宽场显微镜的单平面照明模块与微毛细管方法

摘要

本文描述了一种单平面 illumination 显微镜（SPIM）模块，可轻松适配于倒置宽场显微镜，并针对三维细胞培养进行了优化。样品置于矩形毛细管内，通过微流控系统可将荧光染料、药物制剂或药物以微量施加至样品。

摘要

一种用于光片显微镜或单平面照明显微镜（SPIM）的模块，可轻松适配倒置宽场显微镜，并针对三维细胞培养进行了优化， 例如， 多细胞肿瘤球体（MCTS）。该SPIM激发模块对光线进行整形和偏转，使样品被垂直于显微镜检测光路的光片照射。该系统的特点包括：采用矩形毛细管固定样品（在高级版本中还可通过微毛细管装置实现样品旋转），同步调节照明光片与用于荧光检测的物镜，以及集成微流控系统以微量施加荧光染料、药物或药剂。本文提供了该系统的操作方案，并报告了一些技术细节。代表性结果包括：（1）测定细胞抑制剂阿霉素（doxorubicin）的摄取及其部分转化为降解产物的过程；（2）通过基因编码的谷胱甘肽传感器在添加氧化剂后进行氧化还原状态检测；（3）抑制线粒体呼吸链后引发并标记细胞坏死。文中还讨论了该SPIM模块相较于现有系统的差异与优势。

引言

除了已确立的方法（共聚焦或多光子激光扫描显微镜^1-4、结构化照明显微镜^5,6）外，光片显微技术或单平面照明显微镜（SPIM）已被证明是一种有价值的三维成像方法^7,8,9。其中特别值得关注的是其在三维细胞培养中的应用，例如，多细胞肿瘤球体（MCTS），后者在药物发现研究中正被越来越多地使用^10,11。此外，当需要在长期暴露或重复测量过程中保持低光照剂量以维持样本活性时，SPIM 是首选方法，因为在检测样本的每一个焦平面时，仅有该平面被光照照射。这与其他显微技术形成对比：在那些技术中，每次检测一个焦平面时整个样本都会被照亮，因此在记录多个焦平面时，累积的光照剂量可能对样本造成损伤¹²。

光片显微镜或SPIM基于使用柱面透镜或扫描激发激光束，从与观察路径垂直的方向对样品进行照明（综述见参考文献8）。这通常需要特殊的样品腔室。^13,14 或基质， 例如， 琼脂糖^7,15，可在特殊且昂贵的显微镜上实现。作为这些系统的替代方案，已开发出一种结构相对简单的SPIM照明装置，并适配于常规倒置显微镜。¹⁶ （参见 图1）。它由一束激光扩束至直径为8 毫米，并通过一个柱面透镜（焦距：50）聚焦 毫米，数值孔径：0.08）聚焦为厚度6–10 µm的光片，景深约为100 µm。样品置于显微物镜前方内径为600–900 µm的矩形毛细管中，用于荧光检测。目前，这些主要特征已通过采用先进的微毛细管技术进一步完善和优化，包括样品的固定与旋转、照明光片（轴向）与用于荧光检测的物镜的同步调节（由于位移的光路长度相同，需对机械进给进行校正），以及集成微流控系统以施加荧光染料、药物制剂或药品，从而显著减少所需试剂用量和成本。

