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方法文章

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

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DOI：

10.3791/52010

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2014年9月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。

摘要

迫切需要开发修复受损心脏的方法，发现对心脏无毒副作用的新型治疗药物，并改进精确模拟心脏病的策略。利用人诱导性多能干细胞（hiPSC）技术在“培养皿中”生成心肌细胞以实现上述应用，这一潜力持续引发高度关注。近年来，从人多能干细胞（hPSCs）高效生成心肌细胞的能力已显著提高，为我们研究以往难以触及的人类心脏早期发育阶段提供了新的机遇。与许多以往的方法不同，本文所述的心肌细胞分化方案无需细胞聚集，也无需添加Activin A或BMP4，且在迄今为止测试的所有人胚胎干细胞（hESC）和hiPSC细胞系中，均可在第10天稳定地获得高比例表达心脏肌钙蛋白I和T（TNNI3, TNNT2）、Iroquois类同源结构域蛋白IRX-4（IRX4）、肌球蛋白调节轻链2心室/心肌同工型（MLC2v）以及肌球蛋白调节轻链2心房同工型（MLC2a）的细胞培养物。这些细胞可在体外传代并维持培养超过90天。该策略在技术上易于实施且成本效益高。对多能干细胞来源的心肌细胞进行表征时，通常需在mRNA和蛋白质水平上分析参考标志物。在蛋白质分析中，流式细胞术是一种强大的分析工具，可用于评估培养细胞的质量并确定亚群的均一性。然而，样本制备过程中的技术差异会显著影响流式细胞术数据的质量。因此，标准化染色方案将有助于不同分化策略之间的比较。为此，本文描述了用于通过流式细胞术分析IRX4、MLC2v、MLC2a、TNNI3和TNNT2的优化染色方案。

引言

由人多能干细胞（hPSCs），包括人胚胎干细胞（hESC）和人诱导多能干细胞（hiPSC），分化生成心肌细胞，可作为 体外 极早期人类心脏发育过程的模型，为通常难以通过机制研究获取的发育阶段提供了深入见解。该模型系统为研究调控心脏谱系承诺和细胞命运决定的分子通路提供了独特的机会。近年来，从人多能干细胞（hPSCs）高效生成心肌细胞的能力已显著提升1-15然而，不同实验方案在生成心肌细胞的效率以及细胞表达心室特异性标志物的时间上存在细胞系间的差异。例如心室和心房）。理想情况下，为了该模型系统的未来应用，需要获得功能定义更明确且更为均一的细胞群体。与以往方法不同，本文所述的心肌细胞分化方案无需细胞聚集，也无需添加激活素A（Activin A）或骨形态发生蛋白4（BMP4），在所有迄今测试的人胚胎干细胞（hESC）和人诱导多能干细胞（hiPSC）系中，均可在第10天高效地获得TNNI3、TNNT2、IRX4、MLC2v和MLC2a高度阳性的细胞培养物。该策略在技术上易于实施，尤其相较于三维培养、大规模培养或基于拟胚体的策略而言更为简便。4-9，并在最近一项研究中被定义，该研究描述了一种对人多能干细胞（hPSCs）具有选择性毒性的小分子（Boheler 等)65该方案的特点包括在单层培养体系中使用经hESC验证的基质（Matrigel）进行hPSC的分化，以及采用小分子调控Wnt信号通路的完全定义培养基（类似但不同于1,2,7,13），以及用于评估分化效率和细胞身份的优化流式细胞术染色方法。总之，与以往报道相比，本方案的优势包括成本效益高、可重复性强，以及在多种人多能干细胞系（包括hESC和hiPSC系）中高效生成心肌细胞的能力。

