需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

血培养沉淀物的制备用于快速细菌鉴定和抗生素敏感性检测

36K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/51985

⸱

2014年10月15日

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

本文内容

摘要

从阳性血培养中快速制备细菌沉淀物，可作为样本用于多种应用，如MALDI-TOF鉴定、革兰染色、抗生素药敏试验以及基于PCR的检测。检测结果可快速传达给临床医生，以改善血流感染患者的预后。

摘要

血流感染和脓毒症是导致发病和死亡的主要原因。菌血症患者的治疗成功取决于快速鉴定病原体，以指导最佳的抗生素治疗。对阳性血培养物进行革兰染色分析可快速完成，并已能显著影响抗生素治疗方案。然而，仍需准确鉴定病原体，以确定最适宜的靶向治疗。本文介绍一种简单、快速的阳性血培养物细菌沉淀制备方法，该沉淀可作为多种关键下游应用的样本，包括通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定、通过纸片扩散法或自动化药敏系统进行抗生素敏感性试验（AST），以及通过自动化基于PCR的分子诊断检测。将这些不同的鉴定和药敏试验系统直接应用于血培养获得的细菌沉淀时，其性能与常规使用琼脂平板上分离的单菌落所获得的结果非常相似。与传统方法相比，快速获得细菌沉淀显著缩短了病原体鉴定和药敏试验的报告时间。因此，在血培养阳性后，通过MALDI-TOF进行的鉴定可在1小时内报告结果，而通过自动化药敏系统或纸片扩散法获得药敏结果则分别仅需8至18小时。同样，在报告菌血症后不到2小时内，即可将快速PCR检测结果传达给临床医生。综上，这些结果表明，快速制备血培养细菌沉淀对病原体鉴定和药敏试验的周转时间具有显著影响，从而改善血流感染患者的治疗预后。

引言

住院患者中血流感染和败血症是导致发病和死亡的主要原因。因此，与血流感染相关的死亡率在住院患者中约为14%至37%，在重症监护病房患者中可能高达35%1-3。快速鉴定病原体对于指导最佳抗菌治疗方案以及提高抗菌治疗的成功率至关重要4,5。对阳性血培养样本进行革兰染色的快速分析已显著影响抗菌治疗方案的调整6,7，但为了向患者提供最合适的抗生素治疗，仍需准确鉴定病原体。例如，由肠球菌和链球菌引起的菌血症在革兰染色中难以区分，但需要采用不同的抗生素治疗方案。同样，必须进行到种水平的鉴定，以识别携带染色体ampC基因的革兰阴性肠杆菌，该基因可导致对β-内酰胺类抗生素的耐药性增强8。

当血培养呈阳性时，传统的诊断方法是将病原体转种到不同的琼脂平板上，此过程需要额外数小时的孵育，随后通过生化试验、在不同选择性培养基上的生长情况以及自动化微生物鉴定系统等方法进行鉴定。传统诊断方法的报告时间约为1至3天。

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）技术的出现，为快速鉴定微生物提供了新工具，不仅可从琼脂平板上生长的菌落中快速鉴定微生物，还可直接从阳性血培养样本中进行鉴定（图1）9-12。利用 MALDI-TOF 从血培养样本中鉴定病原微生物，已将检测结果的出具时间从传统方法所需的数小时至数天大幅缩短至几分钟。正如 Croxatto et al. 13 所述，MALDI-TOF 鉴定的效率依赖于多种参数，包括微生物的纯度和数量。这两个条件在琼脂平板上分离的单个菌落中易于获得，但从血培养等复杂样本中进行鉴定时，则需要进行分析前处理，以实现细菌的富集和纯化，因为血培养样本含有多种细胞和蛋白质成分，可能干扰 MALDI-TOF 的鉴定结果。

已有多项研究采用不同的方法从血培养物中分离各种微生物，包括使用皂苷或其他温和去污剂提取细菌的方法9,14、血清分离法10、裂解离心法12，以及商业化试剂盒如Sepsityper试剂盒。本实验室建立了一种基于氯化铵红细胞裂解法的简单血培养细菌沉淀制备方法，可实现通过MALDI-TOF及自动化鉴定系统对细菌和酵母菌进行快速鉴定（图2）15。该血培养沉淀物制备方法还可为其他直接下游应用提供样本，例如革兰染色、基于自动PCR的分子诊断检测（如用于快速检测耐甲氧西林Staphylococcus aureus（MRSA）的POCT-PCR），以及通过自动化AST系统和/或琼脂平板上的纸片扩散法进行抗生素敏感性试验（图3）。

