当受到可溶性因子或特定生物材料刺激时，间充质干细胞（MSCs）具有向成骨细胞系分化的潜能。本研究提出了一种新型的人羊膜来源间充质干细胞（AM-hMSCs）递送方案，该方案采用牛骨基质Nukbone（NKB）作为支架材料。
本文内容
摘要
摘要
间充质干细胞（MSCs）在可溶性因子或特定生物材料的刺激下，具有向成骨细胞谱系分化的潜能。本研究提出一种新型的人羊膜来源间充质干细胞（AM-hMSCs）递送方案，采用牛骨基质Nukbone（NKB）作为细胞支架。因此，间充质干细胞在组织修复与再生过程中的应用，主要依赖于将这些细胞有效植入宿主组织的技术。正因如此，近年来生物材料与细胞支架的设计日益受到重视，因为所选支架的拓扑学特性必须能够在损伤组织的微环境中促进细胞的黏附、增殖，并诱导其向目标细胞谱系分化。该人羊膜间充质干细胞（AM-hMSCs）递送方案以牛骨基质作为细胞支架，是一种高效的培养技术，因为细胞能够响应牛骨基质Nukbone（NKB）的拓扑结构特征， 即， 在细胞分离过程后，细胞在材料表面铺展、形成大孔覆盖结构，并定植于生物材料的深层。本文介绍了在牛源基质上分离和培养间充质干细胞（MSCs）的操作流程。
引言
组织修复与再生是医学科学的主要目标之一，因为组织或器官的损伤可能导致功能丧失，甚至在某些情况下危及生命。在此背景下，医疗卫生工作者和研究人员正不断探索各种技术、方法和工具，以提供新的治疗替代方案，促进受损组织的修复与再生过程。因此，生物医学科学聚焦于间充质干细胞（MSCs）的研究，尤其是成体干细胞，因为这类细胞谱系是研究组织再生过程的理想模型，具有向外胚层、中胚层和内胚层细胞谱系分化的潜能。然而，要使基于MSCs的治疗成为现实，必须在表征MSCs治疗潜力的同时，结合采用基于生物材料和细胞支架的新细胞培养技术，以确保MSCs在宿主组织中表现出预期的行为。
在骨再生中应用间充质干细胞（MSCs）培养的主要挑战在于确保细胞在所选生物材料上的黏附。这类材料通常具有多孔结构，孔径分布范围从微米至毫米级。尽管已有多种方法被采用，但这些方法往往需要复杂的试剂、设备和操作流程，可能改变细胞行为。这些操作适用于 体外 估计，但不适用于复杂开放系统（如人类或 体内 检测方法。已有研究通过将多孔骨材料等随机拓扑结构的材料黏附于培养孔底部，并使用胶原和琼脂糖聚合物，来实现细胞在这些材料表面的黏附。在这些方法中，接种于表面的细胞可保留在孔隙内部及材料的上表面。然而，这一特性在一种 体内 系统，其中围绕生物材料的体液可能将细胞从多孔支架上的目标位点带走，一种应对方法是采用超声刺激，该方法虽需精密设备，但可促进成骨细胞标志物的表达 体外 检测方法5使用连续培养需要生物反应器，以确保培养基中营养物质的均匀分布；然而，由于该技术所采用的流速以及培养基黏附在设备壁上的原因，在更换培养基时会有相当比例的培养细胞丢失。这些问题增加了此类培养所需的细胞量以及获得足够数量细胞所需的时间。7因此，本研究中提出的方法学代表了一种应被推广应用于 体内 因为细胞被接种在表面材料的微质量区域上，经过适当的孵育时间后，初始细胞质量的60%已贴附。此外，该技术无需添加成骨诱导剂例如， 地塞米松、抗坏血酸或β-甘油磷酸钠）或超声刺激来诱导成骨细胞分化并维持成骨细胞表型，因为NKB是一种具有骨传导性和骨诱导性的支架8本研究中提出的人羊膜间充质干细胞（AM-hMSCs）在大孔骨生物材料上培养的方法，为将细胞植入受损骨组织并诱导其向成骨细胞系分化提供了一种可能。
方案
本研究遵循世界医学协会《赫尔辛基宣言》中关于涉及人类研究的伦理规范，并已获得墨西哥国立自治大学医学院研究伦理委员会（项目编号：101-2012）的批准。
1. 人源间充质干细胞的分离
- 试剂的配制
- 配制磷酸盐缓冲液（PBS），并添加1%抗生素-抗真菌溶液。
- 配制高糖型达尔伯克改良伊格尔培养基（HG-DMEM），加入10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌溶液。通过0.2 μm滤膜过滤除菌，对培养基进行灭菌处理。 µm 滤膜。
