopictus）滞育而导致差异表达基因的研究方法。该方案的意义在于，它独特地结合了蚊虫饲养与生物信息学技术，使得分子生理学研究项目的各个实验环节均可为初学者所掌握——特别是针对光周期滞育反应的研究人员。据我们所知，现有方法在蚊虫饲养方案的细节方面并未提供足够详尽的信息——而这些细节往往是识别饲养过程中错误所必需的；同时，也未对饲养阶段的实验设计提供指导，以支持后续成功的生物信息学分析。本文所述方法已针对白纹伊蚊（A. albopictus）进行了优化，尤其是饲养方法，通常从一个实验室世代到下一个世代需要六周时间。然而，在未来应用中，只需进行适度调整，该方法也可适用于其他表现出光周期滞育的蚊种²³。此外，该实验设计通式及生物信息学分析流程也可推广应用于其他多型现象的研究。

在饲养过程中，应考虑若干未在方案中详细说明的要点 A. albopictus 幼虫。首先， A. albopictus 可在先前文献所述的多种自然和人工容器生境中发现

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养箱 - 型号 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
可控环境室	Thermax Scientific	N/A	由 Thermax Scientific Products 根据定制规格建造的步入式可控环境室，是培养箱的更大替代方案。http://thermmax.com/
冷荧光灯泡	Philips	392183	4 W
培养皿 100 mm × 20 mm	Fisher	08-772-E
滤纸 20.5 cm	Fisher	09-803-6J
9.5 L 桶	Plastican	Bway Products	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
实用织物-白色蚊帐布	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
弹力袜	Albahealth	23650-040	产品编号 081420
有机葡萄干	Newman's Own	UPC: 884284040255
产卵杯（棕色）	Fisher Scientific	03-007-52	该产品实际为一种琥珀色 125 ml 瓶子，需将瓶口部分切除后使用。
再生纸巾	Seventh Generation	30BPT120
模块化方形特百惠套装	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
玻璃研磨器	Corning Incorporated	7727-2	这些 Tenbroeck 组织研磨器用于破碎卵并释放 RNA 到 TRI 试剂中。
TRI 试剂	Sigma Aldrich	T9424	每 50–100 mg 组织加入 1 ml TRI 试剂。注意 — 该试剂有毒。
TURBO DNA-free	Ambion/Life Technologies	AM1907	该试剂盒比传统的 DNase 处理后接苯酚/氯仿纯化方法产量更高，且使用更简便。
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	广泛应用于工作台表面及可能接触 RNA 样品的任何设备。该溶液呈弱碱性/腐蚀性，可能引起刺激，吞咽后有害。
2100 生物分析仪	Agilent Technologies	G2939AA	每块芯片最多可加载 12 个 RNA 样品。
Hemotek 膜饲喂装置	Hemotek	5W1	该系统 提供 5 个可同时使用的饲喂站。包括 PS5 电源单元和电源线；5 个 FUI 饲喂器 + 食物储液罐和 O 形圈；塑料塞、Hemotek 胶原蛋白饲喂膜；温度设定工具；以及塞子取出工具。公司邮寄地址为：Hemotek Ltd；Unit 5 Union Court；Alan Ramsbottom Way；Great Harwood；Lancashire, UK；BB6 7FD；电话：+44 1254 889 307。
数字温度计及探头	Hemotek	MT3KFU	MicroT3 温度计和 KFU 探头。用于设定每个 FUI 饲喂单元的温度。
鸡全血，非无菌，含柠檬酸钠	Pel-Freez Biologicals	33130-1	500 ml 血液分装为 20 ml 等份，于 -80 °C 冻存，最长可保存 1 年。使用前在室温下解冻至少 1 小时。