在本研究中，我们描述了根据Prod’hom所述方法制备血培养细菌沉淀物的各个步骤 等15 (图4）。我们还将描述针对血培养沉淀物进行的三种主要应用的实验方案：通过MALDI-TOF进行鉴定 15，使用自动化系统进行鉴定（ID）和抗生素药敏试验（AST） 16 用于 肠杆菌科 和葡萄球菌以及基于自动化PCR的MRSA检测诊断试验 17.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案已在实施为常规工具之前，遵循本机构的研究开发流程和伦理规范进行了开发和验证。

1. 采用氯化铵红细胞裂解法制备血培养细菌沉淀

  1. 准备阳性血培养物以进行后续离心。
    1. 对血培养瓶瓶盖进行消毒。在瓶盖上加入70%乙醇并点燃。
      注意：此步骤不得在超净工作台内进行。
    2. 将培养瓶转移至超净工作台。用20 G注射器吸取5 ml血培养物。
    3. 将5 ml血培养物加入含有45 ml无菌水（H2O）的50 ml离心管中，并混匀样品。
  2. 通过裂解离心法制备血培养细菌沉淀。
    1. 在室温下以1,000 × g离心10分钟。
    2. 使用实验室真空泵移除上清液（主要含H2O和血细胞）。
    3. 将沉淀重悬于1 ml自制氯化铵裂解液（0.15 M NH4Cl，1 mM KHCO3）中。通过刮擦和涡旋震荡管壁使沉淀充分分散，然后在室温下以140 × g离心10分钟。
    4. 弃去上清液（主要含红细胞碎片）。
      1. 若沉淀仍呈血性，将其重悬于2 ml无菌蒸馏H2O中以进一步裂解残留红细胞并洗涤沉淀。在室温下以140 × g离心10分钟，然后弃去上清液。
    5. 将沉淀重悬于200 µl H2O中。
  3. 将血培养物接种至多种选择性和非选择性琼脂培养基进行继代培养。
    1. 用20 G注射器吸取1 ml血培养物。
    2. 将1滴血培养物分别接种至血琼脂、巧克力琼脂、麦康凯琼脂和谢德勒琼脂平板的四个象限中。
    3. 将血琼脂和巧克力琼脂平板置于5% CO2环境中、麦康凯琼脂平板置于普通空气环境中、谢德勒琼脂平板置于厌氧条件下，均于37 °C培养。
    4. 观察不同培养基上的细菌生长情况。
    5. 检查细菌纯度。

2. 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定

  1. 直接从血沉棕黄层进行鉴定。
    1. 取1 µl血沉棕黄层样品点加至MALDI靶板上，置于42 °C加热平台上干燥。
    2. 在样品上覆盖1 µl 70%甲酸，置于42 °C加热平台上干燥。
    3. 在样品上覆盖1 µl MALDI基质（α-氰基-4-羟基肉桂酸在50%乙腈-2.5%三氟乙酸中的饱和溶液），置于42 °C加热平台上干燥。
    4. 使用MALDI-TOF MS系统按照制造商说明进行MALDI-TOF质谱分析。
    5. 若种水平鉴定得分无效（例如得分 < 2），则对血沉棕黄层样品进行蛋白质提取。
  2. 从血培养沉淀物中提取蛋白质后的鉴定。
    1. 将20 µl沉淀物与1 ml 70%乙醇混合，在室温下以13,000 × g离心2分钟。
    2. 弃去上清液，在沉淀物中加入25 µl 70%甲酸和25 µl 100%乙腈。剧烈涡旋振荡以重悬沉淀物。对于难以重悬的沉淀物，可先用移液器吸头反复吹打使其破碎，再进行涡旋。
    3. 在室温下以13,000 × g离心2分钟。取1 µl上清液（含提取的蛋白质）点加至MALDI靶板上，置于42 °C加热平台上干燥。后续操作按步骤2.1.2所述进行。