- 在不含FBS和抗生素-抗真菌溶液的高糖DMEM中配制100 U/ml的胶原酶II溶液。
- 对以下用于分离操作的手术器械进行高压灭菌：标准剪刀、普通解剖镊、尖头镊和有齿镊，以及手术刀柄（#4）。
- 人羊膜间充质干细胞的分离
- 用一只手握住脐带，另一只手剥离呈半透明薄膜状的羊膜（AM），以获得一段约5 cm的组织片段2如果样本中含有绒毛膜部分，需通过手工解剖分离其下方的绒毛膜，因为绒毛膜部分比羊膜更厚。
- 用5 ml PBS洗涤三次以去除残留血液，并用简易镊子清除血凝块。用手术刀在羊膜上做小切口，以产生约0.5 cm大小的碎片。2.
- 羊膜的酶消化
- 将AM与5 ml 0.125%胰蛋白酶/0.5 mM EDTA溶液在37℃孵育 °在37℃下，于50 ml锥形管中孵育30分钟 °C，置于5% CO₂环境中2 大气环境中，以250 × g离心，25℃ °37°C 孵育 5 分钟，然后通过弃去上清液去除胰蛋白酶溶液。
- 加入15 ml II型胶原酶溶液，于37℃孵育2小时 °C 在 5% CO₂ 环境中2 根据Leyva的方法，在振荡条件下进行反应 等9
- 消化胶原酶II后立即加入15 ml PBS，于250 × g离心，25℃ °10 分钟，4℃
- 弃去上清液，用 15 ml PBS 溶液洗涤细胞沉淀，于 250 x g 离心，25℃ °4℃离心15分钟。弃去上清液。
- 轻轻振荡，将细胞沉淀重悬于10 ml高糖DMEM（HG-DMEM）中。
- 间充质干细胞的扩增
- 接种2 ml细胞悬液（1 × 104 细胞/厘米²2) 于培养瓶中，加入 2 ml 高糖 DMEM（HG-DMEM），并将细胞在 37 ℃ 条件下孵育 °C，置于5% CO₂环境中2 大气环境。在培养5-7天后，通过更换培养基去除非贴壁细胞。
- 此后每隔3天更换一次培养基，持续7至10天，以获得90%的细胞汇合度。
- 回收细胞并在37℃孵育5分钟 °C，置于5% CO₂环境中2 含0.125%胰蛋白酶/EDTA溶液的环境（胰蛋白酶消化）。
- 胰蛋白酶消化后，立即用移液器收集细胞并转移至15 ml锥形管中，在250 × g下离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml高糖DMEM（HG-DMEM）中。
- 在两个75 cm²培养瓶中培养细胞悬液2 培养瓶（每瓶5 ml），并维持培养至90%汇合度。
- 重复步骤 1.4.3 至 1.4.6，直至第 9 代传代或继代培养。
- 通过胰蛋白酶消化法收集细胞，步骤同1.4.3至1.4.5，用于流式细胞术或其他研究。
2. 多孔骨基质圆盘（NKB）的制备
- 根据 Fassina et al.5 的方法，将 NKB 圆盘（直径 12 mm；厚度 2 mm）在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中，用不含 FBS 的高糖 DMEM（HG-DMEM）3 ml 浸润过夜。
- 浸润完成后，将圆盘转移至 50 ml 锥形管中，在 250 × g 条件下离心 5 分钟以去除多余的培养基，随后将圆盘放入 24 孔细胞培养板中。
- 加入 500 µl HG-DMEM，在 25 °C 下孵育 30 分钟。确保 NKB 圆盘表面无气泡，以利于营养物质和细胞的均匀分布。
- 若圆盘表面出现气泡，轻轻振荡并加入 300 µl 培养基，在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育 15 分钟。之后通过吸取孔壁处的培养基去除 300 µl，并确认无气泡形成。
- 使用普通镊子将圆盘转移至新的 24 孔板中。
3. 在多孔牛源基质上培养人源间充质干细胞
