实验和生物信息学议定书光周期滞育的亚洲虎蚊的RNA序列分析，白纹伊蚊

Summary

RNA-Seq 分析对于鉴定非模式生物中适应性状的分子基础变得越来越重要。在这里，描述了一种鉴定滞育和非滞育白纹伊蚊之间差异表达基因的方案，从蚊子饲养到 RNA-Seq 数据的 RNA 测序和生物信息学分析。

Abstract

光周期滞育是一种重要的适应，它允许个体通过一系列生理变化来逃避恶劣的季节性环境，最明显的是发育停滞和新陈代谢减少。通过 RNA-Seq 进行全局基因表达分析可以为光周期滞育的转录机制提供重要的见解。亚洲虎蚊 Aedes albopictus 是研究滞育转录基础的杰出生物，因为它易于饲养、容易诱导滞育和可用的基因组资源。本手稿介绍了鉴定白纹 A. 滞育诱导的转录差异的一般实验工作流程。记录了饲养技术、诱导滞育和非滞育发展所需的条件、估计种群滞育百分比的方法以及蚊子的 RNA 提取和完整性评估。处理来自 Illumina 测序仪的 RNA-Seq 数据的工作流程最终会得到一系列差异表达基因。代表性结果表明，该方案可用于有效鉴定由于光周期差异而在 A. albopictus 转录水平上受到差异调节的基因。通过适度的调整，该工作流程可以很容易地适应研究其他蚊子滞育或其他重要生活史特征的转录基础。

Introduction

新一代测序 （NGS） 技术的快速发展为探索各种非模式生物中各种遗传复杂生态适应的分子基础提供了令人兴奋的机会 ^1-3。这种方法非常强大，因为它为具有特别有趣和/或描述良好的生态学或进化历史的生物体以及实际关注的生物体（如农业害虫和疾病媒介）的种群和功能基因组学研究奠定了基础。因此，NGS 技术正在推动生态学领域的快速发展，并有可能解决诸如理解生物对快速当代气候变化的反应机制基础⁴、入侵物种的传播⁵ 以及宿主-病原体相互作用^6,7 等问题。

NGS 技术在解决生态学和进化生物学中的基础和应用问题方面具有非凡的潜力，部分原因是这些方法可以以适中的成本应用于任何生物体，这对大多数研究实验室来说是可行的。此外，这些方法提供了全基因组信息，而无需先验遗传资源，例如微阵列芯片或完整的基因组序列。然而，为了最大限度地提高 NGS 实验的生产率，需要仔细考虑实验设计，包括 RNA 采样的发育时间和组织特异性等问题。此外，分析这些实验产生的大量数据（通常高达数亿个 DNA 序列读数）所需的技术技能一直是一个特殊的挑战，并限制了 NGS 方法的广泛实施。

最近关于侵入性和医学上重要的白纹伊蚊滞育转录基础的 RNA-Seq 研究提供了一个有用的示例，说明一些实验方案可用于成功应用 NGS 技术研究非模式生物中复杂生态适应的分子基础 ^8-10。A. albopictus 是一种高度入侵的物种，原产于亚洲，但最近入侵了北美、南美、欧洲和非洲^11,12。像许多温带昆虫一样，温带种群 A. albopictus 通过进入一种称为光周期滞育的休眠状态来度过冬天。在 A. albopictus 中，蛹和成年雌性暴露在短（秋季）日照中会导致产生滞育卵，其中胚胎发育完成，但卵绒毛膜内的噬菌幼虫进入发育停滞，使卵对孵化刺激难以^15-17。滞育蛋比非滞育蛋更耐干燥^5,18 并且含有更多的总脂质¹⁹ 。因此，白纹蚜虫的光周期滞育是一种母系控制的适应性表型可塑性，这对于在温带环境中冬季的严酷条件下生存至关重要。尽管光周期滞育在多种昆虫中的生态意义广为人知^20,21，但这种关键适应的分子基础在任何昆虫中都没有得到很好的表征²²。在白纹蚜虫等在噬态幼虫阶段经历胚胎滞育的生物体中，了解母亲接收到的光周期信号如何传递给后代，并在胚胎发育过程中持续存在，从而在噬态幼虫阶段停滞，仍然是一个特别引人注目的挑战。

