适合繁殖的斑马鱼养殖设施 体内 研究可便捷且经济地开展，维护成本极低。该设施非常适合学生参与和独立开展研究。
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方法文章
低成本且易于建造的斑马鱼养殖设施的构建 斑马鱼, 养殖设施, 实验室建设, 水生模式生物, 动物房设计, 成本效益, 实验动物管理, 水循环系统, 实验室基础设施
本文内容
摘要
摘要
体内生物医学研究对于将体外研究成果转化为临床进展至关重要。资源有限的小型学术机构几乎无法建立和维护典型的啮齿类动物研究设施。斑马鱼研究已被证明是在药理学、生理学、发育和遗传学研究中进行体内研究的宝贵替代方案。本文展示了一种简单且经济的方式即可建立功能齐全的斑马鱼设施。我们证明，此类设施可在约一个工作日内，使用最少的工具和专业知识完成建设。本研究中构建的包含27个1.8 L鱼缸的斑马鱼设施成本约为1,500美元。我们估计，维持一个初始规模为150条鱼的种群运行3个月的费用为1,000美元。该项目吸纳了学生参与，使其接触到用于科研目的的斑马鱼养殖技术。
引言
体内模型在开展全面的生物医学研究中至关重要，因为它们能够将体外研究结果转化为系统水平和整体生物体水平的理解。例如，使用小型哺乳动物（主要是啮齿类动物）的研究已被证明对药物研发以及现有药物的优化具有必要性。然而，由于其在经费和后勤方面的复杂性，小型学术研究机构可能几乎无法建立并维持用于实验的啮齿类动物设施。尽管如此，体内研究仍可借助其他对后勤要求较低的动物物种来开展。斑马鱼（Danio rerio）已被成功用作体内模型，用于研究遗传学、发育生物学、病理生理学和药理学1,2,10,11,12。用于实验斑马鱼饲养的设施相对简单，且与啮齿类动物设施相比成本显著更低。Kim 等3 近期详细描述了一套包含80个鱼缸的斑马鱼饲养系统，其建造成本约为1,500美元，已包含材料与人工费用。这与从多家商业供应商处购买现成的80缸系统所需的近8,500美元形成鲜明对比。然而，Kim 等 提供的描述对于鱼类研究的新手而言可能较为复杂且难以理解。我们认为，完全可以用更简化的方案在1,500美元的投资预算内建成一套斑马鱼实验设施。
一种的建立 体内 小型学术机构的设施为其教职员工提供了额外的工具，以开展更深入、更全面的研究。 体外 数据由……支持 体内 结果通常比仅使用单一方法获得的数据更能产生更全面的生物医学研究 体外 方法。因此，实施一种 体内 研究设施将显著提升该机构在整体科研工作中的成效（学生接触科研的机会、论文发表、学术交流、外部经费申请） 等等.).
在资金紧张时期，对于那些设施有限（或没有体内研究设施）的研究型学术机构而言，建立一个如本研究所述的斑马鱼设施是理想的选择。
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方案
注意：这些方案遵循长老会学院动物护理和使用委员会（IACUC）的指南。
1. 获取表1中列出的材料。
2. 根据制造商的说明组装5层铬架。该支架将用于放置设备。
3. 构建储水装置和过滤系统（图1A和图2）。
- 以图1A为参考，布置18加仑水桶、水泵、过滤器和紫外灯，以确定最终安装位置和尺寸。
- 部件布置完毕后，测量并切割¾” PVC管至所需长度，根据具体空间需求和限制调整各管段长度。
- 按照先前布置的方案，使用PVC底漆和胶水组装管道及管件，具体步骤如下（3.3.2 和 3.3.3）。
- 用砂纸打磨管道切口边缘，直至表面光滑且无残留碎屑。
- 使用随PVC底漆附带的棉签，将所购PVC底漆涂抹于管道外壁和管件内壁。
- 使用随附棉签将PVC胶水涂于管道外壁，将管道与管件粘接固定。所有需使用PVC胶水的步骤均重复此操作。
- 将18加仑水桶放置于支架结构的一侧。
- 在储水箱侧壁安装一个贯通接头（bulkhead connector）。
- 将一段¾” PVC管连接至贯通接头。
- 使用¾”螺纹转接头将该¾”管的另一端连接至水泵进水口。
- 使用两个90度弯头和¾” PVC管将过滤器连接至水泵。
- 依次使用一张滤纸和一个活性炭过滤器，以去除水中杂质，并降低氯和化学物质含量。
- 根据制造商说明，将紫外灯连接至过滤器系统。
- 使用扎带将水泵和过滤系统固定在支架第一层的上方。根据所选支架/层板的尺寸和布局，调整组装顺序和固定方式。
- 水泵和过滤系统组装并固定到层板后，在储水箱中每加仑水添加1个生物球。
