小鼠局部过敏反应的测定

摘要

过敏反应的特征是肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化，由IgE交联及促炎介质的释放所驱动。通过使用伊文思蓝染料监测变应原攻击后血管通透性的变化，可实现对过敏反应的定量评估。

摘要

过敏反应是肥大细胞和嗜碱性粒细胞被激活后，继而释放血管活性物质和促炎介质的结果。致敏个体接触过敏原后，可能出现从轻微红斑到危及生命的过敏性休克等一系列临床症状。在实验室中，已开发出多种动物模型以研究驱动过敏反应的机制。本文中，我们描述了一种用于测量血管通透性变化以量化局部过敏反应的详细方法。局部过敏反应检测最早于20世纪20年代被报道，本方法改编自Kojima et al. 于2007年发表的技术¹。在该实验中，对OVA致敏的小鼠，其左耳给予对照溶剂，右耳给予OVA进行激发。随后通过静脉注射伊文思蓝染料。注射伊文思蓝10分钟后，处死动物，并用甲酰胺过夜提取渗入耳部的染料。然后使用分光光度计定量测定提取染料的吸光度。该方法可稳定地产生可观察且可量化的局部过敏反应表现。

引言

I型超敏反应由抗原诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面IgE交联介导。这会导致细胞脱颗粒，并释放组胺、类胰蛋白酶和血小板活化因子等血管活性和促炎介质²。脱颗粒过程中预先形成的介质释放后，肥大细胞还会合成并释放前列腺素和白三烯，进一步增加血管通透性³。最初的临床反应发生迅速，称为“速发相反应”。在皮肤中，抗原攻击后数分钟内即可观察到风团和红晕反应。根据攻击剂量的不同，数小时后可能观察到“迟发相反应”。迟发相肿胀是由于局部水肿和白细胞募集至组织所致²。组胺通常被认为是参与速发过敏反应的主要介质，其作用于血管上表达的组胺受体1（HR1）和平滑肌上表达的组胺受体2（HR2）。这些作用的综合效应可增加炎症部位的血流量和血管通透性⁴。

为了研究过敏性炎症所涉及的机制，已开发出多种过敏动物模型，包括过敏性哮喘、全身性过敏反应和局部过敏反应的模型。近一个世纪以来，静脉注射染料已被用于检测动物模型中的局部过敏反应，有关该技术的文献最早可追溯至20世纪20年代⁵。兔子和豚鼠是最早用于检测速发型超敏反应的动物模型，其中耳部通常表现出最敏感的反应^5,6。此后，该检测方法在大鼠⁷和小鼠⁸中也得到了验证。

历史上曾采用多种实验方法，包括先注射抗原再注射染料、先注射染料再注射抗原，以及同时注射染料和抗原。静脉注射染料作为检测过敏反应的一种手段，是一种用途广泛的检测方法，可用于测定主动、被动和反向被动反应^5,9。已有多种染料被用于评估过敏反应，包括锥虫蓝（Trypan Blue）、庞塔明天蓝（Pontamine Sky Blue）、伊文思蓝（Evans Blue）、盖吉蓝536（Geigy Blue 536）和印度墨水（India Ink）^5,6,9。目前，0.5%伊文思蓝溶液是用于检测皮肤过敏反应的标准染料。

过敏反应具有短暂性；在注射染料后10至15分钟内达到最强反应强度，若在激发后超过30分钟才注射染料，则无论使用何种动物物种均无法观察到反应⁹。最初通过测量蓝色染料所显示的风团大小来定量染料外渗程度^7-9。此外，可通过切除反应部位的皮肤组织并用甲苯胺蓝染色，对脱颗粒的肥大细胞进行计数⁷。由于肥大细胞是表达高亲和力IgE受体FcεRI的主要局部细胞群体，其脱颗粒常被用作皮肤IgE介导过敏反应的标志。20世纪90年代，已开发出用于大鼠¹⁰和小鼠¹¹被动皮肤过敏反应（PCA）的分光光度法，以定量组织中的染料外渗。

以下局部过敏反应检测方案改编自 Kojima et al.¹，采用鸡卵清蛋白（OVA）作为抗原以诱导过敏反应。然而，如有需要，也可使用除 OVA 以外的其他抗原。该检测随后使用伊文思蓝染料来监测因肥大细胞 IgE 交联及组胺释放所导致的血管通透性变化。

