利用基于细胞的ELISA检测法对HIV-1三聚体包膜糖蛋白进行构象评估

摘要

了解病毒表面抗原的构象对于评估抗体中和作用以及指导有效疫苗免疫原的设计至关重要。本文介绍一种基于细胞的ELISA检测方法，可用于研究特异性抗Env抗体对转染细胞表面表达的三聚体HIV-1 Env的识别情况。

摘要

HIV-1 包膜糖蛋白（Env）介导病毒进入靶细胞，是感染周期中必不可少的成分。深入了解这些糖蛋白如何通过构象变化驱动融合过程，有助于设计出更优、更有效的疫苗免疫原。本文描述了一种基于细胞的 ELISA 检测方法，可用于研究单克隆抗体对三聚体 HIV-1 Env 的识别。首先在转染细胞表面表达 HIV-1 三聚体 Env，随后将针对 Env 的构象特异性抗体与细胞孵育。利用辣根过氧化物酶标记的二抗及简单的化学发光反应，检测结合的抗体。该系统具有高度灵活性，可检测由可溶性 CD4 或细胞蛋白诱导的 Env 构象变化。该方法所需材料极少，且无需高度专业化的设备或技术。因此，该技术适用于抗原和抗体的中高通量筛选，例如新分离的抗体。

引言

由三聚体病毒包膜糖蛋白（Env）介导的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）进入细胞是感染周期的第一步。由于Env三聚体是病毒颗粒表面唯一暴露的病毒抗原，因此可诱导产生中和性与非中和性抗体。正因如此，它成为疫苗免疫原设计的一个重要候选分子。然而，使用可溶性或重组形式Env进行的疫苗试验所诱导的免疫反应，对大多数HIV-1原代分离株仅表现出极低的有效性^1-3。尽管如此，RV144疫苗试验中观察到的部分保护效果⁴，重新激发了人们对HIV-1 Env作为免疫原候选分子的兴趣。这一观点也得到了最近一项研究的支持，该研究指出疫苗诱导的抗Env抗体足以在一定程度上抵御SIV和HIV的攻击⁵。

Env糖蛋白前体gp160在内质网中合成后，会经历多种翻译后修饰，这些修饰对其驱动病毒融合过程的能力至关重要。Env前体必须正确折叠并形成三聚体，随后被切割为胞外的gp120和跨膜的gp41亚基^6-10，其中gp120与gp41之间通过非共价相互作用保持连接。感染细胞的合成机制还会对Env进行高度糖基化修饰，糖链约占其总质量的50%^11,12。这种复杂的结构使Env具有构象灵活性^13,14，同时具备一种亚稳态特性，被认为可使Env适应环境并隐藏某些原本暴露的高免疫原性表位^15-19，凸显了深入理解天然Env三聚体所呈现的各种构象的重要性。

迄今为止，已有多种技术被开发并成功用于研究Env构象变化。然而，这些技术各有局限性，通常仅适用于特定的Env环境。例如，基于构象特异性单克隆抗体（mAbs）的表面等离子共振或免疫沉淀实验，依赖于单体可溶性或经溶解处理的Env分子，而这些分子在免疫原性上已知与其三聚体形式存在差异^20,21。最近的研究还表明，切割过程会影响Env的构象，导致主要被非中和抗体识别的表位暴露^14,22,23。

本文详细描述了一种可快速、简便地测定细胞表达的Env三聚体构象的方法^18,24-26。在将Env瞬时转染至人源贴壁细胞系后，利用简单的化学发光反应检测Env特异性抗体的结合情况。该技术还可用于表征构象依赖性抗体的构象偏好性。因此，该检测方法具有高度的稳健性和灵活性。

方案

1. 第1天——细胞培养

1. 接种 2 x 10⁴ 人成骨肉瘤（HOS）细胞，每孔接种于适合发光检测的不透光96孔细胞培养板中。 使用添加了10%胎牛血清（FBS）和100 U/ml青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），在37 °C、5% CO₂条件下培养至次日₂.