方案

1. 细胞球体的培养与孵育

1. 实验1：与化疗药物共同孵育的细胞球体
   1. 在30 ml培养基中加入0.45 g琼脂糖，配制1.5%的琼脂糖培养基（适用于6个培养板）。
   2. 将步骤1.1.1中的混合物加热至至少80 °C，同时间歇搅拌。
   3. 将步骤1.1.2中加热后的混合物各50 µl加入96孔板的每个孔中，静置1–2小时使其凝固。将板子密封后置于冰箱中5 °C保存，直至使用。
   4. 在已准备好的96孔板中，每孔接种约150个MCF-7乳腺癌细胞，培养基为添加10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基与Ham’s F-12培养基混合液）。
   5. 在5% CO₂培养箱中培养类球体5–7天，直至直径达到约200–300 µm₂ 和 37 °C。
   6. 将细胞球体与浓度为 2 µM 至 8 µM（溶于培养基中）的蒽环类抗生素盐酸多柔比星在 5% CO₂ 培养箱中于 37 °C 共同孵育 6 小时₂ 37 °C
   7. 在显微镜观察前，用培养基或Earle's平衡盐溶液（EBSS）洗涤细胞球体。
2. 实验2：表达氧化还原传感器的类球体中的氧化过程
   1. 在96孔板经琼脂糖凝胶包被的孔中（包被步骤见1.1.1–1.1.3），接种约400个U251-MG-L106胶质母细胞瘤细胞，该细胞系已稳定转染谷胱甘肽敏感的绿色荧光氧化还原探针Grx1-roGFP2，培养基为添加10% FCS、1%青霉素/链霉素及潮霉素B（150 µg/ml）的DMEM培养液。
   2. 在5% CO₂培养箱中培养类球体5–7天，直至直径达到约200–300 µm₂ 和 37 °C。
   3. 将10 µl过氧化氢溶液（purum p.a.，≥ 30%）加入990 µl双蒸水中，配制100 mM储备液，于12小时内使用。
   4. 将步骤1.2.3中的储备液在实验前用EBSS稀释至50 µM。
   5. 通过微流控系统孵育细胞球体，在EBSS中加入50 µM过氧化氢以氧化氧化还原传感器，同时进行检测。
3. 实验3：类球体中细胞坏死的启动与标记
   1. 接种约400个细胞（例如， 将U251-MG-L106-Grx1-roGFP2胶质母细胞瘤细胞接种于96孔板中经琼脂糖凝胶包被的孔内（包被步骤见1.1.1–1.1.3），培养基为添加10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和潮霉素B（150 mg/ml）的DMEM培养液。
   2. 在5% CO₂培养箱中培养类球体5–7天，直至直径达到约200–300 µm₂ 和 37 °C。
   3. 将细胞球体与线粒体电子传递抑制剂鱼藤酮在培养基中共同孵育3小时，鱼藤酮浓度为1 µM，以诱导细胞坏死。同时，在每1 ml培养基中加入1 µl绿色细胞毒性染料共同孵育3小时，用于标记坏死细胞。
   4. 用培养基或EBSS在显微镜观察前洗涤细胞球状体。

2. 光片调整

注意：为了获得最佳效果，必须确保光片的束腰位于物镜的焦平面内。束腰位置的校准只能通过观察相对于毛细管垂直方向的光片来完成（见步骤 2.5 - 2.8）。

1. 使用倒置显微镜，并将SPIM激发模块（如参考文献16所述）安装到定位台的基板上（见图1A）。
2. 在显微镜上配备10X/0.3或20X/0.5的物镜以及检测光路中适当的长通滤光片（例如，λ ≥ 515 nm）。
3. 将积分相机连接至显微镜的检测端口。
4. 使用波长优先为470 nm的激光器或激光二极管产生的平行准直光束，并将其引入SPIM模块。
5. 将柱面透镜旋转90度，使光片转为垂直方向，以便对光片的束腰进行轴向调节。
6. 在样品 holder 中放置一根含有荧光染料溶液的毛细管。
7. 将带有毛细管的样品 holder 安装到显微镜的定位台上，并调整毛细管位置，使其居中，且光片的束腰处于焦点位置。
8. 通过调节柱面透镜自身的轴向位置来调整束腰。调节完成后将透镜转回原位。