方案

1. 致敏小鼠

1. 通过将OVA用1×PBS稀释至终浓度为20 mg/ml，制备OVA储备液。将储备液分装至冻存管中，于-80 °C保存，以备后续使用。
2. 将一份或多份20 mg/ml的OVA储备液恢复至室温。在带盖的5 ml聚苯乙烯圆底管中，用1×PBS将OVA稀释至终浓度为1 mg/ml，短暂涡旋混匀。
3. 将含有1 mg/ml OVA的聚苯乙烯管置于中速涡旋振荡器上，边涡旋边逐滴加入等体积充分混匀的Imject Alum（40 mg/ml），持续涡旋使Alum与免疫原形成1:1比例的混合物。
4. 盖上管盖，并用胶带将管子固定在涡旋振荡器上。将涡旋振荡器调至最低转速，使OVA在Alum上吸附30分钟。
   1. 制备OVA/Alum混合物后应尽快对小鼠进行致敏，避免间隔时间过长。若无法在制备后立即完成致敏，可将OVA/Alum混合物于室温保存。使用前需涡旋1分钟。
5. 用1 ml胰岛素注射器吸取OVA/Alum混合液，安装27号针头并盖上针帽。
6. 向BALB/c小鼠腹腔注射100 μl OVA/Alum混合液，每只小鼠剂量为50 μg OVA和2 mg Alum。
7. 设置阴性对照组，使用PBS致敏另一组小鼠。按照上述相同方法制备Alum与PBS的1:1混合液，省略OVA。
8. 对所有小鼠（OVA组和PBS对照组）每周致敏一次，连续3周，共注射3次。末次注射后，至少等待2周再进行局部过敏反应检测。

2. 局部过敏反应检测

1. 将OVA储备液恢复至室温。在1.5 ml微量离心管中，用PBS将20 mg/ml的OVA储备液稀释至终浓度为5 mg/ml（即OVA与1×PBS按1:4比例稀释）。短暂涡旋混匀。
2. 使用RC麻醉小鼠² 啮齿类动物麻醉系统（或性能相当的挥发性麻醉气体输送系统）。向储液罐中加入异氟烷，并打开氧气₂ 气流。将小鼠放入诱导室，调节异氟烷控制旋钮至5%以开始麻醉。当小鼠完全麻醉（以缺乏活动为标志）后，将异氟烷控制旋钮调节至3%以维持深度麻醉状态。本操作中麻醉的目的是使动物 immobilize（固定不动）。耳缘静脉和尾静脉注射不会对动物造成明显疼痛或痛苦。 
   注意：异氟烷可能对人类生殖系统产生不良影响。务必在通风良好的房间内使用，并将废气吸附罐连接至诱导室，以中和废气。若在怀孕期间使用异氟烷，应佩戴活性炭过滤口罩，以尽量减少暴露。
3. 将10 μl浓度为5 mg/ml的OVA加入带31 G针头的3/10 cc胰岛素注射器中。另取一支3/10 cc胰岛素注射器，加入10 μl的1×PBS。
4. 使用解剖显微镜，将10 μl OVA注入麻醉小鼠的右耳，给予50 μg OVA作为激发剂量。其他剂量（如20 μg）也可接受。
   1. 为稳定耳朵以便注射，将透明胶带（粘性面朝上）缠绕在15 ml锥形管上。将右耳背侧固定于胶带上。将针头斜面朝上插入耳片之间的间隙。缓慢向耳组织中心注射OVA，注意避免刺入任何血管。
5. 采用上述相同方法，向左耳注射10 μl PBS作为阴性对照。
6. 等待3分钟。
   1. 在此期间，将小鼠放入固定器中，并将其尾巴置于加热灯下或温水中1分钟，以扩张血管。
7. 使用带27 G针头的1 ml胰岛素注射器，缓慢向小鼠尾静脉注射200 μl的0.5%伊文思蓝染料。若注射速度过快，可能在完成200 μl注射前即破坏血管结构。若发生此情况，可尝试将剩余染料注射至尾部对侧的静脉。
8. 等待10分钟。
9. 处死小鼠，使用镊子和手术剪取下双耳。
   1. 用镊子夹住耳缘，注意避免对耳中央的注射部位施加压力。紧贴耳基部的软骨嵴进行剪切，尽可能多地切除耳部组织，但不要剪穿软骨嵴。切除的耳组织上可能残留少量毛发，这不会影响检测结果。
10. 将700 μl去离子甲酰胺分装至1.5 ml微量离心管中。每只耳朵准备一管（每只小鼠两管）。
    注意：甲酰胺具有致畸性、致突变性，并可引起刺激。操作时应佩戴手套、护目镜及面部防护用具。孕妇应谨慎操作，因甲酰胺可能对胎儿产生毒性。
11. 将耳组织加入甲酰胺中，盖紧管盖，在63 °C干式加热浴中孵育过夜。孵育后耳组织可能仍呈轻微蓝色，但大部分染料已提取至甲酰胺中。
12. 将每种样品各300 μl重复两份加入96孔板中。若样品中存在毛发，应避免转移。确保各孔中无气泡，以免影响吸光度读数。
13. 向96孔板中加入300 μl甲酰胺，设两个复孔。这些孔将作为空白对照。
14. 使用分光光度计在620 nm处测量吸光度。从每个样品的读数中减去甲酰胺对照孔的读数。
    注意：所有实验均在获统一服务大学机构动物护理与使用委员会批准的方案下进行。