该协议描述了蚊子饲养、实验设计和 NGS 实验（转录组测序）的生物信息学分析，以阐明白纹 A. 光周期滞育的转录成分。该方案可用于白纹蚜蜓 （A. albopictus） 滞育的额外研究，可用于研究其他密切相关物种的滞育，例如其他经历卵滞育的伊蚊²³，并且更普遍地与采用 NGS 方法研究任何昆虫中任何复杂适应的转录基础相关。

Protocol

两个A. 1.苗种培育白纹伊蚊组以共创成长

1. 设置两个光周期柜带有可编程照明在21℃为最佳滞育表达¹⁶和大约80％的相对湿度。
   1. 计划一个机柜为16L：8D光：暗周期（非滞育诱导LD光周期）。设置第二个柜的8L：16D光：暗周期（滞育诱导^）13。
   2. 程序“灯”在同一时间在两个机柜来同步光周期之间的昼夜时间。
2. 计算来执行实验所需的蛋的数量。瞄准每笼300-500鸡蛋。至少有三个复制滞笼和三个复制所需的RNA生成非滞育笼。这总计为长约每个实验1,800-3,000鸡蛋。
   1. 孵化的鸡蛋鸡蛋浸入到的论文约 500ml的去离子H ₂ O.的
   2. 添加 CA。1毫升食物制备由地面狗食和盐水虾如前所述^24。覆盖容器目，并保持网格代替用橡皮筋。
   3. 放置在LD光照柜约 24小时。
3. 转印孵出幼虫至10×10×2cm的培养皿填充有大约 90毫升去离子H ₂ O.
   1. 维持每盘约 30幼虫。幼虫转移到清洁的菜肴每48-72小时，例如每周一，周三和周五^{（MWF）24。}
   2. 饲料约 1毫升食物浆每个​​MWF包括地面狗粮和盐水虾去离子水如前面所述^24。
4. 设立三到四个成年笼子每个光照治疗，其中每个笼包括生物学重复。
   1. 从9.5 L桶相对两侧，切出一个10×14厘米的洞，并且另一个孔15厘米直径的。有限公司版本1.00先用网。切的矫形放养约一英尺长度，和胶水围绕另一孔的内侧一端。
   2. 削减库存关闭，结关的足端 - 开放的，只有当进入笼子的内部需要。对于笼盖，切出的所有的内部，只留下边，并与网孔²⁴代替内部塑料。
   3. 注意光照，复制相关的实验上笼的一侧永久性标记号，笼起始日期等信息。
5. 行成人笼用湿滤纸的底部。挫伤滤纸用足够的去离子H ₂ O来增加局部湿度在笼中，但要避免积水，这可以刺激产卵在滤纸^24上 。每天检查滤纸干燥，再湿必要时。
6. 以产生足够的鸡蛋的RNA库，包括至少100位女性/ 9.5 L CAGE，没有每笼500多蚊子。
7. 收集蛹MWF并将其放置在一个小杯子干净的H ₂澳在不超过50蛹每25毫升H ₂ O.密度蛹杯转移到一个成年人的笼子。笼子放置在相应的光照柜- A.白纹伊蚊蛹的感光^15。
8. 确保日常使得H _{2 O}的杯子是干净，清晰，并去除死蛹，因为积聚死蛹会导致大量死亡。除去H _2Ø杯毕竟蛹出现。
9. 将有机葡萄干上笼提供糖羽化成虫的顶网。监测葡萄干，并改变他们每隔3-5天，以防止霉菌的积累。