流式细胞术是一种强大的分析工具，可用于评估培养细胞的质量并确定亚群的均一性，在合理的实验设计下，还可提供定量测量结果。与所有基于抗体的策略一样，准确解读实验结果需要针对每种抗体仔细优化实验条件，包括抗体浓度以及固定和通透条件（当靶向细胞内抗原时）。次优条件会显著影响抗体结合效率，从而影响结果的解读。尤为重要的是，若需进行定量分析，必须使用单克隆抗体，因为多克隆抗体可识别多个表位，且易出现批次间差异。目前已有多种抗体（多克隆和单克隆）及染色方案被用于评估 体外 分化，使得不同方案间心肌生成效率的比较变得困难1,2,9,11因此，在所有流式细胞术分析中，若有单克隆抗体可用，均优先使用单克隆抗体。未来，随着这些染色方案（尤其是定量方面）的逐步标准化，将更有助于不同分化策略之间的比较。

用于评估纯度的标志物及其相应抗体的选择 体外 不同研究报道的心肌发生过程存在差异。TNNT2 被认为是细胞承诺向心肌细胞命运分化的标志物，常用于评估心脏分化方案的效率。然而，TNNT2 在早期鸡和大鼠发育过程中也表达于骨骼肌中16,17 且存在于人体平滑肌中18因此，TNNT2 并不一定是人类心肌发生的特异性标志物 体外MLC2v 和 MLC2a 通常分别用作心室型和心房型心肌细胞的替代标志物。然而，在以下背景下依赖 MLC2v 和 MLC2a 来确定心肌细胞亚型存在挑战： 体外 分化差异的产生原因在于，这些基因产物在从心管期到成体的整个心脏发育过程中，可能并不局限于特定的心腔。在啮齿类动物的弯曲心脏中，MLC2a mRNA 主要在心房/流入道区域占主导，而 MLC2v mRNA 则主要在心室/流出道区域占主导。在弯曲心脏阶段，MLC2a 和 MLC2v mRNA 的共表达可见于流入道、房室管以及流出道区域19,20出生后3天，MLC2v mRNA 仅限于心室表达；出生后10天，MLC2a 仅限于心房表达，在新生大鼠心脏中如此分布。19因此，在解读有关心肌发生效率和亚型特征的数据时，不仅需要考虑参考标志物的表达及其数量，还必须考虑所分析的分化时间点所对应的发育阶段。这一点尤为重要，因为通过心肌发生过程生成的细胞的成熟阶段 体外 hPSCs 的分化过程与胚胎/胎儿发育过程最为相似21-25因此，至少在某些情况下，依赖标记物在出生后心脏中的空间表达来评估hPSC分化细胞可能并不合适。

为了促进制定更特异的标准以定义心肌细胞身份 体外，TNNI3 被认为是评估心肌发生的重要标志物 体外 因为在鸡和斑马鱼的胚胎发生过程中，它仅局限于心肌组织15,20 在人类胎儿骨骼肌中不存在26虽然TNNI1存在于人类胎儿心脏中，但TNNI3是正常成人心脏中唯一存在的TNNI同工型27,28关于心肌细胞亚型身份，IRX429-31 是心室命运细胞的一个重要标志物。在蛋白水平上，最近研究表明，在小鼠从线性心管期到新生期的发育过程中，IRX4 仅局限于心室表达。32因此，本文描述了用于通过流式细胞术分析TNNI3和IRX4的优化染色方案。据我们所知，这是首次报道通过基于抗体的染色方法，利用流式细胞术高效检测人心肌细胞中IRX4水平的技术。