结果

成功完成检测的动物，其皮肤和眼睛会呈现蓝色。经PBS致敏的动物应对PBS和OVA激发均无反应，因此双耳应保持白色（图1A）。在OVA致敏的动物中，接受PBS激发的耳朵（左侧）应完全呈白色，或仅在注射部位局部轻微发蓝。接受OVA激发的耳朵（右侧）在染料注射后10分钟内应逐渐变为更深的蓝色（图1B）。

经PBS致敏的动物在PBS和OVA激发后均呈现可忽略的吸光度读数（图2A）。对于OVA致敏的动物，PBS注射通常导致平均吸光度读数为0.13，标准差为0.04。相反，50 μg OVA激发的平均吸光度读数为0.58，标准差为0.18（图2B）。根据实验需要，激发所用OVA的剂量可在个体实验中进行调整。例如，20 μg OVA激发的平均吸光度为0.30，标准差为0.10（图2C），但低于20 μg的激发剂量可能无法获得可靠结果。OVA浓度的任何改变均须在使用前进行优化和验证。

结果可以以图形方式配对显示，将PBS吸光度与OVA吸光度进行比较。或者，结果也可表示为单个数值，即对每只动物分别用OVA吸光度减去PBS吸光度。

图 1：PBS 和 OVA 致敏动物的耳部色素沉积。（A） PBS 致敏动物的耳部色素沉积。左耳（用 PBS 激发）和右耳（用 50 μg OVA 激发）均显示极少或无染料外渗。（B） OVA 致敏动物的耳部色素沉积。左耳（用 PBS 激发）无过敏反应，表现为无蓝色染料外渗。右耳（用 50 μg OVA 激发）呈现明显的蓝色着色，提示血管通透性增加，这是耳部组织细胞活化的直接结果。

图 2：OVA 致敏动物的代表性吸光度（O.D.）值。 O.D. 值来源于在 620 nm 处测得的分光光度数据。(A) PBS 中 50 μg OVA 激发的 PBS 致敏动物。PBS 和 OVA 激发的 O.D. 值均可忽略不计。(B) PBS 中 50 μg OVA 激发的 OVA 致敏动物。PBS 激发的 O.D. 值 <0.2，OVA 激发的 O.D. 值 >0.3。(C) 20 μg OVA 激发。PBS 激发的 O.D. 值 <0.2。右耳因使用的 OVA 激发剂量较小，O.D. 值略有降低。

讨论

评估过敏原激发后过敏反应强度时，常使用多种过敏性疾病标志物，包括循环组胺水平的变化、Th2细胞因子的产生，以及在气道激发条件下支气管肺泡灌洗液中的细胞募集情况。尽管监测这些参数对于研究过敏反应至关重要，但生物学标志物并不总与临床过敏性疾病相一致。本方案所描述的局部过敏反应检测方法可对局部血管通透性进行可重复的测量，作为局部过敏性疾病的关联指标。通过使用蓝色染料外渗技术，该方案既可实现对局部过敏反应的可视化观察，也可进行相对定量分析。与依赖临床评分的过敏检测方法不同，本检测的主要结局指标（通过分光光度法吸光度测定的蓝色染料外渗）不易受到观察者偏倚的影响。另一优势在于，动物在激发后很快被实施安乐死，从而限制了过敏原激发和染料注射可能引起的不适。Akiyama 等人et al.¹⁰所述的手持式分光光度计的替代使用方法，可实现对血管通透性变化的连续测量。然而，伊文思蓝染料具有毒性，注射后最终需要将动物安乐死。