- 将三个传代培养的细胞悬液（每100 µl高糖DMEM培养基中含有5 × 105个AM-hMSCs）接种至预先润湿的生物材料圆片表面，在37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育30分钟。此步骤需缓慢且连续地在生物材料的上表面进行，以使细胞能够与支架的全部表面形貌发生相互作用。注意：该操作可实现附着于生物材料上的细胞数量达到表1中所示的60%。
- 加入1.5 ml 37 °C的高糖DMEM培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润环境中继续培养3天。添加培养基时避免产生湍流，以防细胞在培养皿底部发生非特异性沉积。此时间为初始时间点。
4. 流式细胞术对细胞表面标志物的表征
- 从 9 中分离细胞th 传代培养后，在接种到基质盘之前，使用0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA处理，并在冰浴的2%甲醛中固定30分钟。固定后，用0.05% PBS洗涤细胞一次。
- 通过在冰上用20%人免疫球蛋白孵育细胞3分钟以阻断非特异性结合，并孵育0.1 x 106 细胞等分试样与藻红蛋白（PerCP）标记的抗CD73单克隆抗体、FITC标记的CD90单克隆抗体、PE标记的抗CD34单克隆抗体、FITC标记的CD45单克隆抗体以及PE标记的CD105单克隆抗体在25℃孵育1小时 °在避光条件下进行。使用同型匹配的FITC偶联单克隆抗体、PE偶联单克隆抗体和PerCP偶联单克隆抗体作为阴性对照。
- 使用数据采集与分析软件计算表面标志物的表达水平。
5. 扫描电子显微镜检测细胞黏附
- 在培养3天后，用PBS冲洗细胞盘样品两次，然后用含0.1 M Na-卡可基酸钠缓冲液（pH 7.2）的4%（v/v）戊二醛溶液固定样品。
- 按照Rivera-N et al.10先前报道的方法制备样品，并在15 kV电压下，分别以500X和2000X的放大倍数使用扫描电子显微镜进行观察。
6. 细胞增殖检测
- 根据制造商的说明，向含有1.5 ml培养基的细胞圆盘样品中加入150 µl活细胞染料(AB)，并在37 °C、5% CO2的加湿环境中孵育细胞。
- 加入AB后立即（0小时）以及此后每24小时一次，直至细胞培养达到7天，于570 nm波长处测定吸光度，参考波长为600 nm。
7. 菌落形成单位（CFU）11
- 在100 mm组织培养皿中，以高糖DMEM培养基接种100个细胞，并在37 °C、5% CO2的湿化环境中培养14天。
- 用PBS洗涤培养物，加入0.5%结晶紫甲醇溶液，室温染色5–10分钟。
- 用PBS洗涤培养皿两次，使用血细胞计数板计数可见的克隆集落。
结果
人源间充质干细胞的分离
使用钝性解剖法将羊膜（AM）从绒毛膜中机械分离后（图1），通过胰蛋白酶和胶原酶II消化获得贴壁细胞群。如光学显微照片（图2A）和扫描电镜照片（图2B）所示，这些细胞群在培养皿中贴壁生长，于分离后3天呈现成纤维细胞样形态。本研究所用胎盘均来自已签署知情同意书的健康供体产妇。
通过流式细胞术进行细胞表征
从羊膜中获得的细胞群体对表面间充质标志物CD90+（93.5% ± 6.85）以及CD73+和CD105+（79% ± 3.46）呈强阳性反应，而对造血细胞标志物如CD34-和CD45呈阴性反应。因此，本研究中使用的羊膜来源人源间充质干细胞（AM-hMSCs）具有间充质特性，与Leyva先前报道的结果一致。 等 (图3此外，该结果与国际细胞治疗学会（ISCT）所确立的间充质干细胞免疫表型特征相一致。
细胞在骨基质上的黏附
扫描电镜显微照片显示了AM-hMSCs在NKB上接种后第七天的行为。接种第一天，生物材料表面覆盖有球形细胞；至第七天，部分伸展的细胞明显附着于牛基质表面。在更高倍数下，伸展的细胞似乎与基质表面紧密接触 通过 丝状伪足突起（FL）（图 4).
