从阳性血培养中快速制备细菌沉淀物，可作为样本用于多种应用，如MALDI-TOF鉴定、革兰染色、抗生素药敏试验以及基于PCR的检测。检测结果可快速传达给临床医生，以改善血流感染患者的预后。
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摘要
摘要
血流感染和脓毒症是导致发病和死亡的主要原因。菌血症患者的治疗成功取决于快速鉴定病原体，以指导最佳的抗生素治疗。对阳性血培养物进行革兰染色分析可快速完成，并已能显著影响抗生素治疗方案。然而，仍需准确鉴定病原体，以确定最适宜的靶向治疗。本文介绍一种简单、快速的阳性血培养物细菌沉淀制备方法，该沉淀可作为多种关键下游应用的样本，包括通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定、通过纸片扩散法或自动化药敏系统进行抗生素敏感性试验（AST），以及通过自动化基于PCR的分子诊断检测。将这些不同的鉴定和药敏试验系统直接应用于血培养获得的细菌沉淀时，其性能与常规使用琼脂平板上分离的单菌落所获得的结果非常相似。与传统方法相比，快速获得细菌沉淀显著缩短了病原体鉴定和药敏试验的报告时间。因此，在血培养阳性后，通过MALDI-TOF进行的鉴定可在1小时内报告结果，而通过自动化药敏系统或纸片扩散法获得药敏结果则分别仅需8至18小时。同样，在报告菌血症后不到2小时内，即可将快速PCR检测结果传达给临床医生。综上，这些结果表明，快速制备血培养细菌沉淀对病原体鉴定和药敏试验的周转时间具有显著影响，从而改善血流感染患者的治疗预后。
引言
住院患者中血流感染和败血症是导致发病和死亡的主要原因。因此，与血流感染相关的死亡率在住院患者中约为14%至37%，在重症监护病房患者中可能高达35%1-3。快速鉴定病原体对于指导最佳抗菌治疗方案以及提高抗菌治疗的成功率至关重要4,5。对阳性血培养样本进行革兰染色的快速分析已显著影响抗菌治疗方案的调整6,7，但为了向患者提供最合适的抗生素治疗，仍需准确鉴定病原体。例如，由肠球菌和链球菌引起的菌血症在革兰染色中难以区分，但需要采用不同的抗生素治疗方案。同样，必须进行到种水平的鉴定，以识别携带染色体ampC基因的革兰阴性肠杆菌，该基因可导致对β-内酰胺类抗生素的耐药性增强8。
当血培养呈阳性时，传统的诊断方法是将病原体转种到不同的琼脂平板上，此过程需要额外数小时的孵育，随后通过生化试验、在不同选择性培养基上的生长情况以及自动化微生物鉴定系统等方法进行鉴定。传统诊断方法的报告时间约为1至3天。
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）技术的出现，为快速鉴定微生物提供了新工具，不仅可从琼脂平板上生长的菌落中快速鉴定微生物，还可直接从阳性血培养样本中进行鉴定（图1）9-12。利用 MALDI-TOF 从血培养样本中鉴定病原微生物，已将检测结果的出具时间从传统....
