利用定制设计的电趋化室研究前列腺细胞的定向迁移

摘要

我们介绍一种在定制的电趋性室中对迁移中的永生化前列腺细胞施加生理电场的方法。利用该方法，我们证明了两株非致瘤性前列腺细胞在电场中表现出不同程度的迁移方向性。

摘要

生理电场具有特定的生物学功能，例如在胚胎发育、神经元轴突生长及上皮伤口愈合过程中引导细胞迁移。对培养细胞施加直流电场 体外 诱导细胞定向迁移，即电趋性。本文展示的二维电趋性实验方法经过改良，采用了定制的聚氯乙烯（PVC）腔室、玻璃表面、铂电极，并结合使用配备电动载物台的显微成像系统对细胞进行实时观察。PVC腔室和铂电极具有较低的细胞毒性，且成本低廉、可重复使用。玻璃表面与电动显微镜载物台提高了成像质量，并允许对玻璃表面进行可能的修饰以及对细胞实施相应处理。我们记录了两种非致瘤性、SV40永生化的前列腺细胞系pRNS-1-1和PNT2的电趋性行为。这两种细胞系表现出相似的迁移速度，均向阴极迁移，但在电趋性中的方向性程度存在差异。本实验方案所得结果提示，pRNS-1-1与PNT2细胞系可能具有不同的内在特性，从而调控其定向迁移反应。

引言

在多种组织中均检测到内源性电场，例如皮肤^{1, 32, 33}和脑组织²。生理电场具有特定的生物学功能，包括指导胚胎发育^{3, 4}、引导神经元突起的生长^{5, 6}，以及促进上皮和角膜伤口的闭合^{1, 7}。体外实验中，对培养细胞施加直流电场可模拟生理电场，并诱导细胞发生定向迁移，即电趋化作用（galvanotaxis）。电趋化现象已在成纤维细胞⁸、鱼类角质形成细胞⁹、人源上皮和角膜角质形成细胞^10-12、淋巴细胞¹³、成神经细胞²以及神经前体细胞¹⁴中得到研究。当暴露于外加电场时，大多数被研究的细胞会定向迁移至阴极（-）端。然而，一些癌细胞，包括高转移性人乳腺癌细胞和人前列腺癌细胞系PC-3M，则会向阳极（+）端移动^{15, 16}。目前已有若干机制被提出以解释电趋化作用或细胞感知电场的能力，包括表皮生长因子（EGF）受体的激活¹²、上皮钠通道的作用¹⁷、PI3K与PTEN的参与¹⁸，以及钙离子的释放^{15, 19}。然而该机制尚未完全阐明，可能存在多种信号通路共同参与电趋化过程。

本文所展示的二维电趋性方法可用于表征贴壁且具有运动能力的细胞的定向迁移行为，既可用于监测单个细胞的迁移^{10, 12, 17}，也可用于研究融合细胞层的整体迁移^{18, 20}。该技术改进自Peng和Jaffe²¹以及Nishimura et al.¹⁰的方法，采用定制的透明PVC腔室，配有可拆卸的盖玻片，便于在电趋性实验后轻松回收细胞，用于免疫荧光成像等后续分析。电趋性腔室的玻璃表面具有光学兼容性，支持高倍率成像以及荧光标记细胞的实时观察。此外，该设计允许对玻璃表面进行改造，例如更换表面包被材料或调控表面电荷。腔室内使用1号盖玻片制成的间隔片，以最大限度减少流经细胞的电流，从而降低焦耳热效应（其产热量与电流平方成正比），避免实验过程中细胞过热。连接用的琼脂盐桥可防止电极与细胞直接接触，同时避免电趋性过程中培养基pH值或离子浓度发生变化。

