本文介绍一种简单且易于实现的显微成像技术，用于从侧向获取高质量的 Drosophila 成虫及幼虫突变表型的数字视频。
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本文内容
摘要
摘要
Drosophila melanogaster 是研究神经系统功能的强有力实验模型系统。导致神经系统功能障碍的基因突变通常会产生可存活的幼虫和成虫，其运动缺陷表型难以通过文字充分描述，也无法用单张照片完整呈现。然而，当前的科学出版模式支持将数字视频作为补充材料随稿件一同提交。本文介绍一种简单且易于实现的显微技术，用于从侧向获取高质量的 Drosophila 幼虫和成虫表型的数字视频。从侧面记录幼虫和成虫运动的视频具有优势，因为它能够观察和分析异常运动行为中的细微差异和变化。我们已成功应用该技术对三龄幼虫的异常爬行行为，以及成虫突变体的表型和行为（包括理毛行为）进行可视化观察和量化分析。
引言
常见的果蝇 果蝇 黑腹果蝇 是研究神经系统功能的强大实验模型系统1-3神经系统在结构与功能上与人类具有进化保守性，加之遗传操作简便且拥有丰富的遗传学工具，使得 果蝇 用于模拟人类神经退行性疾病的首选模式生物4导致神经系统功能障碍的基因突变通常会产生可存活的突变幼虫和成体 果蝇 运动能力受损。神经系统缺陷突变体中观察到的表型包括成虫运动速率降低、协调异常以及痉挛性运动，以及体壁肌肉蠕动收缩功能障碍和幼虫部分瘫痪。这些表型已被应用于高通量遗传筛选及突变幼虫运动行为检测方法的建立5,6 和成年7-10 果蝇 旨在量化运动功能障碍并鉴定神经系统功能所必需的基因。尽管这些方法在量化幼虫和成虫运动行为方面极为有用，但它们无法提供有关每种特定异常行为的定性信息。例如，虽然突变型三龄幼虫在行为检测中可能表现出运动参数的改变，但尚不清楚这种改变究竟是源于爬行周期中节律性蠕动收缩的异常、整体协调性的缺失，还是后部体壁肌肉的部分瘫痪所致。本文描述了一种简单且易于推广的显微成像技术，可用于获取高质量的数字视频 果蝇 从侧面观察成虫和幼虫的运动表型。从侧面获取的数字视频可直接观察和分析运动行为中的细微差异，从而提供更具信息量的侧视角度。
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方案
1. 体视显微镜系统
注意：尽管本实验方案可轻松适配于几乎任何配备数字相机且具备视频采集功能的体视显微镜系统，但文中仍提供了我们实验室所用系统的具体信息（材料/设备列表）。
- 使用连接商用数码相机的三目体视显微镜采集数字视频。
- 为将商用数码相机连接至体视显微镜的三目端口，需先拆下显微镜光管接口上的½x C接口，替换为1X C接口。
- 将数码相机转接器（43 mm螺纹）安装至1X C接口上。
- 依次安装两个减径环：58 mm转48 mm，以及48 mm转43 mm，以连接数码相机转接器与数码相机的镜头转接套件。
- 将数码相机安装至镜头转接套件上。
- 设置体视显微镜的放大倍数与数码相机的光学变焦，使总放大倍数约为12X （每秒30帧，640 x 480像素）。注意：必须根据三目端口新配置的1X C接口对体视显微镜的放大倍数进行相应校正。
2. 成像 黑腹果蝇 三龄幼虫
- 将一支永久性记号笔固定在连接数字相机的体视显微镜的黑色载物板上，使记号笔帽的侧面占据相机LCD显示器中观察到的视野垂直方向约⅓至¼的范围。使用记号笔帽顶部作为拍摄幼虫的平台，因为它们有多种颜色，可用于颜色编码以区分待拍摄幼虫的基因型。
- 用细头记号笔在记号笔帽表面标出数字相机LCD显示器中所见视野的范围。
- 选择一只三龄幼虫进行拍摄。选择三龄幼虫的标准包括：体长、在生命周期的幼虫阶段是否已从食物中爬出、是否存在前气门和后气门，以及口器颚钩的结构11。确保幼虫清洁，需在水中彻底清洗。
- 使用光纤照明系统从上方照射记号笔帽平台。调节入射光的角度，以获得最佳照明效果。
- 将显微镜聚焦于永久性记号笔帽的边缘。开始采集数字视频。
- 将幼虫放置在记号笔帽侧面，位置大约偏离垂直轴75°，刚好位于视野之外，且使幼虫前端朝向视野方向（图1）。注意：将幼虫置于记号笔帽侧面可使相机从侧方记录其运动。保持幼虫湿润有助于防止其从记号笔帽侧面滑落。但需注意不要使用过多水分，否则水分会附着在幼虫体表，影响其爬行通过视野。
- 用小号画笔轻轻触碰或推动幼虫，促使其爬过视野区域。需保持耐心，因为幼虫通常不配合，往往需要多次将其送回起点，才能使其沿直线爬过视野。
- 连续录制约10–15 min 的数字视频，采集完成后使用数字视频编辑软件裁剪并删除所有不必要的片段。
3. 成年个体成像 果蝇
- 将一只成年Drosophila放入一次性1.5 ml光谱级聚苯乙烯比色皿中。
