利用定制设计的趋电钱伯斯研究前列腺细胞定向迁移

Summary

我们提出了一种方法，将生理电场施加到定制的电流调节室中迁移的永生化前列腺细胞。使用这种方法，我们证明 2 系非致瘤性前列腺细胞在该领域表现出不同程度的迁移方向性。

Abstract

生理电场供应特定的生物功能，如指导细胞迁​​移在胚胎发育，神经元向外生长和上皮伤口愈合。 体外施加直流电场到培养的细胞诱导定向细胞迁移，或趋电。我们在这里展示的2维趋电方法经修改以定做的聚（氯乙烯）（PVC）的腔室，玻璃表面，铂电极和使用在其上的细胞成像的机动阶段。在PVC室和铂电极具有低毒性，且价格合理和可重复使用的。在玻璃表面和电动显微镜阶段改善图象的质量，并允许可能的修改，以在玻璃表面，并处理该细胞。我们拍摄的两个非致瘤性，SV40永生化前列腺细胞系，PRNS-1-1和PNT2的趋电。这两种细胞系表现出类似的迁移速度和迁移均朝阴极，但它们确实显示出不同程度的方向性的趋电。通过此协议中得到的结果表明，PRNS-1-1和PNT2细​​胞株可具有管其定向洄游响应不同的内在特征。

Introduction

内源性电场在各种组织，如皮肤^1，32，33和脑²检测到。生理电场供应特定的生物功能，包括引导胚胎发育^3，第4，指导神经元突起^5,6的向外生长，促进上皮细胞和角膜伤口闭合^1,7。 在体外 ，施加直流电场来培养细胞模仿生理电场和诱导定向细胞迁移，或趋电。趋电已经研究中的成纤维细胞^8，鱼角化^9，人上皮和角膜角化^10-12，淋巴细胞^13，神经母细胞²和神经元祖细胞^14。当暴露于施加的场，大部分研究细胞的定向迁移朝向阴极（ - ）极。然而，一些癌症的细胞，包括高转移人乳腺癌细胞和人前列腺癌细胞系PC-3M，移动到anodal（+）极^15,16。提出调解趋电或解释的细胞，以感测电场的能力，包括活化几种机制的表皮生长因子受体^12，上皮钠通道^17，PI3K和PTEN的^18，和钙离子释放^15，19，其机制还没有完全理解，这是可能的，多种信号传导途径中涉及趋电。

表征粘附，游动细胞的定向迁移，既可以监视单个细胞迁移^10，12，17或迁移融合细胞的片材^18，20，该技术是由改性后，我们在这里....

Protocol

1.培养前列腺细胞

1. 培养PRNS-1-1和PNT2前列腺细胞上100毫米培养皿在RPMI 1640培养基补充有10％FBS和抗生素-抗真菌剂，在37℃，5％的CO _2。每天刷新培养基，直到细胞达到80％汇合的趋电实验。

2.装配趋电钱伯斯

1. 组装底部室
   1. 擦拭塑料趋电室用2-丙醇。适用的海洋级硅密封剂周围的圆形开口与注射器的腔室的底侧，并附加一个大玻璃罩（ 图1）。采用棉花施用器的背面侧，以向下推动玻璃罩和擦去多余胶用棉签。所述圆形开口允许介质和电流流过位于这两个内层介质储层之间的细胞。
   2. 切一小玻璃罩，使的6毫米x 25毫米垫片用钻石点标记。
   3. 翻转室。应用2条纹的硅胶，用注射器和/或金属刮刀以创建为2圆形开口，底部玻璃之间细胞附着以10mm×25mm的通道表面。胶2片玻璃间隔2个圆孔之间。使用棉涂敷器的背面侧，以向下推隔板和擦去多余胶用棉签和/或牙签。
   4. 干燥室24小时，直至在硅胶固化。浸泡室在蒸馏水过夜以从胶除去乙酸残基。干燥室供立即使用，或在腔室，供以后使用存储在一个干净的容器中。
      

Results

两行前列腺细胞（PRNS-1-1和PNT2）进行了调查用这种方法。在这两个细胞系在超过2小时（ 图5A）的过程类似的速度为1.0 +/- 0.3微米/分钟迁移。然而，方向性的电场是0.7 +/- 0.3的PRNS-1-1线，和0.2±0.8对PNT2线（ 图5B）。结果显示在这两个细胞系的趋电一显著差异（p <0.01，100个细胞被跟踪），这表明它们具有导致不同的定向响应位置线索不同细胞信号传导机制。

趋电前列腺细胞：图5。 A）中.......