骨基质上的细胞增殖
AB实验结果显示，在孵育1天后，牛基质条件（+骨基质）的相对吸光度单位（RAU）略有下降；到第5天时，与未添加牛基质（-骨基质）的培养相比，支架的存在显著促进了细胞增殖（图5）。
菌落形成单位
菌落形成单位（CFU）是干细胞的传统检测方法。本研究中分离的羊膜来源人源间充质干细胞（AM-hMSCs）在培养14天后仍保持形成独立菌落的能力。
图1：羊膜的分离。（A） 用一只手握住脐带（UC），以确定获取羊膜的区域。（B） 羊膜（AM）呈半透明薄膜状，无血管分布。
图 2：人羊膜来源干细胞的形态学特征。 分离后第3天的羊膜来源人源间充质干细胞（AM-hMSC）培养物通过光学显微镜观察，呈现成纤维细胞样形态。
图 3：流式细胞术表征。 来自人羊膜的细胞主要为间充质细胞，因其对间充质标志物（CD73、CD90、CD105）呈阳性反应，表现为直方图向右偏移；而对造血标志物（CD34 和 CD45）呈阴性反应，表现为直方图向左偏移。抗原信号以红色直方图显示，PE 和 FITC 荧光染料的同型对照则以黑色显示。
图 4：细胞在牛骨基质上的黏附情况。 一系列扫描电镜图像显示细胞附着于生物材料的孔隙中。（A） 一个NKB孔的全景图像，显示多个细胞以球形状态（CS）和扁平状态（CF）黏附于生物材料表面；还可观察到培养第三天时牛骨基质中的骨陷窝（Lac）。（B） 细胞通过丝状伪足突起适应材料表面过程的放大图像。（C） 两个黏附并扁平化于牛骨基质上的细胞之间的相互作用（C1，细胞1；C2，细胞2）。请点击此处查看该图的高清版本。
图5：牛骨基质上细胞的增殖。 通过AB还原法评估细胞增殖，并以相对吸光度单位表示培养7天内的结果。结果显示骨基质（+骨基质）对AM-hMSCs增殖具有影响，与阴性对照条件（-骨基质）相比具有统计学差异。（*p <0.05）
图 6：间充质干细胞在不同初始接种密度下培养 14 天后的集落形成单位（CFU）实验结果（均值±标准差，n = 10）。
| 贴壁细胞数 | 细胞贴附率 (%) | |
| 底部的细胞 | 187667 ± 1208 | 62.47 |
| 支架上的细胞 | 312333 ±1208 | 37.53 |
表1：在牛源基质上的黏附效率。 细胞经胰蛋白酶消化回收后，使用血细胞计数板对黏附于培养皿底部以及黏附于支架上的细胞进行计数。表中数据为三次重复实验的两个独立实验结果，表示为均值±标准差
讨论
从人羊膜中获得的干细胞（图1）呈成纤维细胞样形态，类似于间充质细胞（图2），主要为间充质干细胞（MSCs）。此外，流式细胞术检测显示，这些细胞表达间充质细胞标志物（CD73、CD90 和 CD105），而不表达造血系标志物（CD34、CD45）（图3）。同时，本研究中分离的羊膜来源人源间充质干细胞（AM-hMSCs）具有形成集落形成单位（CFUs）的能力（图6）。类似地，以该方法分离的间充质干细胞仍保留附着于成骨诱导性生物材料（图4）并在支架上增殖的能力（图5）。
基于这些原因，本研究中采用的大孔骨生物材料培养AM-hMSCs的方法，为将细胞植入受损骨组织并诱导其向成骨细胞系分化提供了机会。该培养体系无需添加成骨诱导剂即可维持成骨细胞表型及成骨分化过程，因为NKB是一种具有骨传导性和骨诱导性的材料8。利用人类胎盘等废弃组织作为细胞来源，相较于其他常需侵入性手段或细胞得率较低的来源，是一种简单且符合伦理的获取具有分化为间充质干细胞潜能的干细胞群体的替代途径。