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方案

1. 溶液与培养基的配制

  1. 人胚胎干细胞合格基质涂层储备液
    1. 将人胚胎干细胞合格基质（5 ml）置于冰上，在 4 ºC 条件下过夜缓慢解冻。分装至预冷的无菌 1.5 ml 微量离心管中，并立即于 -20 ºC 保存。
      注意：分装体积因批次而异，通常为 270–350 µl。制造商提供将分装液稀释至 25 ml 后达到 1x 浓度所需的分装体积详情，详见步骤 2.1。
  2. 人多能干细胞培养基储备液
    1. 除非另有说明，使用超纯水作为稀释剂。所有组分均使用 0.22 µm 滤器进行除菌。以下组分以大包装溶液形式于 4 ºC 保存：碳酸氢钠（75 mg/ml）；柠檬酸（10 mM，pH = 3）。
    2. 所有组分使用 0.2 µm 注射器滤器除菌，并分别分装后于 -20 ºC 保存：Rho 激酶（ROCK）抑制剂 Y-27632（10 mM，溶于 DPBS，100 µl 分装）；L-抗坏血酸-2-磷酸（64 mg/ml，500 µl 分装）；亚硒酸钠（70 µg/ml，100 µl 分装）；转铁蛋白（50 mg/ml，107 µl 分装）；成纤维细胞生长因子 2（FGF2；200 ng/µl，溶于 DPBS，250 µl 分装）；转化生长因子 β1（TGFβ1，100 ng/µl，溶于冷的 10 mM 柠檬酸，10 µl 分装）。
  3. 人多能干细胞培养基 E8 溶液组成
    1. 使用步骤 1.2 中制备的分装液配制培养基：DMEM/F12（含 L-谷氨酰胺和 HEPES；500 ml）、碳酸氢钠（3.62 ml；终浓度：543 µg/ml）、L-抗坏血酸-2-磷酸（500 µl；终浓度：64 µg/ml）、亚硒酸钠（100 µl；终浓度：140 ng/ml）、转铁蛋白（107 µl；终浓度：10.7 µg/ml）、胰岛素（1 ml；终浓度：20 µg/ml）、FGF2（250 µl；终浓度：100 ng/ml）、TGFβ1（10 µl；终浓度：2 ng/ml）。
    2. 混合所有组分，经滤膜除菌后于 4 ºC 保存，最多可保存 2 周。
  4. 含 ROCK 抑制剂的人多能干细胞 E8 培养基
    1. 向 12 ml 上述制备的 E8 培养基中加入 15 µl ROCK 抑制剂，充分混匀。确保在步骤 3.7 加入细胞/培养基后终浓度为 10 µM。
  5. Wnt 通路调节剂储备液
    1. 以下分装液于 -20 ºC 保存。CHIR 99021（6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5​-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙​基]氨基]-3-吡啶甲腈；10 mM，溶于 DMSO，15 µl 分装）。IWR-1（4-(1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4,7-亚甲桥-2H-异吲哚-2-基)-N-8-喹啉基-苯甲酰胺；10 mM，溶于 DMSO，6 µl 分装）。
  6. 分化培养基
    1. 使用 RPMI 1640（含 L-谷氨酰胺）并添加 2% B27 不含胰岛素补充剂，配制分化培养基 #1。
    2. 使用 RPMI 1640（含 L-谷氨酰胺）并添加 2% B27 含胰岛素补充剂和 2% FBS，配制分化培养基 #2。
  7. 细胞培养用洗涤液
    1. 使用不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）。
  8. 流式细胞术用细胞洗涤液
    1. 使用含 1% FBS 的磷酸盐缓冲液（PBS，不含钙和镁）。于 4 ºC 保存。
  9. 流式细胞术用细胞维持液
    1. 使用含 5% FBS 的汉克氏平衡盐溶液（HBSS；不含钙和镁）。于 4 ºC 保存。
  10. 流式细胞术用固定液
    1. 使用 Cytofix 缓冲液作为 TNNI3 和 IRX4 抗体的固定液。
    2. 使用新鲜配制的 4% 多聚甲醛溶于 1x PBS 作为 TNNT2 和 MLC2a 抗体的固定液。
    3. 使用 70% 甲醇/30% 丙酮作为 MLC2v 抗体的固定液。
    4. 所有溶液于 4 ºC 保存。
  11. 流式细胞术用透化液
    1. 使用 Phosflow Perm Buffer III 作为 TNNI3 和 IRX4 抗体的透化液。室温（25 °C）保存。
    2. 使用含 0.2% Triton X-100 的 1x PBS 作为 TNNT2、MLC2v 和 MLC2a 抗体的透化液。于 4 ºC 保存。
  12. 封闭液
    1. 使用含 10% 山羊血清的 1x PBS。现配现用，配制后于 4 ºC 保存至使用前。

2. 包被平板

  1. 在使用前，于4 ºC条件下缓慢融化1份适用于hESC的基质胶30分钟，加入25 ml预冷的DMEM/F12培养基中，在无菌细胞培养超净台内充分混匀，立即用于包被6孔板。
  2. 在无菌细胞培养超净台内，每孔加入1 ml混合液至6孔板中（1份适用于hESC的基质胶足以包被四块6孔板）。
  3. 将6孔板置于超净台内，室温静置30分钟使hESC适用基质胶凝固。吸除多余基质胶，每孔加入2 ml含ROCK抑制剂的E8培养基。包被后的培养板应立即使用；如需储存，可在包被后立即置于4 °C保存最多1周，使用前于室温平衡30分钟。

3. 单层培养中未分化人多能干细胞的传代与维持

  1. 在6孔板中以单层培养方式维持hPSCs，并在无菌细胞培养操作台内进行所有操作步骤。
  2. 使用已建立良好的hPSC细胞系（>p20）且形态均一，无神经样、上皮样或成纤维细胞样形态的细胞。确保细胞增殖旺盛，以0.75 × 10⁴细胞/cm²接种时，平均每三天传代一次，汇合度达75%时进行传代。 106 每孔
  3. 至少以单细胞水平解离传代人多能干细胞5次 在启动分化之前进行操作，以确保最大分化效率。传代hPSCs时，吸除E8培养基，用4 ml 1×DPBS（预热至室温）洗涤细胞两次。每孔加入1 ml细胞解离溶液（预热至室温），静置3–7分钟，直至细胞边界开始变圆。
  4. 使用带有棉塞的玻璃移液管和吸球吹打细胞，使其脱落，并转移至含有1 ml DMEM/F12培养基的15 ml锥形管中（以灭活细胞解离液）。
  5. 取出10 µl细胞溶液，与10 µl台盼蓝混合于微量离心管中。计数细胞（例如 使用自动或手动血细胞计数板进行细胞活力检测，同时以130 × g离心5分钟（室温）收集其余细胞。采用本方案时，使用自动血细胞计数板可获得70–80%的细胞活力，后续实验的细胞数量均以总细胞数为准。
  6. 吸弃培养基，用DMEM/F12重悬细胞沉淀，调整终浓度为0.75 x 106 每 500 µl 细胞数。
  7. 向6孔板的每个孔中加入500 µl细胞悬液，每孔预先加入2 ml含ROCK抑制剂的E8培养基（按步骤2.3配制）。将培养板置于工作台上，轻轻前后左右晃动，使细胞均匀分散于孔内。随后将细胞放回37°C、5% CO₂培养箱中培养。237 ºC
  8. 传代后24小时开始，每天更换培养基，每孔使用2 ml不含ROCK抑制剂的E8培养基。优化接种密度，以确保在启动分化前达到100%汇合度。接种密度为0.75 × 106 四天前按每孔细胞数接种，以启动分化，但需根据各细胞系优化条件。

4. 通过选择性调控 Wnt 通路诱导人多能干细胞分化为心肌细胞

  1. 在第0-7天期间每天更换培养基（每孔2 ml），第8天后每隔一天更换一次。
  2. 第0天开始分化过程，将E8培养基更换为分化培养基#1，并向每孔加入1.2 µl CHIR（终浓度6 µM）。第1天重复此操作。
  3. 第2-3天，更换为新鲜的分化培养基#1。
  4. 第4天，更换为新鲜的分化培养基#1，并向每孔加入1 µl IWR-1（终浓度5 µM）。第5天重复此操作。
  5. 第6-7天，更换为新鲜的分化培养基#1。
  6. 第8天，更换为新鲜的分化培养基#2。
  7. 此后每隔一天更换一次分化培养基#2，持续培养至所需时间。
  8. 如需传代心肌细胞，可使用细胞解离溶液，按照步骤3.3-3.6进行操作，但将培养基替换为分化培养基#2。传代时将心肌细胞解离为约3-10个细胞的小细胞簇，以每孔约6 × 105个细胞的密度接种至经hESC认证基质包被的孔中，并使用分化培养基#2。

5. 流式细胞术用细胞的收集

  1. 在实验台面上完成步骤5-9的其余所有操作即，非无菌）。
  2. 吸弃培养基，用1×PBS洗涤细胞两次。每孔加入1 ml细胞解离液（预热至室温），静置3–7分钟，直至细胞边界开始变圆。使用带橡胶吸头的棉塞硼硅酸盐玻璃一次性9英寸移液管吹打脱落细胞，并转移至冰上预冷的15 ml离心管中。
  3. 在后续实验步骤中，始终将细胞置于冰上，并在4 ºC下以200 × g离心5分钟。
  4. 通过离心收集细胞，并吸除上清液。使用10 ml血清移液管将细胞重悬于10 ml细胞洗涤液中，反复吹打混匀，确保细胞团块分散为单细胞。在离心收集剩余细胞的同时，按照步骤3.5计数细胞。
  5. 在细胞洗涤液中重悬细胞，注意充分分散细胞沉淀，并分装为每份 1 x 106 每圆底管加入细胞。离心收集细胞，吸除上清液。

6. 胞内抗原染色的细胞固定与通透

  1. 向细胞沉淀中加入 100 µl 固定液。在持续轻柔涡旋振荡的同时逐滴加入溶液，然后置于冰上 15 分钟。
  2. 加入 3 ml 细胞洗涤液。通过离心收集细胞，并吸除上清液。
  3. 向细胞沉淀中加入 100 µl 透化液。在持续轻柔涡旋振荡的同时逐滴加入溶液，然后置于冰上 30 分钟。固定和透化条件应根据 表 1 中每种抗体的要求进行设置。
  4. 加入 3 ml 细胞洗涤液。通过离心收集细胞，并吸除上清液。透化后共进行两次洗涤，重复此步骤一次。
一抗（克隆号）识别的免疫原/表位同型对照每 100 µl 体系中 1 × 106 个细胞所用一抗用量固定液通透液二抗每 100 µl 体系中 1 × 106 个细胞所用二抗用量 
用于阳性率检测用于抗原定量
TNNI3 (284 (19C7)ISASRKLQL（人源）小鼠 IgG2b1.0  µg3.0 µgBD CytofixBD Phosflow perm III山羊抗小鼠 IgG2b-Alexa488600 ng
TNNT2 (1C11)全长纯化的天然人源肌钙蛋白 T 蛋白小鼠 IgG11.0  µg2.0 µg1% PBS 中的 4% PFA1% PBS 中的 0.2% Triton X-100山羊抗小鼠 IgG1 - Alexa 488600 ng
MLC2v  (330G5)FDPEGKG小鼠 IgG2a2.0  µg3.0 µg70% 甲醇 / 30% 丙酮1% PBS 中的 0.2% Triton X-100山羊抗小鼠 IgG2a - Alexa 647600 ng
MLC2a  (4E7)在 E. coli 中表达的全长人源 MYL7 重组蛋白小鼠 IgG10.5 µg3.0 µg1% PBS 中的 4% PFA1% PBS 中的 0.2% Triton X-100山羊抗小鼠 IgG1 - Alexa 488600 ng
IRX4LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST		兔 IgG0.5 µg0.5 µgBD CytofixBD Phosflow perm III山羊抗兔 IgG-PE600 ng

表1. 抗体浓度。 下表列出了用于流式细胞术分析的每种一抗和二抗的抗体、克隆号（若为单克隆抗体）、优化后的使用浓度以及固定的和透化处理条件。由于相同克隆号的抗体原液浓度在不同供应商之间可能存在差异，因此提供的是每1 × 106个细胞在固定反应体积中的最终使用浓度，而非稀释比例。抗体生产时所用的免疫原或抗体识别的表位信息由制造商提供，但本研究未对其进行实验验证。