4. 构建主供液管路（图1B和图2）。
- 测量并截取一段 ¾” PVC 管，用于将紫外灯连接至主供水管路
- 使用一个 ¾” PVC 三通开始安装主供水管线，将该三通与来自紫外过滤器的 ¾” PVC 排气管连接。
- 在 PVC 三通底部安装一个开关阀，作为系统维护冲洗时的排水口。
- 从 ¾” PVC 三通顶部开始主供水管线的铺设：测量并截取所需长度的 ¾” PVC 管，为架子上每一层板提供供水管。
- 为进入架子每一层的水平管路安装 ¾” PVC 三通。
- 可选但建议：为每一层的供水管路添加一个 ¾” 开关阀，以便隔离各层，实现系统的模块化设计。
- 在顶层使用一段 ¾” PVC 管作为减压管路。若该管路沿板层背面铺设，则可将此层用作储物空间。将减压管路末端接入主排气管路（图 1B），并安装一个 ¾” 开关阀。
- 完成上述步骤后，参照此前建造储液槽和过滤系统时的方法，对 PVC 管进行打底并粘接固定。
5. 构建主排气管路（图1C和图2）。
- 从主供气管所在位置的鱼架另一侧，垂直铺设主排气管的全长。使用2” PVC管作为该垂直管道，顶部连接主供气管，并从每层鱼架接收鱼缸的排水管。
- 裁切用于垂直主排气管的2” PVC管段，并使用2” PVC三通连接件接收来自各层鱼架鱼缸的排水管。将主排气管末端接入储水箱，使循环水通过海绵过滤器排出。
- 沿2” PVC管段全长切出一条1英寸宽的开口，并通过2” PVC三通将其连接至垂直主排气管，用于接入鱼缸的水平排水管。
- 使用2” PVC管帽封堵水平排水管的末端。
- 使用必要的管件（连接件、短接头或弯头）对各部件进行打底并用胶粘剂固定。
6. 构建鱼缸（图3）。
- 使用电钻和孔锯，在鱼缸背面距上边缘1英寸处钻一个1 1/8英寸的孔。
- 将一个带有#18 O型圈的螺纹¾英寸PVC外螺纹接头从鱼缸内部向外穿过该孔。
- 将一个90度3/4英寸螺纹PVC弯头连接并拧紧到外螺纹接头上，形成鱼缸排气管。在拧紧固定螺母前，先放入一段细网，以防止斑马鱼进入排气系统。
- 将鱼缸放置好，使其排气管末端插入鱼缸后方排水管的开口位置。
7. 启动水系统
- 在多个容器中（例如用于储水的容器），量取系统内水量三倍的水。将此水在室温下静置 48 小时以进行平衡。
- 向系统中加水并使其循环至少 3 天。
- 在最初 3 天的循环期间，频繁更换系统中的水，以彻底清除管道内残留的污染物。
- 加入初始斑马鱼，使氮循环逐步建立。将 pH 值调节至稳定的 7。每 1.8 L 水体饲养 7 条斑马鱼，工作日每天投喂两次，周末每天投喂一次，具体参照 Linbo4 和 McNabb6 的建议。
- 在加入鱼类后的第一周内，每日监测硝酸盐（<75 mg/L）、亚硝酸盐（<10 mg/L）和铵（0 mg/L）水平；当各项指标在定期换水后已稳定达到理想范围时，改为每周检测两次。
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结果
泵和过滤系统构建
组装并设置好支架后，第一步是构建泵和过滤系统。过滤器连接至系统泵，并位于第一层架子的底部以上，以便于进行过滤器的维护和更换。同样，紫外线灯通过PVC管连接到过滤器，并用塑料扎带固定，以便在需要时能够方便地更换紫外线灯（图4A）。在泵之后，立即通过PVC管依次安装滤纸、活性炭过滤器和紫外线灯。向水箱中添加生物球，为细菌生长提供表面积，这些细菌可将有毒的氨废物转化为硝酸盐。系统中每加仑水添加一个生物球，即可为细菌生长提供足够的表面积。塑料储水罐的盖子可进行适配安装，以防溢出时生物球保留在储水罐内，从而最大限度地降低污染风险。尽管发生溢出的可能性极低，但可轻松地在系统中增加排水装置（在储水罐顶部加装排水管）。
主供水管路的构建
第二步是组装主供水管路，该管路将为所有容纳斑马鱼养殖箱的隔间供水（图4B）。该管路通过一段PVC管连接至紫外灯。该管路通过一个PVC三通接头垂直并横向延伸至养殖架。三通接头的底端用于连接一段PVC管，作为整个系统的排水阀。
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讨论