2.维护成人为允许交配和产蛋

1. 通过用湿滤纸衬笼底部保持笼子在高湿度（约80％），并提供访问非发霉葡萄干，如上所述（Secti附件1.5和1.9）。

3.吸血

1. 准备血液供给雌性羽化后二至六天之间，以确保女性已经暴露于至少八个无歧义短天前开始产卵的近100％的滞育卵^14。
2. 准备Hemotek膜进给系统。堵塞进料装置进入电源。用调整螺钉调整每个单元的温度升高到37℃。使用电子温度计和探头校准期间测量所述馈送单元的温度。
3. 准备一顿水库。拉伸的胶原膜馈送一个正方形在膳食储存器的孔，并与O形环固定。小心地将去除皱纹的角落;修剪多余的膜用剪刀。
   注：胶原蛋白膜可能不适用于所有蚊种工作顺利，可能需要尝试几种类型，以找到最佳的膜，如果工作有品种较其他A.白纹伊蚊 。封口膜可以很好地淡色库蚊 。
   1. 如果血液被冷冻贮存，在室温下解冻，至少1小时，使用前。
   2. 持这样的膜朝下的库，不支持的，以及该填充端口被朝上。使用移液管或注射器填充储与大约3毫升鸡全血具有柠檬酸钠作为抗凝血剂。轴封采用塑料塞填充端口。
4. 通过拧到它上的馈线的底部传热板的螺栓连接的制备储到馈线。倒置馈线并将其放置在顶笼，膜面朝下，使蚊子可以通过笼的网孔送入。保持馈线上笼约45分钟，以最大限度地喂养。

4.刺激产卵

1. 四，五天后血粉，装备每笼有色深色50毫升Ç向上排列着未漂白种子发芽纸（卵纸）或纹理的非漂白纸毛巾，并与去离子水⁹中途补。如果超过250蚊子是关在笼子里，用两个杯子。
   注：对于小型笼或单女小瓶，在产卵箱“干草输液”可能会增加产卵由于微生物菌群²⁵的气味。

5.收集和储存鸡蛋

1. 在4-5天的血液喂养开始，因为五天后血液喂养产蛋量一般约达到高峰，然后逐渐消退，未来一周蛋收集。
2. 不同的实验用品蛋收集频率。对于一般用途，收集了MWF如期鸡蛋论文。从每个网箱中取出卵子的论文，换上新纸。将在培养皿中，并存储在SD光照内阁最近删除的文件，以避免鸡蛋储存的混杂影响。
3. 让鸡蛋论文重新主要湿2天后产卵，以允许浆膜角质层的形成，从而增加了蛋脱水电阻^26。
4. 大约48小时后收集，干燥蛋露天。干的纸张，这是跛行，微湿的触感，但没有这么潮湿的纸张不是H _{2 O}暗或刺激种蛋。
   注：6.5“×4”文件大约需要3.5小时，晾干。要小心，不要过度干燥蛋的论文，因为这将导致鸡蛋干燥^27。
5. 储备来自LD和SD光周期的额外的鸡蛋，评估滞育发病率和解释的光周期的影响（见测量滞育，第6条）。
6. 对于长期储存，保持蛋纸在21℃和大约80％的湿度在培养皿中。保持培养皿在特百惠的存储容器的水瓶来维持当地的湿度胚胎发育需要四到五天，在21°C。

