本文描述了一种单平面 illumination 显微镜（SPIM）模块，可轻松适配于倒置宽场显微镜，并针对三维细胞培养进行了优化。样品置于矩形毛细管内，通过微流控系统可将荧光染料、药物制剂或药物以微量施加至样品。
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本文内容
摘要
摘要
一种用于光片显微镜或单平面照明显微镜（SPIM）的模块，可轻松适配倒置宽场显微镜，并针对三维细胞培养进行了优化， 例如， 多细胞肿瘤球体（MCTS）。该SPIM激发模块对光线进行整形和偏转，使样品被垂直于显微镜检测光路的光片照射。该系统的特点包括：采用矩形毛细管固定样品（在高级版本中还可通过微毛细管装置实现样品旋转），同步调节照明光片与用于荧光检测的物镜，以及集成微流控系统以微量施加荧光染料、药物或药剂。本文提供了该系统的操作方案，并报告了一些技术细节。代表性结果包括：（1）测定细胞抑制剂阿霉素（doxorubicin）的摄取及其部分转化为降解产物的过程；（2）通过基因编码的谷胱甘肽传感器在添加氧化剂后进行氧化还原状态检测；（3）抑制线粒体呼吸链后引发并标记细胞坏死。文中还讨论了该SPIM模块相较于现有系统的差异与优势。
引言
除了已确立的方法（共聚焦或多光子激光扫描显微镜1-4、结构化照明显微镜5,6）外，光片显微技术或单平面照明显微镜（SPIM）已被证明是一种有价值的三维成像方法7,8,9。其中特别值得关注的是其在三维细胞培养中的应用，例如，多细胞肿瘤球体（MCTS），后者在药物发现研究中正被越来越多地使用10,11。此外，当需要在长期暴露或重复测量过程中保持低光照剂量以维持样本活性时，SPIM 是首选方法，因为在检测样本的每一个焦平面时，仅有该平面被光照照射。这与其他显微技术形成对比：在那些技术中，每次检测一个焦平面时整个样本都会被照亮，因此在记录多个焦平面时，累积的光照剂量可能对样本造成损伤12。
光片显微镜或SPIM基于使用柱面透镜或扫描激发激光束，从与观察路径垂直的方向对样品进行照明（综述见参考文献8）。这通常需要特殊的样品腔室。13,14 或基质， 例如， 琼脂糖7,15，可在特殊且昂贵的显微镜上实现。作为这些系统的替代方案，已开发出一种结构相对简单的SPIM照明装置，并适配于常规倒置显微镜。16 （参见 图1）。它由一束激光扩束至直径为8 毫米，并通过一个柱面透镜（焦距：50）聚焦 毫米，数值孔径：0.08）聚焦为厚度6–....
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方案
1. 细胞球体培养与孵育
- 实验1：用化疗药物孵育细胞球体
- 通过将0.45 g琼脂糖加入30 ml培养基中，制备1.5%的琼脂糖溶液（足以用于6块板）。
- 将步骤1.1.1中的混合物加热至至少80 °C，同时间歇搅拌。
- 将步骤1.1.2中加热后的混合物每孔50 µl加入96孔板的各孔中，使其在1–2小时内凝固。将板子密封后置于冰箱中5 °C保存，直至使用。
- 在已制备的96孔板各孔中接种约150个MCF-7乳腺癌细胞，使用含10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）与Ham’s F-12培养基混合液。
- 在5% CO2、37 °C的培养箱中培养5–7天，使细胞球体生长至直径约200–300 µm。
- 在5% CO2、37 °C的培养箱中，用浓度为2 µM至8 µM（溶于培养基）的蒽环类抗生素盐酸多柔比星处理细胞球体，孵育6小时。
- 显微观察前，用培养基或Earle's平衡盐溶液（EBSS）洗涤细胞球体。
- 实验2：表达氧化还原传感器的球体中的氧化过程
- 在96孔板经琼脂糖凝胶包被的孔中（步骤1.1.1–1.1.3所述方法），接种约400个稳定转染了谷胱甘肽敏感型绿色荧光氧化还原传感器Grx1-roGFP2....
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结果
实验1：细胞球体与化疗药物共孵育
先前孵育的MCF-7细胞球体的z轴层扫图像（8 µM 阿霉素，6 小时）如图所示 图3. 它提供了关于阿霉素细胞摄取和分布的详细信息17 及其降解产物18,19在类球体的外层细胞中，红色荧光的阿霉素主要定位于细胞核内，而在类球体内部区域，细胞膜中则以降解产物发出的绿色荧光为主19.
图3. 使用单平面照明.......
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讨论
本文描述了一种优化用于三维细胞系统的光片显微镜或单平面照明显微镜（SPIM）装置， 例如， 多细胞肿瘤球体（MCTS）。三个典型应用包括：（1）细胞抑制性药物的摄取及其部分转化为降解产物（该降解产物对化疗效果的贡献仍有待评估）；（2）通过基因编码的谷胱甘肽传感器检测添加氧化剂后的氧化还原状态；（3）抑制线粒体呼吸链后诱导并标记细胞坏死。
与现有系统相比，该SPIM模块的主要优势（例如， 与参考文献7、8、9、14、15中报道的方法相比，其优势在于可轻松适配任何倒置宽场显微镜，且样品位于小型测量腔室（微毛细管）中，进行各类实验时仅需少量荧光染料、药物制剂或药品，从而显著降低实验成本。 例如， 用于药物测试。如果采用本文报道的微流控系统，这一原则同样适用。然而需要指出的是，尽管在开环系统中，较低的流速有利于降低药物筛选的成本，但在当前实验条件下，即使流速高达1,440 µl/min（对应流速高达4,000 mm/min），类球体仍能稳定附着于毛细管内壁而不发生脱落。对于紧密的闭环系统，无论泵速如何，至少需要200–300 µl的总液.......
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致谢
本项目由巴登-符腾堡州以及欧洲联盟欧洲区域发展基金资助。作者感谢Rainer Wittig（ILM Ulm）提供U251-MG-L106-Grx1-roGFP2细胞系，并感谢Claudia Hintze提供的娴熟技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微量滴定板 | Orange Scientific | 4430100 | 用于细胞球体培养 |
| 琼脂糖 | Carl Roth GmbH | 3810.1 | 用于细胞球体培养 |
| MCF-7 细胞系 | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | 细胞系 |
| U251-MG-L106 细胞系 | 细胞系 | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | 培养基 |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | 培养基 |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | 细胞培养添加剂 |
| 青霉素/链霉素 | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | 抗生素 |
| 潮霉素B | PAA Laboratories | P02-015 | 抗生素 |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | 细胞培养添加剂 |
| 阿霉素 | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | 荧光染料（注意：急性毒性） |
| 绿色细胞毒性染料 | Promega GmbH | G8742 | CellTox — 荧光细胞毒性染料 |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | 细胞抑制剂（注意：急性毒性） |
| 过氧化氢（H2O2） | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | 氧化反应试剂（注意：急性毒性） |
| 毛细管 | VitroCom | 8260-050 | 样品制备 |
| 显微镜 | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD相机 | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD相机 |
| AxioVision 数据采集软件 | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| 激光二极管 | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | 需与驱动器 PDL800-B 配合使用 |
| 蠕动泵 | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | 已重新校准，将最低泵速降低至原来的1/10 |
| 硅胶管 | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
参考文献
- Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W.
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重印与许可
