方法文章

HIV-1的三聚体包膜糖蛋白的构象评估使用基于细胞的ELISA检测

DOI：

10.3791/51995

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2014年9月14日

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1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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了解病毒表面抗原构象是评估抗体中和并指导有效疫苗免疫原设计所必需的。在这里，我们描述了一种基于细胞的 ELISA 检测，该检测允许研究特异性抗 Env 抗体对在转染细胞表面表达的三聚体 HIV-1 Env 的识别。

摘要

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HIV-1 包膜糖蛋白 （Env） 介导病毒进入靶细胞，对感染周期至关重要。了解这些糖蛋白如何通过其构象变化为融合过程提供动力，可能有助于为疫苗策略设计更好、更有效的免疫原。在这里，我们描述了一种基于细胞的 ELISA 检测，该检测允许研究单克隆抗体对三聚体 HIV-1 Env 的识别。在转染细胞表面表达 HIV-1 三聚体 Env 后，构象特异性抗 Env 抗体与细胞一起孵育。然后使用辣根过氧化物酶偶联的二抗和简单的化学发光反应来检测结合的抗体。该系统具有高度的灵活性，可以检测可溶性 CD4 或细胞蛋白诱导的 Env 构象变化。它需要最少的材料，并且不需要高度专业化的设备或专有技术。因此，该技术可用于抗原和抗体（例如新分离的抗体）的中高通量筛选。

引言

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人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的条目，以三聚体的病毒包膜糖蛋白（环境）介导的感染周期的第一步骤。是唯一外露的病毒抗原，在病毒粒子的表面呈现，将信封三聚体引发中和非中的抗体。因此，它表示用于疫苗的免疫原设计了一个有趣的候选者。然而，信封疫苗试验中的可溶性或重组的形式引起的反应，只有对最初级的HIV-1分离株1-3最小的有效性。尽管如此，部分疗效的HIV-1包膜的RV144疫苗试验4新的兴趣作为免疫原的候选观察。这是证实了最近的一项研究说明了疫苗引起的抗包膜抗体均足以产生一定程度的保护，防止SIV和HIV挑战5。

后所要合成的内质网中，包膜糖蛋白在前驱物的gp160，经历，这对于其对燃料的病毒融合过程能力的关键不同的翻译后修饰。被裂解成其特细胞质gp120和gp41的跨膜亚基6-10，与非共价相互作用维持的gp120-gp41的联系之前，信封前体必须正确和准倍三聚体。受感染的细胞机器还负责大量糖基化的包膜，其包含约50％的总质量为11,12。所得到的复合结构允许信封是构象柔性13,14，同时提供了被认为是允许信封，以适应和隐藏某些高度免疫原性表位，否则将暴露15-19亚稳态，突出的重要性，以更好地理解不同的构象由天然包膜三聚体取样。

迄今为止，一些技术已经开发并成功地用于研究包膜构象沟道安格斯。然而，他们在他们的局限性会发生变化，而通常被限制在特定的包膜上下文。例如，表面等离子体共振，或使用构象特异性单克隆抗体的免疫沉淀实验（单抗），依赖于任一的单体的水溶性或可溶的信封分子是已知的，从它们的三聚体形式的20,21 immunogenetically不同。最近的研究还表明，裂解影响导致主要抗原决定簇所认可非中抗体14,22,23曝光信封构象。

在这里，我们详细描述了一种方法，它允许快速和容易的决心cellularly表达信封三聚体18,24-26的构象。下列信封的人贴壁细胞系的瞬时转染包膜特异性抗体的结合使用了一个简单的化学发光反应进行检测。这种技术也可以用来表征的构象偏好构象依赖新生凹痕抗体。因此，这个实验提供了一个强大且高度灵活的检测方法。

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方案

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1日1 - 细胞培养

  1. 板为2×10 4人骨肉瘤（HOS）在一个不透明的，96孔细胞培养适于发光读板，每孔的细胞。使用的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），补充有10％胎牛血清（FBS）和100 U / ml的青霉素 - 链霉素。孵育直到第二天，在37℃，5％CO 2。

2，第2天 - 聚乙烯亚胺（PEI）转

  1. 根据后续步骤准备转染混合物。根据井是用相同的信封被转染的数量调节的试剂和DNA的量。
  2. 管答：加入10纳克达编码质粒（如PTAT-Ⅲ27）和150纳克ENV-质粒编码为5微升补充有25毫米肝素钠。
  3. 康达编码的质粒是用达依赖性包膜编码质粒如pSVIII时才是必需的。
  4. B管：加入450纳克PEI（从1微克/微升的溶液），以5微升DMEM中。
  5. 加入B管的内容到管A.充分混合，通过涡旋10秒，孵育转染混合物在室温（22℃）10分钟。
  6. 加10微升每96孔板的转染混合物中。孵育48小时，在37℃，5％CO 2。