ove_title“> 6，测量滞育发病率

1. 使用额外预留胚胎（见刺激产卵，第4节）是7-20日龄量化滞育的响应。
2. 记录本上每个蛋的蛋的纸张的数量。
3. 刺激鸡蛋完全淹没个别蛋的论文中90毫升培养皿约80毫升去离子H ₂ O.孵化加入约0.25毫升食物浆。
4. 24小时后相符斜线第一龄幼虫的数目。放置在黑色表面培养皿形象化幼虫和放置一个光源上盘的一侧。幼虫将移动远离光源，允许个别幼虫的明确讯号。用吸管删除单个的幼虫，而计数，以防止个别讲述幼虫。
5. 地方鸡蛋论文在一个新的培养皿中，然后再干燥。再孵化鸡蛋后约1周，再吻合鸡蛋使用上述方法孵化。
6. 地方鸡蛋篇，其余ü正孵化的鸡蛋在新90毫升培养皿约80ml漂白液^28。确保蛋论文在漂白溶液完全淹没，并在通风橱中过夜离开，以避免漂白剂的气味。
   注：漂白溶液可存放约1星期4℃，但应以其他方式进行的新鲜。
7. 使用光学显微镜作为漂白将清除绒毛膜和允许胚，未孵出的卵的可视化检查蛋。如果蛋是胚，卵将具有灰白色色与眼睛显示为两个小的黑点彼此相对的背侧。理货未阴影，鸡胚¹³的数量。
8. 确定滞育率用下列公式计算：％滞育=无。胚未孵化的蛋/（无，孵化蛋+没有。胚未孵化的蛋）×100 ^13。

7. RNA提取鸡蛋/ pharate幼虫

ontent“>注：使用的Trizol在层流罩。

1. 刷蚊卵含胚胎发育或pharate幼虫在不同的发育时间点从卵纸用驼毛刷玻璃磨床。在研磨Trizol法鸡蛋（每50-100 mg组织1毫升），直到完全粉碎。至少使用400的鸡蛋每个库，以产生足够的RNA。
   1. 或者，捕捉冷冻蛋在液氮中，并储存在-80℃下在微量离心管长达一个月磨削中的Trizol之前。
2. 根据制造商的说明在Trizol试剂进行RNA提取，随后用异丙醇沉淀。
3. 治疗用核糖核酸酶净化解决方案或其他代理人的替补，以消除任何残余的核酸，以避免RNA降解。
   1. 把提取的RNA与DNA酶。根据制造商的说明，孵育RNA样品用DNase 30分钟，在37℃。使用1＃181;在一个50μl的反应升DNA酶长达10的RNA微克。增加DNA酶的量，如果有超过10个的RNA微克在一个反应​​。
   2. 通过加入5微升悬浮DNA酶失活试剂灭活脱氧核糖核酸酶。孵育5分钟，在室温下，在孵育期间（平缓涡旋）混合三次。
   3. 离心以10,000 xg离心1.5分钟。传送含有经处理的RNA样本到新管用于后续步骤中的上层清液。
4. 评估总RNA样品用荧光的质量。送样品到适当的仪器完成这个任务，专业设施。该设施将执行片上的凝胶电泳，以确定RNA种类的样品中，通过荧光染料灌输在芯片可视的大小。结果将被返回作为电泳。
   1. 测定总RNA样品的存在或不存在的降解产物的完整性，由此证明存在Ò关于所得到的电泳图（ 图1B）的18S和5S核糖体RNA的峰F之间的峰。

8. RNA测序

1. 送的总RNA样品以足够高的质量（ 图1A）和数量（每个库通常> 3微克），以一个商业测序中心建筑富集配对末端文库的mRNA和mRNA测序，下列标准协议。
2. 如果一个以上的车道被用于测序的单个实验中，分割各个库成两个车道进行测序，以占测序期间车道之间的技术差异。

9. lllumina读清洗

注：图2总结了本协议的生物信息学部分。对于本协议的生物信息学段中使用的所有程序和资源的完整列表，请参阅表1。在此外，补充文件1包含的命令行的示例为下列每个生物信息的协议的步骤。

1. 使用ssaha2 ^29（ 表1），以确定95％的同一性或更高的匹配，以在NCBI UniVec Core数据库（ 见表1），A。 白纹伊蚊 rRNA序列（GenBank中＃L22060.1），和测序适配器（以补充文件1提供了详细的命令行的例子）。通过调整提供的Perl脚本（参考文件2）拆下读对，使用Perl类似的脚本工具或火柴，例如。
2. 与SolexaQA封装³⁰清洁残留读取（ 表1;补充文件1）：修剪的区域用PHRED得分当量小于20使用DynamicTrim.pl的默认设置。
   1. 卸下两个读取短于25个碱基，LengthSort.pl正向和反向同时读取。评价清洁FASTQ文件与FastQC（ 表1的质量） - 尤其是，验证每个碱基序列的质量和每个序列的质量分数均高于20。