3. 使用自动化微生物系统进行细菌鉴定和抗生素敏感性试验

  1. 使用自动化微生物系统进行细菌鉴定和药敏试验（AST）的细菌悬液制备。
    1. 准备一支含有 3 ml 与自动化微生物系统兼容的无菌 0.45% NaCl 溶液的塑料试管。
    2. 向 0.45% NaCl 溶液中加入足量的血培养沉淀物，使所得细菌悬液的浊度相当于 0.6 至 0.8 麦氏（McFarland）标准。使用比浊仪测量浊度。
      注：为达到 0.6 至 0.8 的麦氏浊度，血培养细菌沉淀物的体积通常在 50 至 200 µl 之间。
  2. 按照制造商说明，接种用于革兰阳性菌（GP）或革兰阴性菌（GN）鉴定的自动化鉴定卡，以及用于革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌抗菌药物敏感性试验的自动化 AST 卡。
    注：若 MALDI-TOF MS 鉴定得分值 >2，则无需使用 GP 或 GN 卡进行鉴定。通过将细菌悬液接种于血琼脂平板（GP 和 GN）及麦康凯琼脂平板（GN）进行传代培养，以检查细菌悬液的纯度。

4. 采用纸片扩散法进行抗生素敏感性测试

纸片扩散法由欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST，第3.0版，2013年4月，www.eucast.org）规定。

  1. 通过纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验前的细菌悬液制备。
    1. 准备一支含有 3 ml 无菌 0.9% NaCl 溶液的玻璃试管。
    2. 向 0.9% NaCl 溶液中加入适量体积的血培养沉淀物，使所得细菌悬液的浊度相当于 0.5 麦氏（McFarland）标准。使用比浊仪测定浊度。
      注意：为达到 0.6 至 0.8 麦氏浊度，血培养细菌沉淀物的加入量通常为 50 至 200 µl。
    3. 涡旋振荡细菌悬液。
  2. 将细菌悬液接种至穆勒-欣顿琼脂（MH）或适用于苛养菌的穆勒-欣顿琼脂（MHF）（MH 琼脂中添加 5% 脱纤维马血和 20 mg/L β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）平板表面。
    1. 将无菌棉拭子浸入细菌悬液中，然后在玻璃试管内壁轻轻旋转拭子以去除多余液体。
    2. 通过在三个方向涂抹或使用自动平板旋转器，将细菌悬液均匀涂布于 MH/MHF 琼脂平板的整个表面。
  3. 在已接种的琼脂平板上放置抗菌药物纸片。
    1. 手动或使用药敏纸片分配器，将纸片紧密贴放在干燥后的接种琼脂平板表面。
    2. 根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）纸片扩散法（版本 3.0，2013 年 4 月，www.eucast.org）所述的适当温度和培养环境进行孵育。

5. 基于PCR的MRSA自动化诊断检测

  1. 使用微量移液器将 50 µl 血培养沉淀转移至 MRSA 自动化基于 PCR 的诊断检测试剂盒中提供的样本试剂管中，并涡旋振荡 20 秒。
  2. 使用 1 ml 微量移液器将样本加入卡匣的样本入口。将卡匣插入自动化 PCR 系统，并按照制造商说明启动检测。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在Prod’hom进行的研究中 等15，通过氯化铵裂解离心法从78例患者的122份阳性血培养样本中获得细菌沉淀，随后采用MALDI-TOF MS进行分析。在122份阳性血培养样本中，95份（77.9%）被准确鉴定至种水平，1份（0.8%）鉴定至属水平。其余26份（21.3%）血培养沉淀物无法通过MALDI-TOF获得可靠鉴定。其中，21份为革兰阳性菌，包括13份链球菌和5份凝固酶阴性葡萄球菌。值得注意的是，13份未鉴定出的链球菌中，有10份为 肺炎链球菌 通常具有难以裂解的荚膜，且与某些物种难以区分 S. mitis 使用 MALDI-TOF MS 进行分组。有五种革兰氏阴性菌未能通过 MALDI-TOF 鉴定，其中包含四种难以裂解的包被细菌物种，包括两种 肺炎克雷伯菌 以及两个 流感嗜血杆菌因此，通过MALDI-TOF对血培养沉淀物的正确鉴定率为78.7%，相较于传统方法对在琼脂平板上生长的细菌菌落进行鉴定所获得的84.1%鉴定率，表现出了较为高效的性能 11.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