7. 抗体染色

  1. 每次实验均需设置一个未染色对照，对应每种固定/通透条件，并为每种使用的一抗设置相应同型对照。使用非心肌细胞类型的细胞作为阴性对照（例如，多能干细胞或成纤维细胞）。同型对照的使用浓度应与相应一抗相同（见表1）。
  2. 使用P200移液器将细胞重悬于100 µl封闭液中以充分分散细胞。冰上孵育25分钟，同时轻柔振荡。
  3. 不移除封闭液，按照表1中的指南加入一抗或同型对照。冰上孵育45分钟，同时轻柔振荡。
  4. 加入3 ml细胞洗涤液。通过离心收集细胞并吸除上清液。在一抗标记后共洗涤两次。
  5. 若使用荧光染料偶联的一抗，则直接进行步骤8.1。若使用未偶联的一抗（如本文所述所有标志物），则按以下步骤使用荧光染料偶联的二抗进行标记。
  6. 使用P200移液器将细胞重悬于100 µl封闭液中以充分分散细胞。
  7. 按照表1中的指南加入二抗。冰上孵育30分钟，同时轻柔振荡。
  8. 加入3 ml细胞洗涤液。通过离心收集细胞并吸除上清液。在二抗标记后共洗涤两次。

8. 流式细胞术样品的细胞准备

  1. 使用 P1000 移液器将细胞重悬于 400 µl 细胞维持液中，以分散细胞。
  2. 在圆底管上安装细胞筛网帽，先用 50 µl 细胞维持液润湿，然后将管置于冰上。使用细胞筛网帽可防止细胞团块堵塞流式细胞仪的进样管路。
  3. 将细胞悬液转移至细胞筛网帽上，依靠重力使细胞悬液自然滤入管中。必要时可轻敲管底以促进细胞完全进入管内，并尽快将管放回冰上。用 250 µl 细胞维持液冲洗筛网，以确保最大程度回收细胞。
  4. 将细胞置于冰上并避光保存，直至进行流式细胞术分析。

9. 流式细胞术分析

不同仪器的详细采集设置会有所差异。以下介绍了实现最佳数据采集所需考虑的基本参数。

  1. 为获得最佳的液流稳定性，确保喷嘴尺寸超过待分析细胞直径的5-6倍 。
    注意：不同仪器之间该参数可能有所差异，但在分析仪使用及选择适合细胞分选的喷嘴尺寸时，此点均需重点考虑。第10天心肌细胞的平均直径为11 µm（范围为8-14 µm）；因此，使用分析仪上的标准150 µm样品进样管效果良好。
  2. 在进行数据分析前，立即短暂涡旋每根试管，以分散细胞聚集体。
  3. 根据实验中所用每种固定/透化条件下的未染色对照，针对每种细胞类型优化前向散射和侧向散射的电压设置，使目标细胞群落在量程范围内并居中显示（图2A）。
    1. 在整个单次实验过程中保持这些设置，并在相同仪器上不同实验间保持一致，因为显著偏移可能提示流式细胞仪或样品制备存在问题。
  4. 针对每种荧光染料，分析同型对照，并调节相应的激光电压，以确定获得荧光直方图所需的最低强度，该直方图应同时显示峰的左侧和右侧边缘。在采集相应抗体染色样品的数据时，保持同型对照的激光设置不变。
    注意：同一仪器上信号漂移常随时间发生。每次实验开始时，必须根据适当的同型对照调整激光设置。
  5. 至少采集10,000个事件，推荐采集50,000个事件。
  6. 进行统计分析时，设门圈出活细胞群体以排除碎片（图2A）。根据标记物设门位置确定门内群体中阳性细胞百分比，设门应使同型对照的非特异性信号贡献不超过2%，如图2B,C所示。

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结果

第0天时，细胞融合度达到100%，形态紧凑，细胞碎片极少。在第1-2天，常可观察到明显的细胞死亡（40-50%），但贴壁细胞仍保持紧凑的形态（图1A）。此时培养基呈橙色且浑浊。若培养基变为粉红色，提示细胞死亡过度，应通过台盼蓝染色确认，若细胞死亡率超过70%，则应终止实验。细胞在第3-4天开始恢复，密度逐渐增加。第5-6天时，细胞死亡极少，可能出现致密细胞区域。至第7-8天，形成融合的单层细胞，形态紧凑，并散布有致密区域。细胞通常在第8天开始出现自发性收缩，最初的收缩多见于致密区域。到第10天，收缩更为有力，并在随后几天内逐渐扩散至整个培养层。α-肌动蛋白in和TNNT2的免疫细胞化学染色显示肌节结构（图1A）。通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测，中胚层及心肌定向分化标志物的mRNA表达水平呈现预期的时间表达谱（图1B），包括心脏标志物Nkx-2.5同源盒蛋白（NKX2.5）、TNNI3、MLC2a、MLC2v和肌球蛋白-6（MYH6）的显著表达。平滑肌（肌球蛋白重链11，MYH11）和骨骼肌（生肌素，MYOG）标志物的表...