10.数字归

1. 在清洁过读取用高棉工具³¹执行一个循环数字正常化（ 表1;补充文件1），具体而言normalize-by-median.py（使用K-聚体大小20，一个覆盖截止20，并且x = 1E10）。
2. 另外，如果一台机器具有高RAM可用（数百GB的），使用三位一体的normalize_by_kmer_coverage.pl脚本（ 表1）。

11. 从头转录组大会

1. 获得访问计算机或计算机集群具有多达256个GB的RAM和24个CPU，取决于组件的尺寸。
2. 使用三一^32（ 表1;补充文件1）组装的数字归读设置成重叠群。为了减少内存使用情况，使用--min_kmer_cov 2。

12.大会评估

1. 从三位一体重叠群输出Assemblathon2项目³³运行assemblathon_stats.pl。这个脚本执行相关的评估装配质量的基本计算，如一些支架，N50，装配组合物，更（ 表1;补充文件1）。

13.注释的组装转录组

1. 执行与参考蛋白质组的组件的BLASTX（ 表1）;蚊子， 果蝇，冈比亚按蚊，库蚊和白纹伊蚊都适合引用。具体来说，格式化参考蛋白质FASTA文件爆炸，随后BLASTX（参考文件1）。

14.地图读取大会使用RSEM ^34（表1）

1. 创建一个谈话到基因图“文件，其中的第一列含有参照基因的ID，并且第二列中的重叠群的ID。在一个电子表格编辑器，交换从BLASTX输出的第一和第二列，而写这些列.txt文件。使用断行程序转换换行符导致.txt文件为Unix格式。
2. 创建从转录FASTA文件中使用RSEM-准备参考脚本，在RSEM包（补充文件1）提供的参考数据集。
3. 分别计算出的表情值用于使用RSEM-计算表达命令，在RSEM包（参考文件1）提供的每个库。作为读出，则使用从读清洗步骤（步骤9.2）得到的配对FASTQ文件。
   1. 如果从生物复制的RNA被分裂成两个车道进行测序，包括在表达式计算两个FASTQ文件来产生一个单一的文件。
4. 从每个文库中表达的结果转换成由另一个p容易地加工成矩阵使用提供的脚本RSEM生成数据矩阵，在RSEM包（参考文件1）提供rograms。

15.差异表达分析

1. 安装R和轧边机（ 表1）。
2. 使用read.delim加载步骤14.3（参考文件1）RSEM结果。如果需要的话，圆的计数为最接近的整数。
   注：磨边机指南推荐的数据集限制为基因的高表达足以检测的意义。
3. 要格式化的磨边机的数据，生成所加载数据文件（补充文件1）DGEList对象。然后，用标准化规范化TMM（参考文件1）中的数据。估计数据（参考文件1）共同和tagwise分散。
4. 找出差异表达的基因与的Benjamini-霍赫贝格校正p值<0.05（参考文件1）。积数倍数变化与丰度（参考文件1）的分布。

Results

两个有代表性的RNA样品荧光显示两个频段约2000新台币（ 图1A，B）。昆虫28S核糖体RNA是由通过氢键，这很容易被简单加热或扰乱氢键³⁵代理人打乱在一起举行了两次多核苷酸链。将所得的两组件是大致相同的尺寸的18S核糖体RNA。第二RNA样品显示出高程度的退化（ 图1B）。

光周期处理一组有代表性A.的伊蚊蚊子导致高滞育发病饲养短天的蚊子，并低滞育发生在饲养长天的蚊子，虽然有重复之间的一些变化（ 见表2）。例如，复制SD2显示低（80％）比其余重复滞育率（87.18％ - 97.67％）。这种重复也有最小SAMPL E尺寸，所以建议预留，以便获得准确的结果蛋（> 150）的滞育测定的足够数量。

后测序读成人A.清洁的一名代表库雌性伊蚊去掉了大量读取（从83853322到52736065共读一代表库）。数字正常化进一步降低总...