所提出的培养方法可外推至in vivo系统，因为细胞以微团形式接种于材料的上表面，经过适当的孵育时间后，细胞会定植并黏附于整个生物材料表面。此外，该技术无需复杂的试剂、设备和操作步骤，与现有方法相比，其关键之处在于采用微团培养法，以及将细胞悬液缓慢而稳定地沉积在材料上，以确保细胞优先与生物材料相互作用，而非与培养板底部接触。另一个关键点是在细胞培养前对材料进行预润湿处理，这可确保细胞在整合入材料时（无论位于表面或孔隙内部）均能从培养基中获得必要的营养物质。最后，使用具有成骨诱导性的生物材料对这一过程至关重要，因为它避免了额外添加外源因子以诱导和维持成骨细胞分化。该技术的局限性在于其依赖于牛源基质的成骨诱导潜能；然而，所提出的培养系统可推广至任何孔径分布为20至200 µm的多孔材料。因此，本文所介绍的方法是一种用于在多种组织工程材料中培养间充质干细胞的替代方案，尤其适用于骨组织再生研究。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT No.49887）、 墨西哥国立自治大学医学院 DGAPA IN201510 和 DGAPA IN216213 项目 提供的奖学金和经费支持；感谢国立围产期研究所 Salvador Correa 在生物材料方面提供的帮助；感谢 Biocriss S. A. de C. V 公司捐赠 Nukbone。同时感谢墨西哥国立自治大学材料研究所 Héctor Martínez 工程师以及国家理工学院高级研究中心 Fabiola Gonzalez 硕士提供的技术 支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无菌磷酸盐缓冲液 | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | 细胞培养 |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | 细胞培养 |
| FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | 细胞培养 |
| 高糖改良杜尔贝科必需培养基（DMEM） | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | 细胞培养 |
| II型胶原酶 | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | 细胞培养 |
| 3 mM 氯化钙 | SIGMA_ALDRICH | C5670 | 细胞培养 |
| 胰蛋白酶/0.5 mM EDTA 溶液 | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | 细胞培养 |
| 台盼蓝溶液 | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | 细胞培养 |
| 藻红蛋白（PerCP）标记的 CD73 | BD Pharmigen | 562245 | 流式细胞术 |
| FITC-CD90 | BD Pharmigen | 562245 | 流式细胞术 |
| PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | 流式细胞术 |
| FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | 流式细胞术 |
| PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | 流式细胞术 |
| BD FACSCalibur 流式细胞仪 | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | 流式细胞术 |
| 刃天青（AB） | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | 细胞增殖检测 |
| SUNRISE 酶标仪 | TECAN, Germany | Sunrise | 细胞增殖检测 |
参考文献
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重印与许可