本研究检测了两种非致瘤性人前列腺细胞系的电趋化性反应。pRNS-1-1²²和PNT2²³均为SV40永生化、生长因子依赖性细胞系，表达上皮标志物细胞角蛋白5、8、18和19，但前列腺特异性抗原（PSA）表达水平较低或无表达。两种细胞系均保持正常上皮细胞的多边形形态，但在核型分析中观察到染色体异常^22,24。尽管pRNS-1-1和PNT2在大多数实验中表现出相似的行为，它们在腺泡结构形成和电趋化性方面仍存在差异。在三维基质Matrigel上，pRNS-1-1细胞可形成具有腔隙、类似正常前列腺腺体组织的中空腺泡结构²⁵；而PNT2细胞则形成无腔隙或极性上皮的实心球状结构²⁶。在本研究中，pRNS-1-1细胞的电趋化反应也强于PNT2细胞。pRNS-1-1细胞中腺泡结构形成与电趋化性之间的关联提示，电趋化信号可能在响应内源性电场的过程中参与调控前列腺腺体组织的运动组织过程，并为区分这两种细胞系提供了进一步的特征依据。

方案

1. 前列腺细胞的培养

1. 将pRNS-1-1和PNT2前列腺细胞在含10%胎牛血清和抗生素-抗真菌剂的RPMI 1640培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下接种于100 mm培养皿中进行培养。每日更换培养基，直至细胞在电趋化实验前达到80%汇合度。

2. 组装趋电性实验装置

1. 组装底部腔室
   1. 用异丙醇擦拭塑料电趋性腔室。使用注射器将海洋级硅胶密封剂涂抹在腔室底面的圆形开口周围，并贴附一块大盖玻片（图1）。用棉签的背面压紧盖玻片，并用棉签擦去多余的胶水。圆形开口可使培养基和电流流经位于两个内侧培养基储液池之间的细胞。
   2. 使用金刚石笔在小盖玻片上划线，切割出6 mm × 25 mm的间隔片。
   3. 将腔室翻转。使用注射器和/或金属刮刀在底部玻璃的两个圆形开口之间涂上两条硅胶，形成一个10 mm × 25 mm的细胞贴附通道表面。在两个圆形开口之间粘贴两片玻璃间隔片。使用棉签背面压紧间隔片，并用棉签和/或牙签擦去多余的胶水。
   4. 将腔室干燥24小时，直至硅胶完全固化。将腔室浸泡在蒸馏水中过夜，以去除胶水中的乙酸残留。干燥后可立即使用，或将其存放在洁净容器中以备后续使用。
      
      图1：底部电趋性腔室的组装。A) 将一块大盖玻片粘附在洁净腔室的底部。B) 在两个圆形开口之间粘贴两片玻璃间隔片，形成一个10 mm × 25 mm的细胞贴附通道。
2. 在电趋性腔室中接种细胞
   1. 根据实验需要准备相应数量的电趋性腔室。每种细胞系或处理条件需使用一个独立的电趋性腔室。用异丙醇擦拭电趋性腔室，用无菌PBS清洗3次，并检查腔室中两个圆形开口之间的液体流动情况。
   2. 将腔室置于无菌细胞培养皿中，在37 °C下平衡15分钟。使用5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化5分钟，使前列腺细胞从培养皿中脱离。加入5 ml含10%胎牛血清（FBS）的PBS中和胰蛋白酶-EDTA。
   3. 将细胞转移至15 ml离心管中，在200 × g、37 °C条件下离心5分钟。吸除上清液，并用1 ml培养基重悬细胞。
   4. 取20 µl细胞悬液加入计数室，计算细胞数量。用培养基将细胞浓度调整至8 × 10⁴ 个细胞/ml。
   5. 从37 °C培养箱中取出电趋性腔室，向每个腔室接种350 µl细胞悬液。
   6. 将接种细胞的腔室置于培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养；可在培养皿中放置湿润的Kimwipe纸或使用湿度培养箱以维持湿度。

图 2：将细胞接种至小室中。 下层小室经干燥并清洁。A) 前列腺细胞经胰蛋白酶消化、计数后转移至小室中，并过夜孵育。B) 在开始成像前，将上层盖玻片固定以密封小室。