本文的主要目的是证明，建造一个功能齐全的斑马鱼养殖设施并不复杂，即使是缺乏施工经验的鱼类研究新手，只要具备最基本的施工知识即可完成。此外，本文还表明，该功能型斑马鱼设施所需的材料可轻松且经济地从当地的宠物用品商店或五金店购得。在集齐所有材料和工具后，系统的搭建及鱼缸的安装大约只需一个工作日即可完成。系统首次运行72小时，可用于检测系统中可能存在的故障，例如漏水或水压不足等问题。此次试运行还可将系统内的污染物从循环中清除。例如，聚氯乙烯（PVC）胶水中可能含有有害有机物，这些物质将在循环运行的最初几小时内被去除。该系统设有主排水阀，便于在维护过程中调节水量和更换水体。此外，系统还配备了一条泄压管路，有助于调节水压。当仅使用一个或两个隔间（层架）时，该管路尤为有用，因为它可实现对水压的调控。
该设施采用模块化设计，可根据研究人员的容量需求，灵活使用1、2或3个区域（共36个1.8 L的鱼缸）。每个区域均设有开关阀，便于系统各部分的独立隔离。该阀门系统还有助于防止潜在的感染扩散，并支持按区域进行系统清洗。此外，每个鱼缸的供水管路均配备两个阀门，一个位于9端口灌流器处，另一个位于鱼缸入口处...
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披露
作者声明本文无利益冲突。
致谢
作者感谢长老会学院药学院研究办公室通过小型药学研究奖为本项目提供的经费支持 & 协作（SPARC）奖。作者感谢南卡罗来纳州克莱姆森大学水生动物研究实验室经理约翰·斯明克先生在技术协助和稿件修改方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 项目 | 品牌 | 数量 | |
| 74 英寸高 × 48 英寸宽 × 18 英寸深 5 层独立式钢制置物架 | Style Selections | 1 | |
| 18 加仑通用桶/搬运箱 | Centrex Plastics: LLC Rugged Tote | 1 | |
| 带 15 英尺线缆的 6 插座电源插座板 | Master Electrician | 1 | |
| 9 瓦紫外线水景澄清过滤器及紫外线灯 | Smartpond | 1 | |
| 全屋用水更换滤芯 | Whirlpool | 6 | |
| 不透明全屋前置过滤外壳 | Whirlpool | 2 | |
| 螺纹密封胶带 | William H Harvey | 1 | |
| 8 液体盎司低挥发性有机化合物 PVC 胶粘剂 | Oatey | 1 | |
| 8 液体盎司低挥发性有机化合物底漆 | Oatey | 1 | |
| 1/4 英寸 × 100 英尺乙烯基滴灌分配管 | Mister Landscaper | 1 | |
| 1/4 英寸带倒刺滴灌开关阀 | Mister Landscaper | 33 | |
| 带过滤器的 9 端口 NPT 滴灌集水管 | Mister Landscaper | 6 | |
| 带外壳的嵌入式过滤器 | Whirlpool | 6 | |
| 2 英寸直径 90 度 PVC 弯头 | LASCO | 3 | |
| 2 英寸直径 90 度三通 | LASCO | 3 | |
| 3/4 英寸直径 90 度滑套弯头 | LASCO | 15 | |
| 3/4 英寸直径 PVC 变径接头 | LASCO | 7 | |
| 3/4 英寸直径 PVC 三通 | LASCO | 12 | |
| 2 英寸直径 PVC 封头 | LASCO | 3 | |
| 1 英寸直径 × 3/4 英寸直径 PVC 变径接头 | LASCO | 2 | |
| 3/4 英寸 PVC 直通式球阀 | American Valve | 5 | |
| 1/2 英寸直径 × 3/4 英寸直径 PVC 变径接头 | Lasco | 8 | |
| 3/4 英寸直径 PVC 封头 | Lasco | 1 | |
| 2 英寸 × 5 英尺 PVC 管 | Charlotte Pipe | 4 | |
| ¾ 英寸 × 10 英尺 PVC 管 | Charlotte Pipe | 3 | |
| 11/16×1-7/80 英寸 PVC 环 | SXT | 10 | |
| ½” PVC 外螺纹接头 | SXT | 1 | |
| ¾” PVC 直通接头 | SXT | 1 | |
| ½” PVC 内螺纹接头 | SXT | 1 | |
| 链接 | |||
| 1.8 升双 β 保持器 | Top Fin | 27 | |
| ¾” PVC 外螺纹接头（带 #18 O 形圈） | SXT | 28 | |