注意：在行为学分析实验前立即使用CO2麻醉成年Drosophila可能会影响实验结果12。建议在进行行为学测试前，让成年Drosophila从CO2麻醉中恢复24小时13。 - 用一小团棉花塞住比色皿的末端。确保棉花塞得足够紧密，以占据较大的帽内空间，并将果蝇限制在比色皿的较小体积区域。
- 将比色皿放置在体视显微镜的白色载物台板上，并正确对齐比色皿的较小体积区域，使其与数字相机LCD显示器中的视野一致。
- 使用光纤照明系统从上方照射比色皿。调节入射光的角度，以获得最佳照明效果。
- 调节显微镜焦距，并开始采集数字视频。
- 连续录制约30–45 min 的数字视频，采集完成后使用数字视频编辑软件剪辑并删除所有不必要的片段。
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结果
我们已成功运用该技术获取并量化了与功能缺失相关的幼虫行为表型 stathmin 基因图2)14。该 stathmin 该基因编码一种微管调节蛋白，可将微管蛋白二聚体从可溶性微管蛋白池中分离，并结合微管以促进其解聚15,16Stathmin 的功能对于维持周围神经轴突中微管的完整性至关重要14. 破坏stathmin活性在 果蝇 三龄幼虫中出现一种表型，其特征是在爬行周期中每次肌肉收缩的蠕动波过后，身体后部体节向上翻转。这种后部麻痹或“尾部翻转”表型是轴突运输缺陷的典型特征。我们对七种不同基因型三龄幼虫中后部麻痹表型的外显率和严重程度进行了量化 stathmin 通过测量幼虫在爬行周期中尾部抬高相对于水平面的角度来确定突变基因型（表1）。幼虫被确定表现出一种 强健的尾部翻转 如果尾巴抬起的角度大于 40° 爬行时高于水平面 轻柔的尾部翻转 如果尾巴抬起的角度小于 40° 水平以上，且 无尾部翻...
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讨论
黑腹果蝇作为一种研究神经系统功能的模式系统，其优势主要源于现有强大遗传工具与已开发的多种稳健行为检测方法的结合。本文介绍一种简单且易于普及的显微技术，用于获取高质量的数字视频 果蝇 从侧面观察成虫和幼虫的运动表型。我们已成功应用该方法，通过直接测量三龄幼虫在爬行周期中尾部相对于水平轴抬升的最大角度，对神经系统突变体中出现的后肢麻痹“尾部翻转”表型的严重程度进行表征和量化14该方法的优势在于可以从侧方视角采集视频，从而直接观察和分析神经性幼虫和成虫中常出现的异常运动行为。 突变体，采用更具信息量的“侧视”方向。因此，可实现对幼虫蠕动性肌肉收缩的可视化观察 黑腹果蝇，以及成年后的异常步态表型 果蝇 更容易被观察和分析。该技术的一个局限性在于其通量较低。此外，特异性的 果蝇 由于体视显微镜的视场范围有限，导致幼虫和成虫行为只能在较短时间内进行分析。这在采集成虫视频时可能尤为突出 果蝇 行为，因为比色皿腔室的体积明显大于体视显微镜的视野范围。我们通过使用棉质和纸板插入物来减小比色皿腔室的有效体积，限...
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披露
作者声明不存在竞争利益。
致谢
作者谨此感谢Alexandra Opie提供的技术协助与支持，James Barton提供的视频旁白，以及Ramona Flatz和Joellen Sweeney在配套视频中的出镜。本工作由M.J. Murdock慈善信托基金（资助号：2012205，授予JED）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三目体视变倍显微镜 | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C接口被移除，并更换为1X C接口 |
| 1X C接口 | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| 数码相机转接器（43 mm螺纹） | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm转48 mm降级环 | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm转43 mm降级环 | B&H Video | GBSDR4843 | |
| 适用于佳能G10的Lensmate转接套件 | LensMateOnline.com | ||
| 佳能PowerShot G10数码相机 | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml 紫外-可见光分光光度用聚苯乙烯比色皿 | Denville Scientific | U8650-4 |
参考文献
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重印与许可