3. 细胞球体应用与显微镜图像采集同步

1. 将细胞球体单独或成组地置于矩形硼硅酸盐玻璃毛细管¹⁶中，毛细管内截面为 600 µm × 600 µm，壁厚为 120 µm。以下两种细胞球体加载方法已被证实有效：
   1. 用拇指和中指夹住空毛细管使其竖直，并用食指封住上端开口。将下端开口靠近其所处液体（EBSS 或培养基）中的细胞球体，然后松开食指。在毛细作用力下，含有细胞球体的液体会立即被吸入毛细管内。通过将毛细管保持竖直，利用重力调节细胞球体在毛细管内的位置。
   2. 或者，通过移液方式将细胞球体加入毛细管。注意移液枪头的开口一方面应足够大以容纳球体，另一方面其尺寸应小于或等于毛细管的内径。
2. 将含有细胞球体的毛细管放入显微镜专用样品 holder 中。
3. 将装有毛细管的样品 holder 固定在显微镜的载物台上，并调整细胞球体的位置，使其居中并聚焦。
4. 通过调节反射镜和柱面透镜的位置（见图 1B中的调节螺丝），使照明路径中的光片与检测路径中物镜的焦平面精确匹配。
5. 根据样品和物镜周围介质的折射率以及物镜的数值孔径，调节微米调节螺丝（见图 1B），以补偿“鱼缸效应”。
   注意：样品与物镜周围介质的折射率不同，会导致物镜移动距离与焦平面移动距离之间存在差异。由于光片随物镜转盘移动，因此通过杠杆臂（见图 1B）补偿光片移动（对应于物镜移动）与焦平面移动之间的不匹配。微米调节螺丝用于调节上下销钉之间的距离，从而根据物镜的数值孔径和折射率调整光片的位移。

图1. (A) 单平面照明显微模块安装在倒置显微镜定位台基板上的实物图；(B) 单平面照明显微模块的装置示意图，以及显微镜与照明同步馈送设置，用于补偿焦平面与照明平面之间的升降不匹配（鱼缸效应）。Δz_o 表示物镜的位移，Δz_f 表示焦平面和光片的位移。插图为含有毛细管的类球体的横截面图。左侧：内径为600 µm（壁厚120 µm）的矩形毛细管；右侧：用于旋转的装置。在一个外层矩形毛细管内，旋转一个内层圆形毛细管（内径400 µm，外径550 µm）。两个毛细管之间的空隙填充有浸没液。

4. 动态液体环境中的测量

注意：之前的方案用于在测量前进行静态孵育，其中细胞球体已预先孵育，并通过简单的重力作用固定在毛细管内。无需进一步固定。然而，对于需要在流动介质中进行测量的情况，若希望实现动态孵育，从而构建动态环境以测定摄取动力学，则可采用本子方案。步骤 4.5–4.9 至关重要，用以避免气泡进入样品。

1. 用胎牛血清（FCS）填充毛细管，持续 30 分钟，以促进后续细胞球体与毛细管内壁玻璃表面的细胞黏附。
2. 让耗尽的毛细管中残留的 FCS 涂层至少干燥 12 小时。
3. 按照步骤 3.2 所述方法，将细胞球体引入已涂覆 FCS 的毛细管中。
4. 将毛细管置于 5% CO₂ 和 37 °C 的培养箱中额外孵育 2–4 小时，以促进球体的细胞黏附。
5. 设置微流控系统的进流部分（见图 2）。使用蠕动泵将含有荧光染料、药物或试剂的培养基注入进流管路（内径：0.89 mm）中。
6. 将微流控系统的进流部分连接至气泡捕获装置（见图 2）。
7. 首先将毛细管无气泡地夹紧至进流管路，然后将毛细管的另一端夹紧至排水管路。
8. 调节水浴的液体温度至所需值（例如，37 °C）。
9. 调节蠕动泵至所需的泵速（例如，流速：9 µl/min；毛细管内泵速：25 mm/min）。
10. 将泵出的液体收集至接收容器中（开环装置），或回输至原始容器中（闭环装置），或直接回输至蠕动泵的管路中（紧密闭环装置）。

