简单的检测方法的社交回避的量化果蝇

摘要

在这里，我们提出了一个量化压力个体回避的协议。这种范式功能强大但用户友好，可用于评估基因和环境对黑腹果蝇一种社会互动的影响。

摘要

黑腹果蝇是研究社会互动不同方面的新兴模型。例如，由于在应激期间释放的气味称为果蝇应激气味剂 （dSO），苍蝇会避开以前被应激同种动物占据的区域。通过使用 T 迷宫装置，人们可以在非常实惠且稳健的分析中量化响应性果蝇对 dSO 的避免。这里介绍了获得强大性能所需的条件。苍蝇发射 dSO 需要一次压力经历，并且需要足够的发射器苍蝇来对 dSO 的存在产生强烈的回避反应。遗传背景，而不是它们的群体大小，强烈改变了反应性果蝇对 dSO 的回避。Canton-S 和 Elwood 在避免 dSO 方面表现出比 Oregon 和 Samarkand 菌株更高的性能。这种行为测定将允许识别这种社会行为的潜在机制，并评估基因和环境条件对 dSO 的排放和避免的影响。这种测定可以包含在用于识别突变体的社会缺陷或感兴趣的环境条件的简单诊断测试中。

引言

该方法的目标是很容易量化的果蝇简单的社会行为，独立于求偶和侵略一个新的方面。

社会互动是至关重要的内一个社会的正常发育和健康个体，以及一个社会群体作为一个整体的功能。这些相互作用的高复杂性就必须大的样本大小和一个系统，它允许为行为简化为社会行为的遗传和神经基础仍然知之甚少。 果蝇是可用于识别基因的有力的遗传模型，并社会互动的神经基础。事实上，D.果蝇有复杂的社会行为剧目和社会化的一些直接测量已经完成^1-7。不过，这些努力都集中在相对复杂的社会行为，如aggres西伯相互作用^3,6，求爱^3,8-12的各个方面，以及如何社会经验影响其他行为，如学习，或昼夜节律^13-17。此外，许多这些测定依赖于分析蝇基的复杂的交互模式，利用视频跟踪和计算机软件来分析得到的数据的丰度。这样的分析是非常宝贵的，并导致重要的新见解，如在组⁷苍蝇飞相互作用的动态。一个限制，但是，这些检测到社会大众的交通不便，和基本认同他人的机制的了解有限。换句话说，信号由一个单独的和其识别由另一个发射的基础仍然知之甚少^18。

相比之下，苍蝇也表现出一个简单的行为，社交回避，使个人从强调苍蝇发出的信号搬开：该D.黑素ogaster应力加臭剂或DSO ^19。在高通量测定法中，此行为可以量化为避免由其他蝇，或社交回避¹⁹射出的应力的信号。苍蝇被放置在一个T型迷宫装置和给予的选择，以避免含有DSO的小瓶。使用此测定，CO ₂被证明是在DSO的组分必要响应为CO ₂解剖¹⁹所述的神经电路，和一部分。

这里介绍的社交回避法类似概念在西摩·本泽的实验室开发的简单行为检测的启用几代科研人员解剖复杂的行为^20。社交回避的分析，可以进行低成本地使用T型迷宫测定中，允许社会行为的更广泛的研究。例如，使用这种测定法，我们最近证明了孤独症不同的遗传风险在社会B对比效果ehavior检测。突变的候选基因自闭症- neurobeachin ^21,22 -目前存在的缺陷无论是在社会空间^（23别处描述）和社交回避^24。异常的多巴胺信号也提出了自闭症在人类^25,26的病因中发挥作用。与此相反，以与neurobeachin所获得的结果，我们发现，社交回避表现是不受增加或多巴胺能细胞减少果蝇囊泡单胺转运（VMAT）的水平，尽管社会空间直接相关，这些水平VMAT ^27。与neurobeachin和VMAT得到的对比结果强调了识别各种形式的反社会行为，并且因此不同的底层神经电路系统调节响应于他人的可能性。

方案

1.设备和试剂创造了内部（见材料清单等）

1. 准备果蝇冷麻醉机进行飞行工作。
   1. 切的多孔聚乙烯片以覆盖一个小塑料盒（12.7厘米长，10.2厘米宽），一个移液管尖端盒子通常顶盖（12.7厘米长，10.2厘米宽，3.8厘米深）。
   2. 装满碎冰的箱子，盖上多孔聚乙烯片材。
2. 准备一个T-迷宫器具;适应先前在细节^28-31所描述的装置。
3. 准备描述³²苍蝇吸引。
4. 准备趋光反应装置取代苍蝇进出测试小瓶无压力：
   1. 使用逆流装置中，所描述的^29,33。