3，第4天 - 酶联免疫吸附

  1. 执行所有的实验在室温下，以尽量减少包膜/抗体复合物可能的内吞作用。
  2. 制备250毫升每板清洗缓冲液被用于在同一时间。洗涤缓冲液为1x Tris缓冲盐水（TBS）pH为7.5（50毫摩尔Tris-CL，pH值7.5; 150mM的NaCl）中，补充有1毫米MgCl 2和1.8mM的氯化钙 。
  3. 通过加入1％脱脂奶粉和5mM的Tris pH值8.0至洗涤缓冲液制备125毫升每板封闭缓冲液。
  4. 从96孔板中除去细胞培养基和转染混合物（上清液）。
  5. 加入100μ，L封闭液，每孔孵育20分钟在室温中。
  6. 除去上清液，加入50微升每孔抗体（或血清）中，稀释至适当浓度的封闭液。通常情况下，使用1微克/毫升的浓度。孵育1小时，在室温下。
  7. 洗3次用100微升封闭液，然后重复洗涤过程3次用100微升洗涤缓冲液。
  8. 取出上清液，加入100μl封闭液，孵育5分钟在室温。
  9. 除去上清液，加入50微升二抗，在封闭缓冲液稀释1/3000。根据制造商的不同而变化的最佳抗体稀释。孵育40分钟，在室温。
  10. 洗3次用100微升封闭液，然后重复洗涤过程3次用100微升洗涤缓冲液。

4，数据采集

  1. 从板除去上清液，每孔加入30μl的1个增强的化学发光（ECL）的衬底。
  2. 获得化学1秒iluminescence信号/孔上，根据制造商的说明合适的平板阅读器。读取时间可根据硬件上的差异不同。

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结果

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使用上述的一般方法中，我们适应的协议，以测定在野生型（WT）或突变env可溶性CD4（SCD4）和共表达细胞的CD4上CD4i表位的暴露的影响，如前所述18,24， 25,28：图1示意性地表示的一般方法和CD4i表位的下列与SCD4或通过蜂窝CD4 18的共表达治疗的曝光。在图2中，我们使用SCD4诱导的暴露CD4i单抗17B和48D的表位重叠的共受体的结合位点24,29信封的构象变化，而 ​​所述外结构域识别的mAb 2G12不会受到这种治疗预期18,24。

在信封的构象点突变的影响，也可以用此试验评估，如在图3中给出，在这里我们使用，也可以将第1层包膜突变H66A，已知具有降低ð倾向自发采样的CD4结合的构象18,24,30,31或突变（S375W），该预先处理信封的CD4结合状态32，并获得一致的结果（ 图...

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讨论

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该测定被优化以检测特异性单克隆抗体的相互作用与HIV-1三聚体包膜表达在细胞表面。一旦该协议已经建立，它可用于在中到高吞吐量和低的总材料成本和抗体的小的量。由于该测定是染为基础，它可以很容易地以研究它们对包膜构象效应适于胞内蛋白如CD4的共表达。

然而，该协议的转基也意味着，这是其最重要的缺陷之一。首先，抗原被研究这种技术是必需的，以提供在一个独立的表达载体中。因此，从各种临床来源的或原病毒构建体env基因需要被亚克隆到哺乳动物表达载体中。而全长前病毒构建体也可在此技术中使用（参见维耶特等人 18），这也意味着作为香港专业教育学院的病毒颗粒的生产，因此需要在适当的生物防护设施的工作。

此外，该技术的成功是密切与转染效率联系在一起的。得到的低信号往往是由于转染抗原的表达差。典型的问题来源是质粒DNA的质量，转染试剂。和细胞活力。如果需要的话，也可以使用其它技术，如流式细胞术或免疫印迹中进行的转染条件的优化。值得注意的是，它也是重要的是要注意，一些包膜构建体的表达可能是不理想的，因此，可能会...

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披露

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作者宣称没有利益冲突。

致谢

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我们感谢詹姆斯·罗宾逊博士的慷慨的A32，17B，48D的礼物，和C11单克隆抗体。 PGT 121通过美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目，艾滋病，NIAID，美国国立卫生研究院（目录号12343）中科获得。这项工作是由加拿大创新基金会项目负责人＃29866的支持，由CIHR的操作＃257792，由FRQS设立的青年科学家给予＃24639到自动对焦，并通过CRCHUM连续补助金以及由CIHR资助的催化剂＃126630房颤和MR。房颤是一种FRSQ Chercheur布西尔少年团契1＃24639的收件人。 MV由CIHR博士后研究奖＃291485支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HOS 细胞ATCCCRL-1543
白色不透明组织培养板，96 孔，平底BD353296
聚乙烯亚胺，线性，25,000 MWPolysciences23966在 1 mg/ml 溶液中制备
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）Invitrogen11995
山羊抗人 IgG，过氧化物酶偶联Pierce31413
增强型化学发光底物PerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941，读板机Berthold Technologies

参考文献

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HIV 1 CD4

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