操控小鼠泪腺

摘要

泪腺是一种分支状器官，可产生泪液中的水性成分，对维持视觉和眼健康至关重要。本文描述了小鼠泪腺的解剖及 离体 利用培养技术解析参与泪腺发育的信号通路。

摘要

泪腺（LG）分泌维持角膜结构和功能所必需的水样泪液，角膜是一种对视觉至关重要的透明组织。在人体中，每只眼睛外侧上方的眼眶内各有一个泪腺，通过3至5条导管将泪液输送至眼表。小鼠则具有三对主要的眼部腺体，其中研究最多的是位于耳部前方及腹侧的眶外泪腺（LG）。与其他腺体器官类似，泪腺通过上皮分支形态发生过程发育而成，即在致密的间充质内，单个上皮芽经历多轮出芽和导管形成，最终构建出由分泌性腺泡和导管相互连接而成的复杂网络。这一复杂过程在胰腺和唾液腺等多种其他上皮器官中已有充分记录。然而，泪腺的研究相对较少，调控其形态发生的机制仍不清楚。我们推测，该器官作为模型系统研究不足，可能是由于其定位、解剖和体外培养存在技术困难。因此，本文描述了获取胚胎期及出生后泪腺的解剖技术，以及组织离体（ex vivo）培养的方法。

引言

泪腺（LG）负责分泌维持视力清晰度以及眼表细胞健康、稳态和保护所必需的水样泪液。泪腺功能障碍会导致最常见且严重影响生活质量的眼部疾病之一——水液缺乏型干眼症，其特征为眼部刺激感、畏光以及视力下降¹在人体中，泪腺（LG）位于眼眶外侧端上方，通过3至5条排泄管将泪液输送至眼表。小鼠有三对主要的眼部腺体，其中研究最为深入的是位于耳前腹侧（眶外）的泪腺（LG），其泪液通过一条排泄管输送至眼睛。与其他腺体器官类似，泪腺通过上皮分支形态发生过程发育形成，即在致密的间充质内，单个上皮芽经过多轮的芽体与导管形成，最终构建出由分泌性腺泡和导管组成的复杂互联网络。图1)²在发育过程中，上皮组织不仅由翼腭神经节的副交感神经大量支配，也在较小程度上受到来自颈上神经节的交感神经支配，同时逐渐形成血管化。³. 这些细胞类型之间的相互作用 即 神经元、上皮细胞、内皮细胞和间充质细胞对于成体组织的功能和维持至关重要。然而，调控泪腺发育与再生的分子机制，以及不同类型细胞间通讯如何引导这些过程，目前仍不清楚。

胚胎学的兴起 离体 培养技术已使得多种分支器官的发育与再生通路得以鉴定⁴培养 离体 使研究者能够在明确条件下对器官进行机械、遗传或化学操控，并实时表征器官发育及细胞间相互作用。小鼠的眼外泪腺对此技术具有高度适用性，近期研究已阐明调控....

方案

所有动物实验均严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。该实验方案已获得加利福尼亚大学旧金山分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 小鼠胚胎泪腺（LG）：获取与显微解剖

1. 根据机构科学研究动物伦理委员会批准的程序，使用逐渐升高的CO₂处死定时妊娠的CD-1（或转基因）雌性小鼠₂ 吸入麻醉，随后通过颈椎脱位法处死以在相应的胚胎发育日获取胚胎。将发现阴道栓的当天记为胚胎发育第0天（e0）。
   注意：泪腺（LGs）可以从 e14 单芽阶段开始采集。然而，e16（5 - 10 个芽）胚胎可获得最稳定的结果 离体 培养。
2. 用70%乙醇对小鼠腹部进行消毒。捏起皮肤，使用无菌手术剪在中线处做切口，切开皮肤和腹膜以暴露腹腔。沿每个子宫角顶部的子宫系膜剪下两个子宫角，并将其置于含100单位/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的冷磷酸盐缓冲液（PBS）或DMEM/F12培养基中 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素
3. 使用镊子（#5）将胚胎从羊膜囊中取出，并放入另一个含有冷PBS的无菌培养皿中。注意不要触碰眼睛或头部区域。
4. 将胚胎置于带有透射照明底座的解剖显微镜上。如果胚胎 <e17，执行 步骤 1....