3. 组装上层腔室
   1. 在开始成像前组装上层腔室。显微镜一次只能容纳一个电趋性腔室进行成像。为每个电趋性腔室预热 10 ml 培养基至 37 °C。将电趋性腔室从培养箱转移至 37 °C 预热板上。
   2. 用培养基冲洗细胞，去除未贴壁的细胞。在腔室内保留 400 µl 培养基。使用注射器将高真空油脂涂布在两块玻璃垫片的顶部。
   3. 添加一小块盖玻片以密封腔室。用棉签的背面轻轻按压盖玻片。用棉签擦去多余的培养基。
   4. 将玻璃表面干燥，并涂抹高真空油脂以密封盖玻片与腔室之间的缝隙。使用金属刮刀将油脂均匀铺开。向内侧储液槽中加入 4 ml 培养基，并检查储液槽之间的液体流动情况。
4. 制备琼脂桥
   1. 剪取一段长约 2 英寸的 PVC 管（503/16 内径 × 5/16 外径 × 1/16 壁厚），翻转后插入 100 ml 烧杯中。
   2. 称取 200 mg Bacto-Agar，加入含 10 ml 培养基的 50 ml 三角瓶中，配制成 2% 琼脂凝胶。微波加热 30 秒。使用移液管将琼脂凝胶注入塑料管中。将琼脂桥在室温下静置 10 分钟，使其凝固。
   3. 向电趋性腔室的外侧储液槽中加入 2 ml 培养基。将琼脂桥插入内侧和外侧的培养基储液槽中，以传导电流。

图 3：在电趋化室中拍摄细胞。 展示电趋化室最终组装结构的示意图。电趋化室使用高真空油脂完全密封。向储液槽中加入培养基，并将两个琼脂桥插入电趋化室内。随后将电趋化室转移至显微镜载物台上，并连接电极以施加电场。图中展示了组装后电趋化室的侧视图，以说明电流通过琼脂桥及盖玻片之间的空间流经细胞。

3. 时间序列成像

1. 在成像前2小时，将环境培养箱开启并调节至37 °C，循环空气中含5% CO₂。
2. 开启显微镜并启动图像采集软件。校准显微镜载物台，并选择10倍物镜。
3. 将电趋性实验腔室转移至显微镜载物台上，用胶带固定腔室，并对细胞进行聚焦。将电趋性电极插入外侧储液槽，阴极置于右侧。用胶带固定导线和电极。
4. 打开电源盒，向腔室施加电场。使用电压表测量腔室两端的输出电压，使25 mm长的腔室达到2.5伏（100 mV/mm）。通过调节输出电流，在实验过程中维持恒定的电场强度。
5. 在软件中选择跨越腔室的10个点位进行拍摄，生成10段延时录像。设置采集条件为每10分钟一次，持续2小时。
6. 开始录像，并根据需要调节输出电流。
7. 实验结束后，从载物台上取下腔室，用95%乙醇固定细胞。用刀片切开腔室以便清洗并重复使用。

4. 电趋性定量分析

1. 旋转延时录像，并将阴极重新调整至图像顶部。将录像导出至细胞追踪软件。
2. 在每段录像中，于每个时间点手动追踪 10–20 个细胞的 (x, y) 位置（图 4 A, B）。细胞追踪软件将计算迁移距离以及相对于南北方向（即电场的相同取向）的迁移角度（图 4C）。
   注意：平均迁移速度由总迁移距离与总拍摄时间换算得出。方向性由角度转换为余弦值。若细胞迁移方向随机，净余弦值的平均值将接近于零。若细胞直接朝向阴极迁移，余弦值为 +1。若细胞直接朝向阳极迁移，余弦值为 -1。

图4：通过细胞追踪测量迁移方向性。 A) 细胞图像与追踪轨迹线的叠加图。细胞的 (x, y) 位置通过延时录像手动追踪获得。若细胞随机迁移，平均余弦值接近零。B) 然而，若细胞向阴极或阳极定向迁移，则平均余弦值接近 +1.0（阴极）或 -1.0（阳极）。C) 方向性以余弦值表示，该值由迁移角度（θ）转换而来。余弦（θ）等于距离 a（迁移距离）与距离 b（在电场方向上的投影距离）的比值。

3. 保存测量结果。将数据导入数据库应用程序以计算综合结果。
4. 将平均迁移速度和平均余弦值的综合数据导出至电子表格，用于绘制柱状图（图5）。

结果

采用该方法研究了两株前列腺细胞（pRNS-1-1 和 PNT2）。在2小时的过程中，这两株细胞的迁移速度相似，均为 1.0 +/- 0.3 微米/分钟（图 5A）。然而，pRNS-1-1 株对电场的方向性为 0.7 +/- 0.3，而 PNT2 株的方向性为 0.2 +/- 0.8（图 5B）。结果表明，这两株细胞在电趋化性方面存在显著差异（p<0.01，共追踪了100个细胞），提示它们具有不同的细胞信号转导机制，从而导致对位置信号产生不同的定向反应。

...