注：T迷宫也可用于其它目的，如所描述的^28。

5. 确保坎ogeneous照明条件：执行上覆盖有白色长椅罩长凳的实验中，并在一个白色板的前面。
   注：对于这些实验，所用的飞株果蝇野生类型：广-S，俄勒冈州和撒马尔罕航班从我们的实验室库存^34;埃尔伍德苍蝇被收集在2011年秋季在亨廷顿的埃尔伍德附近，长岛，纽约，美国。

2.准备蝇实验前

在进行实验前1-2天：

1. 保持苍蝇标准玉米面琼脂-糖蜜酵母培养基中于25℃在12小时光照/黑暗周期。
2. 收集响应苍蝇在冷麻醉前1-2天进行实验
   1. 从它们已经提出入50ml Falcon管，用漏斗将瓶子转移苍蝇。
   2. 将猎鹰管冰下一级苍蝇，成保温冰桶。
   3. 将冷麻醉设备用在-4℃，寒意碎冰。
   4. 等待5分钟，苍蝇进入寒意昏迷。
   5. 转移苍蝇到冷麻醉装置的多孔聚乙烯片材。
   6. 收集响应苍蝇在冰冷的麻醉设备。在室温下，体视显微镜，分离3-7日龄的男性从女性的苍蝇，在40组维持这些苍蝇。
3. 收集发射苍蝇1-2天前进行的实验。
   1. 轻轻地收集广-S混合性苍蝇从他们的瓶子，用口吸气，控制了他们的号码。
   2. 在组的60-100维持这些苍蝇，因为它们将是发射器。
   3. 根据需要，数据点准备发射的许多样本。
4. 允许恢复至少一晚集合反应和发射器后，以减少冷麻醉任何混杂效应和对行为的嘴吸集合。
5. 开放测试瓶的袋子，以允许陈旧的塑料气味的空气袋被新鲜空气取代，实验至少1天前。

2小时进行实验前：

6. 确保在将实验进行房间内的温度是大约23-25​​℃，甚至光，湿度30％以上。
7. 转移反应和发射果蝇到新鲜食品小瓶，以确保这些苍蝇不饿死。
8. 让果蝇适应环境2小时，在该实验将进行在板凳上。

3.执行的社交回避实验

1. 在Zeitgeber时间ZT5和ZT9之间下午进行每个实验在一天的同一时间，在范围3-4小时的。
2. 广场上的冲击垫的T-迷宫，并拧紧螺丝夹因此T他的电梯是稳定的。
3. 传送应答苍蝇到一个新的测试瓶。管理单元该小瓶含有响应苍蝇到T迷宫的顶部。
4. 倾斜的T-迷宫设备和挖掘它的冲击垫使果蝇倒在了电梯。
5. 移动电梯的顶部向下所以苍蝇是T型迷宫的顶部和底部部分之间的，但要注意，以保持上述的选择点的电梯 - 防止苍蝇逸出。
6. 获得小瓶DSO（见第5生成以前由苍蝇占领DSO-免费瓶）。
   1. 而响应苍蝇正在适应这个新的环境中，将发射器苍蝇在测试小瓶。
   2. 将一块棉花的收小瓶使果蝇不要逃避。
   3. 机械搅动此小瓶上的小型涡旋如下：涡流15秒，从涡流取出小瓶，持续5秒。重复3次，总共55秒。
   4. 雷姆奥雅纳发射苍蝇出新鲜小瓶 - 通过在食品小瓶转移 - 和快速地将本DSO填充小瓶插入T迷宫装置的两个侧面中的一个。
   5. 交替放置一边在每个新运行的DSO填补小瓶。
7. 放置一个新鲜的测试小瓶在T迷宫的另一侧。
8. 把电梯完全放下，让果蝇可以新鲜的测试瓶和小瓶测试与DSO之间选择，并开始计时。
9. 让我们，新鲜瓶和小瓶DSO之间的苍蝇选择，1分钟，除非另有说明。
10. 1分钟后，将电梯向上分开苍蝇在新鲜小瓶中，小瓶DSO，和那些被困在电梯。
11. 算在每个小瓶蝇的数目，并在电梯。
12. 重复此为每个基因型/条件。

4.分析了社交回避数据

1. 算在每个小瓶的每个热诺果蝇数YPE，并且将数据传输到电子表格。
2. 使用电子表格程序，通过减去苍蝇在DSO小瓶的数量从果蝇中DSO无小瓶的数量，再由蝇的总数除以计算出的性能指数（PI）为每个基因型。
3. 通过比较统计分析软件对结果的分析督察“的意思。
   1. 理想情况下，预备2-3内部重复每个实验，和3个独立的重复序列，在不同的日子进行的，用不同的瓶子或跨越^30。
   2. 使用高斯分布的统计测试，作为数据遵循正态分布。
   3. 当测试一个效果（ 即 ，密度- 图2），使用单向方差分析，具有检测后对多重比较（逐列），或简单t检验每个结果比较的对照。
   4. 当组实验中进行，同时测试条件和性别（空药瓶，强调了ð未强调苍蝇;和性别的影响- 图1），使用两因素ANOVA。