图 2. 微流控装置（开环和紧密闭环）；插图：利用与倒置显微镜耦合的光片荧光显微镜对微毛细管内的类球体进行照明。

5. 数据采集与分析

1. 设置激光功率和图像采集的积分时间。
2. 注意，步骤 5.1 中设定的参数不应超过对原代细胞约 50–100 J/cm² 或对孵育了荧光染料或转染了荧光蛋白编码质粒的细胞约 10–20 J/cm² 的光剂量，以避免光毒性（详见参考文献 12）。
3. 将 z 轴层厚设为 ∆z = 5–10 µm，该设置适用于三维数据分析，因为光片厚度约为 10 µm。
4. 通过在细胞球体内部调节焦平面，进行单幅图像或 z 轴层叠图像的采集。

结果

实验1：与化疗药物共同孵育的细胞球体

一个先前经8 µM阿霉素孵育6小时的MCF-7细胞球体的z轴层扫图像如图所示 图3. 它提供了关于阿霉素细胞摄取和分布的详细信息¹⁷ 及其降解产物^18,19在球状体的外层细胞中，红色荧光的阿霉素主要定位于细胞核内，而在球状体内部区域，细胞膜中则以降解产物发出的绿色荧光为主¹⁹.

图3. ...

讨论

本文描述了一种优化用于三维细胞系统的光片显微镜或单平面照明显微镜（SPIM）装置， 例如， 多细胞肿瘤球体（MCTS）。三个典型应用包括：（1）细胞抑制性药物的摄取及其部分转化为降解产物（该降解产物对化疗效果的贡献仍有待评估）；（2）通过基因编码的谷胱甘肽传感器检测添加氧化剂后的氧化还原状态；（3）抑制线粒体呼吸链后诱导并标记细胞坏死。

与现有系统相比，该SPIM模块的主要优势（例如， 与参考文献7、8、9、14、15中报道的方法相比，其优势在于可轻松适配任何倒置宽场显微镜，且样品位于小型测量腔室（微毛细管）中，进行各类实验时仅需少量荧光染料、药物制剂或药品，从而显著降低实验成本。 例如， 用于药物测试。如果采用本文报道的微流控系统，这一原则同样适用。然而需要指出的是，尽管在开环系统中，较低的流速有利于降低药物筛选的成本，但在当前实验条件下，即使流速高达1,440 µl/min（对应流速高达4,000 mm/min），类球体仍能稳定附着于毛细管内壁而不发生脱落。对于紧密的闭环系统，无论泵速如何，至少需要200–300 µl的总液...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微量滴定板	Orange Scientific	4430100	用于细胞球体培养
琼脂糖	Carl Roth GmbH	3810.1	用于细胞球体培养
MCF-7 细胞系	CLS Cell Lines Service GmbH	300273	细胞系
U251-MG-L106 细胞系			细胞系
DMEM	Biochrom AG (Merck Millipore)	FG0435	培养基
DMEM/Ham's F-12	Biochrom AG (Merck Millipore)	FG4815	培养基
FCS	Biochrom AG (Merck Millipore)	S0615	细胞培养添加剂
青霉素/链霉素	Biochrom AG (Merck Millipore)	A 2213	抗生素
潮霉素B	PAA Laboratories	P02-015	抗生素
EBSS	Sigma-Aldrich Inc.	E3024	细胞培养添加剂
阿霉素	Sigma-Aldrich Inc.	D1515	荧光染料（注意：急性毒性）
绿色细胞毒性染料	Promega GmbH	G8742	CellTox — 荧光细胞毒性染料
鱼藤酮	Sigma-Aldrich Inc.	R8875	细胞抑制剂（注意：急性毒性）
过氧化氢（H2O2）	Sigma-Aldrich Inc.	95302	氧化反应试剂（注意：急性毒性）
毛细管	VitroCom	8260-050	样品制备
显微镜	Carl Zeiss Jena	Axiovert 200M
AxioCam MRc CCD相机	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	426508-9901-000	CCD相机
AxioVision 数据采集软件	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	version 4.8.2.
激光二极管	Pico Quant GmbH	LDH-P-C-470	需与驱动器 PDL800-B 配合使用
蠕动泵	Ismatec Labortechnik	MS-1 Reglo	已重新校准，将最低泵速降低至原来的1/10
硅胶管	IDEX Health & Science GmbH	TYGON R3607