2. 第2天——聚乙烯亚胺（PEI）转染

1. 根据后续步骤配制转染混合物。根据需转染相同Env的孔数调整试剂和DNA的用量。
2. 管A：将10 ng编码Tat的质粒（如pTat-III²⁷）和150 ng编码Env的质粒加入5 µl含25 mM HEPES的DMEM中。
3. 仅在使用依赖Tat的Env编码质粒（如pSVIII）时才需要添加编码Tat的质粒。
4. 管B：将450 ng PEI（来自1 µg/µl溶液）加入5 µl DMEM中。
5. 将管B的内容物加入管A中。涡旋振荡10秒以充分混匀，并在室温（22 °C）下孵育转染混合物10分钟。
6. 每孔96孔板加入10 µl转染混合物。在37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时。

3. 第4天——ELISA

1. 所有实验均在室温下进行，以尽量减少Env/抗体复合物的内吞作用。
2. 根据同时使用的培养板数量，每板准备250 ml洗涤缓冲液。洗涤缓冲液为1x Tris缓冲盐水（TBS） pH 7.5（50 mM Tris-Cl，pH 7.5；150 mM NaCl），并添加1 mM MgCl₂和1.8 mM CaCl₂。
3. 通过向洗涤缓冲液中加入1%脱脂奶粉和5 mM Tris（pH 8.0），每板制备125 ml封闭缓冲液。
4. 从96孔板中移除细胞培养基和转染混合物（上清液）。
5. 每孔加入100 µl封闭缓冲液，在室温下孵育20分钟。
6. 移除上清液，每孔加入50 µl抗体（或血清），用封闭缓冲液稀释至适当浓度。通常使用1 µg/ml的浓度。在室温下孵育1小时。
7. 用100 µl封闭缓冲液洗板3次 ，然后用100 µl洗涤缓冲液重复洗涤3次。
8. 移除上清液，每孔加入100 µl封闭缓冲液，在室温下孵育5分钟。
9. 移除上清液，每孔加入50 µl二抗，用封闭缓冲液按1/3,000比例稀释。根据不同生产商的差异调整最佳抗体稀释比例。在室温下孵育40分钟。
10. 用100 µl封闭缓冲液洗板3次，然后用100 µl洗涤缓冲液重复洗涤3次。

4. 数据采集

1. 从孔板中移除上清液，每孔加入 30 µl 1x 增强型化学发光（ECL）底物。
2. 根据制造商说明书，在合适的酶标仪上对每孔进行 1 秒的化学发光信号检测。读取时间可能因硬件差异而有所不同。

结果

根据上述通用实验流程，我们对该方案进行了调整，用于检测可溶性CD4（sCD4）以及共表达的细胞CD4对野生型（wt）或突变型Env上CD4诱导型（CD4i）表位暴露的影响，具体方法如先前所述^18,24,25,28。图1示意图展示了该通用实验流程，以及经sCD4处理或细胞CD4共表达后CD4i表位的暴露情况¹⁸。在图2中，我们使用sCD4诱导Env构象变化，从而暴露CD4i单克隆抗体17b和48d的表位，这些表位与共受体结合位点重叠^24,29；而识别外结构域的单克隆抗体2G12则如预期所示，不受该处理的影响^18,24。

点突变对Env构象的影响也可通过本实验进行评估，如图3所示。在此，我们使用了两种Env突变体：一种是第1层Env突变体H66A，已知其自发采样CD4结合构象的能力降低^18,24,30,31；另一种是S375W突变体，该突变体使Env更倾向于处于CD4结合状态<...

讨论

该检测方法经过优化，可检测特异性单克隆抗体（mAbs）与细胞表面表达的 HIV-1 三聚体 Env 蛋白之间的相互作用。一旦建立实验方案，即可以中高通量进行操作，总体试剂成本低，且所需抗体用量极少。由于该检测基于转染技术，因此可轻松调整用于共表达细胞蛋白（如 CD4），以研究这些蛋白对 Env 构象的影响。

然而，本实验方案的转染基础也意味着这是其最重要的缺陷之一。首先，使用该技术研究的抗原必须已有独立的表达载体。因此，来自不同临床来源的Env基因或前病毒构建体需要亚克隆至哺乳动物表达载体中。尽管全长前病毒构建体也可用于该技术（参见Veillette et al.¹⁸），但这会产生活性病毒颗粒，因而需要在适当的生物安全 containment 设施中操作。

此外，该技术的成功与转染效率密切相关。获得的信号较弱通常是由于转染抗原表达不佳所致。常见的问题来源包括质粒DNA质量、转染试剂以及细胞活力。如有需要，也可通过其他技术（如流式细胞术或蛋白质印迹）对转染条件进行优化。需要注意的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HOS 细胞	ATCC	CRL-1543
白色不透明组织培养板，96 孔，平底	BD	353296
聚乙烯亚胺，线性，25,000 MW	Polysciences	23966	配制成 1 mg/ml 溶液
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Invitrogen	11995
辣根过氧化物酶标记山羊抗人 IgG	Pierce	31413
增强型化学发光底物	PerkinElmer	NEL105001EA
TriStar LB 941 酶标仪	Berthold Technologies