讨论

细胞的电趋性反应分析一直是许多细胞迁移或生长过程的重要功能指标^{27, 28}。本文中，我们使用一种带有玻璃表面的定制腔室来拍摄两种前列腺细胞系。这些细胞系表现出不同程度的电趋性，我们推测，在建立永生化细胞系的过程中，介导电趋性的蛋白质的细胞内定位或激活可能受到干扰，从而导致电趋性反应的差异。

与在培养皿中制作的其他电趋化室设计相比^{27, 28}，当前设计具有多项优势。首先，玻璃表面适用于成像，且在电趋化实验结束后可取出带有细胞的盖玻片进行免疫染色。本研究中我们使用了10X物镜的低倍放大来监测一群细胞。然而，得益于改进的玻璃光学性能，也可使用60X油镜在更高放大倍数下拍摄单个细胞，以追踪细胞前缘伪足的快速伸展与回缩过程¹⁷，或追踪表达荧光蛋白的细胞。其次，玻璃表面可进行基质蛋白包被^{10, 12}，或制备成带微通道的图案化结构。此外，也可在拍摄前对细胞进行化学处理²⁹。本研究所用的前列腺癌细胞系无需基质包被，而基质包被的需求具有细胞类型依赖性。例如，人角质形成细胞的电趋化需要I型胶原...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞
pRNS-1-1 前列腺细胞			Lee, et al. (1994)
PNT2 前列腺细胞	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
培养基与溶液
RPMI 1640 培养基	Invitrogen	11875-093	使用前预热至 37 °C
优质胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150	以 PBS 配制成 10% 溶液，使用前预热至 37 °C
抗生素-抗真菌素（100 倍浓缩液）	Life Technologies	15240	每 500 ml 培养基中加入 5 ml
2-丙醇	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-	-	137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4 和 1.5 mM KH2PO4 溶于 1,000 ml H2O，调 pH 至 7.4，高压灭菌，使用前预热至 37 °C
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200-056	使用前预热至 37 °C，在 37 °C 条件下处理细胞 3–5 分钟
电趋性装置
电趋性培养室	Precision Plastics Inc, CA		定制设计（1/4" × 2" × 3.5"），无毒透明聚氯乙烯（PVC）材质。设计参数请与作者联系。
电趋性电极	UCD 电工车间		带柔性导线的铂丝线圈电极
电趋性电源箱	Substrate Engineering, CA		定制设计的直流电源输出装置，配备电压表
显微镜盖玻片，大号，45 × 50 mm，1.5 号	Fisher	12-544-F
显微镜盖玻片，小号，25 × 25 mm，1 号	ThermoScientific	3307
金刚石划线笔	ThermoScientific	750
船用级透明硅胶密封剂	3M	051135-08019
高真空润滑脂	Dow Corning	2021846-0807
6 ml 注射器	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo 注射器，1.5 ml	Nichiryo	SG-M
棉签	Purtian Medical Products	806-WC
棉签（Qtips）	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC 软管	Nalgene	8000-9030	内径 5/16，外径 5/16，壁厚 1/16
细菌琼脂（Bacto-Agar）	Difco	0140-01	配制 2% 琼脂溶液
剃须刀片	Personna	74-0001
仪器与软件
台式离心机	Eppendorf	5810R	配备 A-4-62 转子运行
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer 计数板	Nexcelom	CHT4-SD100-002	加入 20 μl 细胞悬液进行计数
培养温度加热板	Bel-Art Scienceware	370150000	用于维持电趋性培养室温度在 37 °C
配备电动载物台和环境控制室的 Eclipse TE-2000 显微镜	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 物镜	Nikon
Retiga EX CCD 相机	Qimaging		制冷型 CCD 相机，单色，12 位
含 5% CO2 的压缩空气	Airgas		特殊订购
Volocity 6.3	PerkinElmer		图像采集软件
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		细胞追踪软件，可自定义用于测量迁移角度
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft