小鼠量度本地过敏反应

摘要

过敏性反应，其特征在于由肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化，是由交联的IgE和炎症介质的释放驱动。过敏性反应的定量评估可以用伊文思蓝染料监察过敏原刺激后改变血管通透性来实现。

摘要

过敏性反应是肥大细胞和嗜碱性粒细胞，并随后释放血管活性和促炎介质的活化的结果。暴露于变应原的致敏个体可能会导致因不同轻微的红斑到危及生命的过敏反应临床症状。在实验室中，各种动物模型已经发展到理解驱动过敏性反应的机制。在这里，我们描述了用于测量变化，血管通透性量化局部过敏性反应的详细方法。局部过敏反应测定最早是在20世纪20年代的报道，并已改编自Kojima 等人发表的技术。在2007年^1，在该试验中，敏化，以OVA小鼠左耳用车辆和在右耳用OVA激发。这后面是静脉注射伊文思蓝染料。注射伊文思蓝后十分钟，将动物安乐死，并在已渗出的染料到耳朵在一夜之间甲酰胺提取。所提取的染料的吸光率，然后定量用分光光度计。这种方法确实导致的局部过敏反应的可视化和可量化的表现。

引言

I型超敏反应是由IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的表面上的抗原诱导的交联介导的。这导致细胞脱颗粒和血管活性和炎症介质如组胺，类胰蛋白酶，和血小板活化因子²的释放。以下预成形介体的脱颗粒过程中释放细胞，肥大细胞合成和释放前列腺素和白三烯，这进一步增加血管渗透性^，3。最初的临床反应迅速发生，并且被称为“直接反应”。在皮肤中，风团和耀斑响应的抗原激发分钟内很容易地看到。根据这一挑战的剂量，就可以看到一个“晚期反应”几个小时后。后期肿胀是由 ​​于局部水肿和白细胞募集到组织^2。组胺，一般被认为是主要的介体参与立即过敏性反应，作用于组胺受体1（HR1）表示对血管和组胺受体2（HR2）表达平滑肌。的联合作用增加了血流量和血管通透性在炎症⁴的位点。

多种过敏的动物模型已经发展为了研究参与过敏性炎症的机制，包括过敏性哮喘，全身性过敏反应，及本地过敏反应模型。静脉给药染料被用来衡量在动物模型中的局部过敏反应近一个世纪以来，随着出版物描述了这一技术可以追溯到20世纪20年代^5。兔和豚鼠分别用于测试速发型超敏反应的第一个动物模型，以及最敏感的反应普遍发现在耳朵^5,6。该法后来被证实为⁷大鼠和小鼠⁸使用。

从历史上看，各种实验方法已被使用，包括在注射之前，染料，染料注....

方案

1，小鼠敏感

1. 通过在1×PBS中稀释的OVA的20毫克/毫升的最终浓度制备OVA原液。冻结下在冷冻管并储存等分在-80℃下以供将来使用。
2. 带来的20毫克/毫升OVA股票的一个或多个等分试样至室温。在1X PBS稀释的OVA为1毫克/毫升的最终浓度在5ml的聚苯乙烯圆底管帽。轻轻振荡混匀。
3. 1的比例：在保持含有1毫克/毫升OVA上的旋涡设置在中等速度的聚苯乙烯管中，同时继续涡管，以产生1加彻底匀浆Imject明矾（40毫克/毫升）逐滴加入等体积明矾免疫原。
4. 将瓶盖上的管带管的涡流。转涡旋上最低的设置，并允许OVA吸附到明矾30分钟。
   1. 不要让大量的时间来准备OVA /明矾和致敏小鼠之间传递。如果增感，不能直接OVA /明矾preparat后完成离子，商店OVA /明矾在室温下。旋涡使用前1分钟。
5. 装入1 ml胰岛素注射器以OVA /明矾的混合物。顶盖采用27号针头的注射器。
6. 注入100μl的OVA /明矾到BALB / c小鼠的腹膜为每只小鼠的50微克的OVA和2mg明矾剂量。
7. 为阴性对照，致敏另一组小鼠以PBS中。制备1：明矾和PBS的混合物中同样地在上面列出，省略OVA。
8. 敏感的所有小鼠（OVA和PBS对照），每周一次，连续3周，共注射3次。最后一次注射后，请等待至少2周进行局部过敏反应试验之前。

结果

已成功进行了试验动物都会有皮肤和眼睛呈现蓝色。 PBS致敏动物不应反应以PBS或OVA激发，因此两个耳朵应保持白色（ 图1A）。 OVA致敏的动物中，耳朵接收PBS挑战（左）应该是全白或在注射部位的局部的方式轻轻蓝色。耳接收OVA激发（右）应逐渐变暗的蓝色染料施用（ 图1B）之后的10分钟期间成为。

PBS致敏的动物将具有可忽略的吸光度读数为与PBS和OVA挑战（ 图2A）。对OVA致敏的动物中，注射PBS通常导致0.13的平均吸光率读数和0.04的标准偏差。相反，50微克OVA激发产生的0.58的平均吸光度读数和0.18的标准偏差（ 网络gure 2B）。在用于挑战OVA的量，如果必要，可以调整单个实验。例如，有20微克OVA激发的结果在0.30平均吸光度和0.10（ 图2C）的标准偏差，但不到20微克挑战可能不能给出可靠的结果。变化OVA浓度必须优化和使用之前进行验证。

讨论

许多过敏性疾病的标志物被用于评估下面的变应原激发过敏性反应，包括在气道激发的设置改变循环组胺，Th2型细胞因子的产生和细胞招募的水平进入支气管肺泡灌洗液的强度。而在这些参数监测的变化是研究过敏反应重要的是，生物标记物不总是关联与临床过敏性疾病。在本协议中所描述的地方过敏反应试验提供了本地化的血管通透性为局部过敏性疾病的一个相关可重复的测量。用蓝色染料外渗，该协议使双方的可视化和本地化的过敏反应相对定量。相反，依赖于临床评分过敏测定法，该测定法的（蓝染料外渗通过分光光度法测定吸光度）的主要成果是不容易受到观察者偏倚。另外ADVAntage是动物安乐死的挑战后不久，限制了潜在的过敏原的挑战和染料的管理造成任何不适。替代使用由秋山等人 ¹⁰所述的手持式分光光度计的允许变化的血管通透性的连续测量。然而，伊文思蓝染料是有毒的，并且注射将最终导致动物的需要被实施安乐死。

虽然此法具有许多优势，但它的特点，是有点技术难度的限制。可靠的结果依赖于一致的，成功的耳和尾静脉注射。如果整个攻击剂量未给药于耳，如果耳注射导致的血管明显穿刺，或者如果伊文思蓝静脉注射是.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BALB/c 小鼠	杰克逊实验室	651
PBS pH 7.4	质量生物制剂	114-058-101
卵清蛋白	Sigma	A5503-10G
Imject 明矾	Thermo Scientific	77161	使用前充分混合
Evans Blue 染料	Sigma	E2129
甲酰胺	Sigma	295876	99%+ 分光光度级
异氟醚，USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc 胰岛素注射器	BD	329654
3/10 cc 带 31 G 针头的胰岛素注射器	Terumo	NDC 100861
27 G 针头	BD	305109
镊子	F.S.T.	11000-12
手术剪刀	FST14070-12
5 ml 聚苯乙烯圆底管	BD Falcon	352058
1.5 ml 微量离心管	医疗供应合作伙伴	15-1151
15 ml 锥形管	BD Falcon	352097
平底 96 孔板	Costar	3590
透明胶带
RC2 啮齿动物麻醉系统	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	型号 G560，带 3 英寸平台