Discussion

该协议提出的方法来发现，由于差异表达基因在光周期诱导A.滞白纹伊蚊 。该协议是在于其独特地结合蚊子饲养和生物信息学技术，使访问新手分子生理学方案的所有实验方面显著 - 特别是对那些集中在光周期滞育反应。现有的方法，据我们所知，不提供尽可能多的细节，在饲养协议 - 这往往是要找准饲养的错误 - 他们也不提供在饲养阶段，这将使得下游的成功生物信息学分析的实验设计的洞察力。这里介绍的方法已经被优化A.白纹伊蚊 ，尤其是饲养方式，一般需要6个星期一个实验室一代到下一代。但是，在未来的应用中，这种方法可适于具有适度调整表现出滞育光周期其他²³蚊种。此外，一般的实验设计和生物信息学的工作流程也适用于其他polyphenisms的研究。

在协议中没有详细说明几点应A.饲养时要考虑白纹伊蚊幼虫。首先，A.伊蚊可以在各种各样的天然和人工容器的栖息地如在先前的论文中描述^36,37。用于轮胎地段幼虫用于建立实验室菌落一个公共源中找到。以上在北美32N纬度...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
培养箱 - 818 型	Thermo-Scientific	3751	120 V
受控环境室	Thermax Scientific	N/A	步入式受控环境室，由 Thermax Scientific 产品按照定制规格建造。孵化器的更大替代品。http://thermmax.com/
Cool 荧光灯泡	飞利浦	392183	4 W
培养皿 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
滤纸 20.5 cm	Fisher	09-803-6J
9.5 L 桶	塑料	Bway 产品	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
实用织物 - 蚊帐 白色	Joann	10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
矫形袜	Albahealth	23650-040	产品编号 081420
有机葡萄干	纽曼自己的	UPC：884284040255
产卵杯（棕色）	Fisher Scientific	03-007-52	该产品实际上是一个琥珀色的 125 毫升瓶子，我们看到了它的顶部。
再生纸巾	第七代	30BPT120
模块化伴侣 方形特百惠套装	特百惠		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
玻璃研磨机	康宁公司	7727-2	这些 Tenbroeck 组织研磨机打破鸡蛋并将 RNA 释放到 TRI 试剂中。
TRI 试剂	Sigma Aldrich	T9424	每 50-100 mg 组织应用 1 ml TRI 试剂。注意 —该试剂有毒。
TURBO 无 DNA	Ambion/Life Technologies	AM1907	该试剂盒比传统的 DNase 处理后进行苯酚/氯仿净化产生更高的产量，并且使用更简单。
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	大量涂抹在工作台表面和任何可能与 RNA 样品接触的设备上。该溶液呈微碱性/腐蚀性，可引起刺激，吞咽时有害。
2100 生物分析仪	Agilent Technologies	G2939AA	一个芯片上最多可放置 12 个 RNA 样品。
Hemotek 膜进料器	Hemotek	5W1	该系统提供 5 个可同时使用的进料站。包括 PS5 电源单元和电源线;5 个 FUI 喂食器 + 储粉器和 O 形圈;塑料塞、Hemotek 胶原蛋白饲养膜;温度设置工具;和 插头提取工具。公司的邮寄地址是：Hemotek Ltd;第 5 单元联合法院;艾伦·拉姆斯伯特·韦;大哈伍德;英国兰开夏郡;BB6 7FD;电话：+44 1254 889 307。
数字温度计和探头	Hemotek	MT3KFU	MicroT3 温度计和 KFU 探头。这用于设置每个 FUI 饲喂装置的温度。
鸡全血，非无菌柠檬酸钠	Pel-Freez Biologicals	33130-1	将 500 ml 血液冷冻并分 20 ml 等分试样以 -80 ° 储存;C 最长 1 年。使用前在室温下解冻血液至少 1 小时。