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讨论

分化方案成功的关键在于使用高质量的hPSC培养物，这些细胞在开始分化前应至少经过五次单细胞水平的传代。如果各种hPSC细胞系在分化起始时均达到100%汇合度，则其分化效率通常相似，且与细胞系本身无关。若分化起始时细胞汇合度≤95%或>100%，则会观察到次优的分化效率。因此，应针对每种细胞系仔细优化接种密度和传代时机，以确保在分化开始时获得100%汇合的单层细胞。在这方面，以每孔明确的细胞数量进行接种，而非使用传代比例，可快速实现该方案的成功实施，且不受操作者经验的影响，因为它消除了通过肉眼估计汇合度的主观性。也可使用商业化配制的E8培养基，尽管本文详述的配方具有显著的成本优势。作为hESC认证基质的替代方案，已成功使用生长因子减少型、LDEV-Free的hESC认证基质。常规传代也可使用基于EDTA的细胞解离溶液完成。虽然在第8天后可在不添加血清的情况下将细胞维持在分化培养基#2中，但当添加2% FBS时可观察到更高的细胞存活率；但需注意，血清可能在体外引起心肌细胞肥大。in vitro。当需要用于临床应用时，有可能优化本方案，使其无需添加FBS，并可在无异源成分且完全明确的替代基质上进行，但这些条件尚未在本...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）4R00HL094708-03项目、威斯康星医学院研究事务委员会新教员奖、威斯康星医学院Kern基金会（启动资金）（RLG）；香港研究资助局主题研究计划T13-706/11（KRB）；U01 HL099776、CIRM TR3-05556、CIRM DR2A-05394及美国心脏协会资深研究者奖（JCW）；美国心脏协会博士后奖学金12POST12050254（PWB）资助。我们感谢威斯康星血液研究所流式细胞术核心实验室的Hope Campbell在数据收集以及稿件审阅方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>细胞培养
BD Matrigel，hESC鉴定合格基质BD 生物科学354277
Accutase 细胞解离液干细胞技术7920
不含钙、镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Life Technologies14190-136
二甲基亚砜（DMSO，Hybri-Max，经无菌过滤）Sigma AldrichD2650
碳酸氢钠Sigma Aldrich53817
柠檬酸Sigma AldrichC2404-100G
Y-27632 二盐酸盐选择性p160ROCK抑制剂R&D Systems1254
L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物Sigma AldrichA8960-5G
亚硒酸钠Sigma AldrichS5261-10G
转铁蛋白（Optiferrin） – 明确的、无动物成分的、重组人源Invitria777TRF029
成纤维细胞生长因子2（FGF2）R&D系统4144-TC-01M
转化生长因子β1（TGF-β1）在多种细胞过程中发挥关键作用，包括细胞增殖、分化、凋亡和细胞外基质的生成。该因子在组织修复、免疫调节和肿瘤发生中具有双重功能，既可抑制早期肿瘤发展，又可促进晚期肿瘤的侵袭与转移。TGF-β1通过与细胞表面的特异性受体结合，激活Smad依赖性和非Smad依赖性信号通路，从而调控靶基因的表达。其活性受到多种内源性和外源性因素的精细调控，包括其他细胞因子、微环境变化以及表观遗传修饰。在纤维化疾病中，TGF-β1的过度表达与胶原沉积和器官功能障碍密切相关。因此，针对TGF-β1信号通路的干预已成为多种疾病治疗策略的研究热点。关键词：转化生长因子β1，TGF-β1，信号通路，Smad蛋白，细胞增殖，细胞分化，纤维化，肿瘤进展β1)Peprotech100-21
含L-谷氨酰胺和15 mM HEPES的DMEM/F12培养基Life Technologies11330-032
胰岛素Sigma AldrichI9278-5ML
CHIR-99021 HClSellekchemS2924
IWR-1Sigma AldrichI0161
含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基Life Technologies11875-093
B-27 补充剂（不含胰岛素）Life TechnologiesA1895601
B-27 补充剂（含胰岛素）Life Technologies17504-044
胎牛血清Life Technologies10437
<强>流式细胞术试剂