与传统的血培养阳性诊断方法相比，采用氯化铵裂解离心法快速获取细菌沉淀物，可将鉴定结果报告时间缩短16至24小时，将药敏试验（AST）结果报告时间缩短24至48小时（图1和图3）。

及时启动适当的抗生素治疗对改善血流感染患者的预后至关重要。因此，在1小时内快速鉴定病原体，随后在约8至16小时内获得快速药敏试验（AST）结果，对脓毒症患者的临床管理具有重大意义。快速报告革兰染色结果已被证实对优化抗菌治疗具有显著影响，从而降低患者的发病率和死亡率6,7。当血培养肉汤的革兰染色结果为阴性或弱阳性时，可对血培养沉淀物进行革兰染色以提高检测灵敏度（图4）。然而，建议直接对原始血培养肉汤进行革兰染色，以便观察典型的微生物形态，例如成簇分布的葡萄球菌或链状排列的链球菌。在一项针对202例血流感染病例的近期前瞻性研究中，通过MALDI-TOF MS从血培养沉淀物中进行病原体鉴定，在35.1%的病例中影响了抗生素治疗方案，而革兰染色仅在额外20%的病例中产生进一步影响8。值得注意的是，当MA...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢洛桑大学医院中心细菌学实验室的技术人员，感谢他们帮助我们在实验室中实施这些技术。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20 G 针头Terumo, Leuven, BelgiumNN-2038R
50 ml Falcon 管BD, Franklin Lakes, NJ, USA35207050 ml 离心管
氯化铵Merck, Darmstadt, Germany101145
碳酸氢钾Fluka, St. Louis, MO, USA 60340
甲酸Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F0507易燃，腐蚀性
α-氰基-4-羟基肉桂酸Fluka, St. Louis, MO, USA 70990急性毒性
乙腈Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 271004易燃，急性毒性
三氟乙酸Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T6508腐蚀性，急性毒性
Vitek 2 60 仪器Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France27202自动化微生物系统仪器
Vitek 2 革兰氏阳性菌（GP）鉴定卡Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France21342自动化 GP 鉴定卡
Vitek 2 AST-P580 卡Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France22233自动化微生物 AST 系统
Vitek 2 革兰氏阴性菌（GN）鉴定卡Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France21341自动化 GN 鉴定卡
Vitek 2 AST-N242 卡Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France413391自动化微生物 AST 系统
Xpert MRSACepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXMRSA-100N-10核酸扩增技术 MRSA 检测试剂
GeneXpert IV 仪器Cepheid, Sunnyvale, Ca, USAGXIV-4-D核酸扩增技术仪器
Microflex LT MALDI-TOF 质谱仪Bruker Daltonics, Bremen, GermanyBDAL microflex LT/SH
MSP 96 靶板钢 BCBruker Daltonics, Bremen, Germany280799MALDI 靶板
Densitometer Densicheck 仪器Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France27208
MALDI Sepsityper 试剂盒（50 次）Bruker Daltonics, Bremen, Germany8270170
麦康凯琼脂Biolife, Milano, Italy4016702
穆勒-欣顿琼脂Oxoid, Hampshire, EnglandCM0337穆勒-欣顿琼脂（MH） 
MHF 琼脂Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France43901穆勒-欣顿琼脂-苛养菌琼脂（MHF）
BD 哥伦比亚 III 琼脂BD, Franklin Lakes, NJ, USA254071血琼脂
BD 巧克力琼脂BD, Franklin Lakes, NJ, USA254089巧克力琼脂
BD Schaedler 琼脂BD, Franklin Lakes, NJ, USA254084Schaedler 琼脂

参考文献

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱纸片扩散法自动化PCR检测氯化铵裂解离心方案麦氏比浊法革兰染色
血培养沉淀物的制备用于快速细菌鉴定和抗生素敏感性检测
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。