结果

LG通过上皮分支形态发生过程发育。在e14、e15、e16、e17和P2时期解剖获得的胚胎LG的明场图像展示了这一事件。

图1. 泪腺通过上皮分支形态发生过程发育形成。 在 e14、e15、e16、e17 和 P2 时期新鲜解剖获得的胚胎期泪腺明场图像。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

培养和操控LG的多功能性 离体 为研究其发育过程提供了显著优势，包括研究人员能够快速验证假设，以及可进行多种干预以评估上皮细胞、神经元细胞、内皮细胞和间充质细胞如何相互作用从而形成器官。然而，使用该模型时也存在若干局限性。首先，由于该腺体处于离体状态，不再与外周血管系统或神经系统相连，如果所研究的信号通路依赖于神经或血管传递的信号，则可能影响实验结果。^9,10其次，周围非泪腺组织可能提供调控泪腺发育的因子⁴为避免此问题，必须在培养前去除其他非间充质组织成分。第三，目前我们尚无法提供使细胞完全分化为功能完备组织所需的条件。所有器官的体外培养均存在这一问题。 离体 并且可能由多种原因导致，包括缺乏功能性的血管和神经和/或周围组织施加的机械力。尽管存在这些局限性，已在其中发现的机制 离体 培养已证明可在后续中重现 体内 实验，使其成为检验新假设的可靠系统^8,11.

研究表明，发育通路与再生通路存在显著重叠，这表明体外（ex vivo.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含 HEPES 的 DMEM/F12	SH3027101	Thermo Scientific
青霉素-链霉素	P0781	Sigma-Aldrich
牛血清白蛋白溶液	A9576	Sigma-Aldrich
16% 多聚甲醛溶液	15710	Electron Microscopy Sciences	用 1x PBS 稀释至 4%
10x 磷酸盐缓冲液（PBS）	BP665-1	Fisher Scientific
1x 磷酸盐缓冲液（PBS）			由 10x 储存液配制而成
全转铁蛋白（牛源）	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml 水溶液储存液。分装成单次使用量，于 -20 °C 冻存。加入 DMEM/F12 培养基中，终浓度为 50 μg/ml。
L-抗坏血酸（维生素 C）	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml 水溶液储存液。分装成单次使用量，于 -20 °C 冻存。加入 DMEM/F12 培养基中，终浓度为 50 μg/ml。
BioLite 100 mm 组织培养处理培养皿	130182	Thermo Scientific	也可使用未经组织培养处理的培养皿。
带透射光源的体视显微镜	Stemi 2000	Carl Zeiss	任何配备透射光底座的体视解剖显微镜均可使用。
体视显微镜用透射光源底座	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35 mm 组织培养处理培养皿	353001	Corning	也可使用未经组织培养处理的培养皿。
50 mm 未包被玻璃底培养皿	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
宽场荧光显微镜	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	任何荧光显微镜（正置、倒置或体视解剖显微镜）均可用于在低倍镜下通过连接的数码相机监测 GFP 表达。
共聚焦显微镜	TCS SP5	Leica Microsystems	共聚焦显微镜对于观察细胞精细结构是必需的。任何共聚焦显微镜均可使用。
SWISS 微细镊子，#5（11.2 cm）	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	去除上皮层中的间充质组织需要使用尖端精细的镊子。也可使用钨针。
Dumont 标准尖头镊子，#5（11 cm）	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	适用于从胚胎中收获腺体。
可重复使用的塑料手术刀柄，型号 3	4-30	Integra LifeSciences Corporation
不锈钢无菌手术刀片，型号 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro 总 RNA 提取试剂盒	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D 培养基质 层粘连蛋白 I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml 储存液用 DMEM/F12 按 1:1 稀释
定时交配的 Crl:CD1(ICR) 小鼠		Charles River Labs	在妊娠第 14 天收获胚胎（以发现阴道栓当天为第 0 天）。
Nucleopore 轨迹蚀刻亲水膜，孔径 0.1 μm，直径 13 mm	110405	Whatman
定时交配的 Pax6-Cre, GFP 小鼠	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	可选小鼠，用于学习如何定位泪腺（LG）。