磷酸盐缓冲液（10倍浓缩）Quality Biological Inc.119-069-151
不含钙的汉克平衡盐溶液2+ 和 Mg2+Life Technologies14175-095
BD CytofixBD 生物科学554655
BD Phosflow 透化缓冲液 IIIBD 生物科学558050
16% 多聚甲醛赛默飞世尔科技28906
甲醇Sigma Aldrich179957-4L
丙酮Mallenckrodt Chemicals 2440-16
Triton X-100AmrescoM236-10ML
山羊血清Life Technologies16210-064
0.4% 台盼蓝溶液Life Technologies15250-061
<强>材料
5 ml 圆底聚苯乙烯管（无盖）康宁352008用于流式细胞术的细胞制备
5 ml 圆底聚苯乙烯管（带 35 µM细胞滤筛带卡扣盖康宁352235用于流式细胞术的细胞制备
2 ml 橡胶吸头Fischer Scientific03-448-24
9" 未堵塞的硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管BioExpressP-2904-2
0.65 ml 微型离心管，带刻度，绿色GeneMateC-3259-G
1.5 ml 微量离心管，带刻度，红色GeneMateC-3260-R
TC20 自动细胞计数仪伯乐（BioRad）145-0102
TC20细胞计数板BioRad145-0011
6孔平底组织培养板康宁353046
20 ml 注射器BD Plastipak300613用于分装样品的滤膜除菌
无菌注射器滤器，0.2 µm 聚醚砜VWR28145-501用于分装样品的滤膜除菌
250 ml 过滤系统，0.22 µm 聚醚砜，无菌，低吸附康宁431096用于大量培养基的滤膜除菌 
500 ml 过滤系统，0.22 µm 聚醚砜，用于灭菌，低吸附康宁431097用于大量培养基的滤膜除菌
<强>抗体与同型对照
抗TNNI3（克隆：284 (19C7)）Abcamab19615一抗
抗TNNT2（克隆：1C11）赛默飞世尔科技MA1-16687一抗
抗MYL2（MLC2v，克隆号：330G5）Synaptic Systems310111一抗
抗MYL7（MLC2a，克隆：4E7）AbcamAB131661一抗
抗IRX4  BiossBS-9464R一抗
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1 Life TechnologiesA21121二抗
Alexa Fluor 647 山羊抗小鼠 IgG2aLife TechnologiesA21241二抗
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG2bLife TechnologiesA21141二抗
藻红蛋白（PE）山羊抗兔IgGR&D SystemsF0110二抗
小鼠 IgG1BD 生物科学557273同型对照
小鼠 IgG2aeBiosciences16-4724-81同型对照
兔IgG-PER&D SystemsIC105P同型对照
<强>用于qRT-PCR的TaqMan探针组
ACTBLife TechnologiesHs01060665
Brachyury TLife TechnologiesHs00610080
CASQ2Life TechnologiesHs00154286
IRX4Life TechnologiesHs01100809
ISL1Life TechnologiesHs00158126
MESP1Life TechnologiesHs01001283
MYH11（SMMHC）Life TechnologiesHs00224610
MYH6Life TechnologiesHs01101425
MYL2（MLC2v）Life TechnologiesHs00166405
MYL7（MLC2a）Life TechnologiesHs01085598
MYOGLife TechnologiesHs01072232
NKX2.5Life TechnologiesHs00231763
NPPALife TechnologiesHs01081097
POU5F1Life TechnologiesHs04260367
SOX17Life TechnologiesHS00751752
TNNI1Life TechnologiesHs00913333
TNNI2Life TechnologiesHs00268536
TNNI3Life TechnologiesHS00165957
TNNT2Life TechnologiesHs00165960

参考文献

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