| 90 度 ¾” 螺纹 PVC 弯头 | SXT | 27 | |
| 细网 | N/A | 1 码 | |
| 贯通接头 | N/A | 1 | |
| 钢锯 | N/A | 1 | |
| 电钻 | N/A | 1 | |
| 孔锯 | N/A | 1 | |
| 可调扳手 | N/A | 1 | |
| 钳子 | N/A | 1 | |
| 卷尺 | N/A | 1 | |
| 护目镜 | N/A | 1 | |
| 工作手套 | N/A | 1 |
参考文献
- Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A.. , 3rd ed, Academic Press. New York, New York. (2010).
- Grim, J. M., et al. Hemogen (hemgn), a transcription factor that regulates erythropoiesis and skeletogenesis in zebrafish. Strategic Conference of Zebrafish Investigators Poster Presentation, 2013, Asilimar, CA, , (2013).
- Kim, S., Carlson, R., Zafreen, L., Rajpurohit, S. K., Jagadeeswaran, P. Modular, easy-to-assemble, low-cost facility. Zebrafish. 6 (3), 269-274 (2009).
- Linbo, T. L. Zebrafish (Danio rerio) husbandry and colony maintenance at the Northwest Fisheries Science Center. U.S. Dept. Commer., NOAA Tech. Memo. 62, (2009).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. 69, 4196(2012).
- McNabb, A., Scott, K., Ochsenstein, E., Seufert, K., Carl, M. Don't be afraid to set up your fish facility. Zebrafish. 9 (3), 120-125 (2012).
- Garcia, R. L., Sanders, G. E. Efficacy of cleaning and disinfection procedures in a zebrafish rerio) facility. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (6), 895-900 (2011).
- Rivas-Boyero, A. A., et al. Pharmacological characterization of a nociceptin receptor from zebrafish (Danio rerio). J Mol Endocrinol. 46 (2), 111-123 (2011).
- Sanchez-Simon, F. M., Zhang, X. X., Loh, H. H., Law, P. Y., Rodriguez, R. E. Morphine regulates dopaminergic neuron differentiation via miR-133b. Mol Pharmacol. 78 (5), 935-942 (2010).
- Velasco, E. M., Law, P. Y., Rodríguez, R. E. Mu opioid from the zebrafish exhibits functional characteristics as those of mammalian mu opioid receptor. Zebrafish. 6 (3), 259-268 (2009).
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重印与许可