尽管该检测方法具有多项优势，但其局限性在于技术操作上存在一定难度。可靠的结果依赖于稳定且成功的耳部和尾静脉注射。如果未将全部激发剂量注入耳部，或耳部注射导致明显刺破血管，或伊文思蓝静脉注射未完全注入，则该动物应被排除在分析之外。在本实验室中，研究人员通常需要练习皮内耳部注射数周才能熟练掌握。此外，进行该检测时必须设置适当的对照。具体而言，应常规使用磷酸盐缓冲液（PBS）注射作为内部对照，因为动物对针头插入造成的损伤反应可能存在轻微差异。PBS对照值可提供由注射本身引起的血管通透性变化的基线参考。除了使用皮内耳部注射外，该检测也可应用于小鼠背部皮肤。研究人员可能会发现此方法技术难度较低，此外还可同时检测多种抗原。

局部过敏反应检测具有极高的灵活性，因为可以根据实验需求调整激发剂量。如果需要观察过敏反应的变化，使用较低剂量的卵清蛋白（OVA）激发（例如 20 μg）可能更为有利。这样可以提高对吸光度变化监测的敏感性，因为细胞活化达到饱和点的可能性会降低。

此外，该检测还可用于研究被动皮肤过敏反应（PCA）。在此模型中，将抗原特异性的 IgE 注射到一只耳朵，而将对照溶剂注射到另一只耳朵。24 小时后，通过静脉给予动物抗原和伊文思蓝染料进行激发。PCA 模型可缩短实验所需时间、减少使用动物的数量，并使研究人员能够观察 IgE 交联的特异性效应。

尽管该方法操作耗时较长，但本文所述的主动皮肤过敏反应（active cutaneous anaphylaxis, ACA）模型具有一些优势。通过每周暴露于抗原进行致敏，可模拟个体发生过敏性疾病的过程，因为致敏通常是全身性的，且患者体内通常同时存在循环中的抗原特异性IgE和IgG。虽然IgE交联是肥大细胞脱颗粒的主要机制，但肥大细胞也能对IgG交联产生反应。因此，ACA模型使研究人员能够探究过敏反应的多种机制，而不仅限于IgE介导的疾病过程。总之，尽管致敏方法的选择由研究者自行决定，但局部过敏反应检测具有良好的适应性，可与多种致敏方法联合使用。

耳部肿胀是评估过敏反应的常用指标，也可在OVA激发后进行测量。我们发现，注射后1小时，经OVA激发的耳部肿胀程度显著高于经PBS激发的耳部。与伊文思蓝实验相比，我们观察到耳部厚度测量的敏感性较低，且因测量设备使用时可能压迫耳部导致耳厚改变，不同操作者之间的测量结果变异较大。

除BALB/c小鼠外，也可使用其他品系的小鼠进行局部过敏反应检测；但吸光度读数会因所用小鼠品系的不同而略有差异。由于BALB/c小鼠倾向于产生强烈的Th2型免疫应答，因此在该检测中通常可获得可靠且可重复的读数。

该实验可用于定量检测经多种抗原致敏动物体内的局部过敏反应。抗原选择具有灵活性，因为该实验已成功应用于卵清蛋白（OVA）和钥孔血蓝蛋白（KLH）等常见过敏原。此外，无需致敏程序，通过向未致敏动物体内注射能够交联嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面IgE或IgE受体的抗体，或通过结合这些细胞上非IgE激活受体（如CD200R3¹）的方式，亦可诱导局部过敏反应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BALB/c 小鼠	杰克逊实验室	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
卵清蛋白	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	使用前充分混匀
伊文思蓝染料	Sigma	E2129
甲酰胺	Sigma	295876	99%以上，分光光度级
异氟烷，USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1 cc 胰岛素注射器	BD	329654
带 31 G 针头的 3/10 cc 胰岛素注射器	Terumo	NDC 100861
27 G 针头	BD	305109
镊子	F.S.T.	11000-12
手术剪	F.S.T.	14070-12
5 ml 聚苯乙烯圆底管	BD Falcon	352058
1.5 ml 微量离心管	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml 锥形管	BD Falcon	352097
平底 96 孔板	Costar	3590
透明胶带
RC2 动物麻醉系统	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	型号 G560，配备 3 英寸平台