5.生成瓶由非重读苍蝇此前占用 - 执行取而代之3.5〜3.6

1. 使用的趋光性，制备由苍蝇，但没有强调占用小瓶，作为对照。
2. 转让苍蝇在测试瓶中，并卡入逆流装置，在相反的位置，新鲜的空药瓶。
3. 与远端瓶直接在一个15瓦荧光灯冷白光前水平奠定了设备，并盖上黑布。
4. 让苍蝇在新鲜小瓶轻轻移动。这可能需要几分钟的时间。一旦大多数苍蝇的行走朝向远端小瓶的光，启动计时器，持续1分钟。
5. 轻轻取出黑色布，开关的光的位置，恢复与黑色布，并且允许苍蝇离开测试小瓶中。
6. 在那个时候，我nitiate选择实验在3.2至3.5。跳过3.6和3.7。
7. 移动装置的滑动件，该腾空从另一侧的测试小瓶苍蝇分离。
8. 使用在T型迷宫的测试腾空小瓶马上供选择的实验，如3.7。

结果

社交回避试验是一个强大的测试定量果蝇识别一个应力信号（DSO）被其他蝇发射的能力，并因此评估社会互动的一个方面。使用已知作为T迷宫，其具有两个不同的选项之间进行选择呈现苍蝇各种行为测定常用的装置进行测定-左或右^19,28-31。在这种情况下，效率在该苍蝇避免DSO是通过计算和比较它们的性能指数（PI）的定量。零P​​I表示50-50分布或没有回避，而100 PI表明，所有的苍蝇避免DSO。和-100 PI将表明，所有的苍蝇去了DSO瓶内。

苍蝇都带有含有DSO的小瓶通过机械搅拌蝇射出，和一个新鲜（DSO无）小瓶中。代表性的成果在这里展示强调strength此测定的，以及一些必要以获得最好的结果已知的条件。

DSO的回避是不特定性，而是取决于苍蝇被强调。应答苍蝇的性别对他们避免DSO的（ 图1）没有任何影响。然而，这是不够的苍蝇都占据测试小瓶引发回避该小瓶，苍蝇必须已经强调-在这种情况下机械搅拌（ 图1）。如果没有苍蝇占...

讨论

本协议描述为社会避免检测的详细过程。广-S只会避免在飞行以前一直强调机械小瓶和应答者的性别和数量不影响社交回避的性能。然而，反应的遗传背景有重要的影响。

以下是几个关键的步骤成功完成这个实验：1）实验前总是转移苍蝇2小时，并确保不影响他们的环境; 2）在一天的同一时间进行的实验总是理想地之间Zeitgeber时间光的发病后ZT5（小时）和ZT9减少的变化表现挂钩昼夜节律和在运动和活动水平从而可能变化; 3）进行实验时，记下温度和湿度条件;周围23-25​​℃，湿度的温度下的30％以上是最好的; 4）确保不要到Disturb期间苍蝇决定时间T型迷宫装置; 5）一定要空出来的新鲜瓶使用前至少24小时;和6）在实验过程中始终改变测试小瓶的位置，在T迷宫装置，以避免优先于T迷宫的一侧是重要的。虽然额外的测试需要做，以确认这一点，凭经验似乎DSO逸出的“压力”的小瓶，在不到5分钟。相比之下，似乎苍蝇都能够被强调后以发射DSO达1小时。

有几方面的考虑，必须考虑到在该协议。苍蝇和社交回避的年龄之间的相关性目前还不清楚。因此，建议在25℃下...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体视变焦显微镜	尼康	SMZ-645	任何其他标准苍蝇处理范围都可以工作
小型油漆刷			用于推蝇
多孔聚乙烯，12" x 12" 片	状 Flystuff - Genesee	46-100	http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100 用于冷麻醉盒的多孔塑料片
迷你闹钟定时器/秒表
Sharpie 笔
胶带
迷你涡流	Fisher	14-955-151	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail 对于苍蝇的机械搅动 - 任何涡流都可以工作。
康宁生命科学 DL 编号：352017， Falcon 试管;圆底;一次性;无盖，14 ml;17 x 100 毫米	Fisher	14-959-8	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0 这些在内部制造的 T 型迷宫和逆流装置（见正文）
			，以在实验后关闭小瓶。
三折板和白色工作台盖			，提供白色背景和均匀的光线。
白色长凳盖
敲击垫			任何鼠标垫都可以。
大黑布			覆盖对趋光性响应的逆流装置。
冷白光	家得宝	1000516563	http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423 任何带有 13-15 W 荧光灯泡冷白色的类似线性灯都可以工作