Discussion

一个细胞的趋电性反应的分析，一直是许多细胞迁徙或增长的重要功能指标处理^27，28。在这里，我们使用一个特制室玻璃表面拍摄2前列腺细胞系。这些细胞系表现出不同程度的趋电的，和我们推测，细胞内定位或趋电介导蛋白的激活可能产生不死的细胞系，从而导致在趋电响应的观察到的差异的过程中受到干扰。

相比在培养皿^27，28作出其它趋电室的设计中，有几个好处，以目前的设计。首先，将玻璃表面适于成像，并与细胞中的玻璃罩可以趋电对于免疫染色后进行检索。在这项研究中，我们使用的10X物镜低倍率来监视一组细胞。然而，随着THESË改进玻璃光学，所以能够拍摄单个细胞以较高的放大倍率用60X油浸物镜，用于跟踪快速扩展lamellipodial的和缩回的单元¹⁷的前缘，或跟踪标记的细胞的荧光蛋白质。第二，在玻璃表面可以被改性基质蛋白涂层^10,12或图案化的微通道。化学处理，也可以预先拍摄^29日前处理细胞。不需要在这里所用的前列腺细胞系基质涂层，基质涂层是细胞类型依赖性的。例如，I型胶原涂层所需的人角质形成.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
pRNS-1-1 前列腺细胞			Lee， et al. （1994）
PNT2 前列腺细胞	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon， et al. （1995）
培养基和溶液
RPMI 1640 培养基	Invitrogen	11875-093	预热至 37 °C 使用前
牛血清 - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% PBS 溶液，加热至 37 °C 使用前
- 抗真菌剂 （100x）	Life Technologies	15240	将 5 ml 加入 500 ml
培养基 2-丙醇	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-	-	137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4 和 1.5 mM KH2PO<>4 在 1,000 ml H2O，pH 值为 7.4，高压灭菌，加热至 37 °C 使用前
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200-056	预热至 37 °C 使用前，在 37 °C 下处理细胞 3-5 分钟;C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc， CA		定制设计（1/4" x 2" x 3.5"），无毒，透明PVC腔室。请联系作者以获取设计规范。
电流测量电极	UCD 电气车间		铂卷绕电极，带可弯曲电线
电流测量电源箱	Substrate Engineering， CA		定制设计的直流电源输出，带电压表
显微镜盖板，大号，45 x 50 mm，编号 1.5	Fisher	12-544-F
显微镜盖板，小号，25 x 25 mm，编号	1 ThermoScientific	3307
金刚石点标记	ThermoScientific	750
航海级硅密封剂，透明	3M	051135-08019
高真空润滑脂	道康宁	2021846-0807
6 ml 注射器	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo 注射器，1.5 ml	Nichiryo	SG-M
棉涂抹器	普田医疗产品	806-WC
Qtips	Johnson &Johnson	729389
Nalgene 180 PVC 管	Nalgene	8000-9030	503/16 内径 x 5/16 外径 x 1/16 壁
细菌琼脂	Difco	0140-01	制备 2% 琼脂溶液
剃须刀刀片	Personna	74-0001
设备和软件台式
离心机	Eppendorf	5810R	与 A-4-62 转子一起作
Cellometer Auto T4	Nexcelom	自动 T4
测高仪计数室	Nexcelom	CHT4-SD100-002	负载 20 μl 细胞计数解决方案
培养温度 加热板	Bel-Art Scienceware	370150000	将电流测量室保持在 37 °C
Eclipse TE-2000 显微镜，带电动载物台和环境室	尼康
Plan Fluor 10X/0.30 物镜镜头	尼康
Retiga EX CCD 相机	Qimaging		冷却型 CCD 卡马拉，单色，12 位
压缩空气，含 5% CO2	Airgas		特殊订单
Volocity 6.3	珀金埃尔默		图像采集软件
Improvision OpenLab 5.5.2	珀金埃尔默		细胞跟踪软件，并定制用于测量迁移角
FileMaker Pro Advanced，8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 Mac 版	Microsoft