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方案
本方案已在实施为常规工具之前，遵循本机构的研究开发流程和伦理规范进行了开发和验证。
1. 采用氯化铵红细胞裂解法制备血培养细菌沉淀
- 准备阳性血培养物以进行后续离心。
- 对血培养瓶瓶盖进行消毒。在瓶盖上加入70%乙醇并点燃。
注意：此步骤不得在超净工作台内进行。 - 将培养瓶转移至超净工作台。用20 G注射器吸取5 ml血培养物。
- 将5 ml血培养物加入含有45 ml无菌水（H2O）的50 ml离心管中，并混匀样品。
- 对血培养瓶瓶盖进行消毒。在瓶盖上加入70%乙醇并点燃。
- 通过裂解离心法制备血培养细菌沉淀。
- 在室温下以1,000 × g离心10分钟。
- 使用实验室真空泵移除上清液（主要含H2O和血细胞）。
- 将沉淀重悬于1 ml自制氯化铵裂解液（0.15 M NH4Cl，1 mM KHCO3）中。通过刮擦和涡旋震荡管壁使沉淀充分分散，然后在室温下以140 × g离心10分钟。
- 弃去上清液（主要含红细胞碎片）。
- 若沉淀仍呈血性，将其重悬于2 ml无菌蒸馏H2O中以进一步裂解残留红细胞并洗涤沉淀。在室温下以140 × g离心10分钟，然后弃去上清液。
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结果
在Prod’hom进行的研究中 等15，通过氯化铵裂解离心法从78例患者的122份阳性血培养样本中获得细菌沉淀，随后采用MALDI-TOF MS进行分析。在122份阳性血培养样本中，95份（77.9%）被准确鉴定至种水平，1份（0.8%）鉴定至属水平。其余26份（21.3%）血培养沉淀物无法通过MALDI-TOF获得可靠鉴定。其中，21份为革兰阳性菌，包括13份链球菌和5份凝固酶阴性葡萄球菌。值得注意的是，13份未鉴定出的链球菌中，有10份为 肺炎链球菌 通常具有难以裂解的荚膜，且与某些物种难以区分 S. mitis 使用 MALDI-TOF MS 进行分组。有五种革兰氏阴性菌未能通过 MALDI-TOF 鉴定，其中包含四种难以裂解的包被细菌物种，包括两种 肺炎克雷伯菌 以及两个 流感嗜血杆菌因此，通过MALDI-TOF对血培养沉淀物的正确鉴定率为78.7%，相较于传统方法对在琼脂平板上生长的细菌菌落进行鉴定所获得的84.1%鉴定率，表现出了较为高效的性能 11.
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讨论
与传统的血培养阳性诊断方法相比，采用氯化铵裂解离心法快速获取细菌沉淀物，可将鉴定结果报告时间缩短16至24小时，将药敏试验（AST）结果报告时间缩短24至48小时（图1和图3）。
及时启动适当的抗生素治疗对改善血流感染患者的预后至关重要。因此，在1小时内快速鉴定病原体，随后在约8至16小时内获得快速药敏试验（AST）结果，对脓毒症患者的临床管理具有重大意义。快速报告革兰染色结果已被证实对优化抗菌治疗具有显著影响，从而降低患者的发病率和死亡率6,7。当血培养肉汤的革兰染色结果为阴性或弱阳性时，可对血培养沉淀物进行革兰染色以提高检测灵敏度（图4）。然而，建议直接对原始血培养肉汤进行革兰染色，以便观察典型的微生物形态，例如成簇分布的葡萄球菌或链状排列的链球菌。在一项针对202例血流感染病例的近期前瞻性研究中，通过MALDI-TOF MS从血培养沉淀物中进行病原体鉴定，在35.1%的病例中影响了抗生素治疗方案，而革兰染色仅在额外20%的病例中产生进一步影响8。值得注意的是，当MA.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢洛桑大学医院中心细菌学实验室的技术人员，感谢他们帮助我们在实验室中实施这些技术。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20 G 针头 | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon 管 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml 离心管 |
| 氯化铵 | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| 碳酸氢钾 | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | 易燃，腐蚀性 |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | 急性毒性 |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | 易燃，急性毒性 |
| 三氟乙酸 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | 腐蚀性，急性毒性 |
| Vitek 2 60 仪器 | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | 自动化微生物系统仪器 |
| Vitek 2 革兰氏阳性菌（GP）鉴定卡 | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | 自动化 GP 鉴定卡 |
| Vitek 2 AST-P580 卡 | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | 自动化微生物 AST 系统 |
| Vitek 2 革兰氏阴性菌（GN）鉴定卡 | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | 自动化 GN 鉴定卡 |
| Vitek 2 AST-N242 卡 | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | 自动化微生物 AST 系统 |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | 核酸扩增技术 MRSA 检测试剂 |
| GeneXpert IV 仪器 | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | 核酸扩增技术仪器 |
| Microflex LT MALDI-TOF 质谱仪 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 靶板钢 BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI 靶板 |
| Densitometer Densicheck 仪器 | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper 试剂盒（50 次） | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| 麦康凯琼脂 | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| 穆勒-欣顿琼脂 | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | 穆勒-欣顿琼脂（MH） |
| MHF 琼脂 | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | 穆勒-欣顿琼脂-苛养菌琼脂（MHF） |
| BD 哥伦比亚 III 琼脂 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | 血琼脂 |
| BD 巧克力琼脂 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | 巧克力琼脂 |
| BD Schaedler 琼脂 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler 琼脂 |
参考文献
- Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
- Angus, D. C., et al.
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