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方法文章

社会回避定量检测的简易实验方法 黑腹果蝇

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DOI：

10.3791/52011

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2014年12月13日

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1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Biology, Western Ontario University

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于量化受胁迫个体回避行为的实验方案。该范式具有强大功能且操作简便，可用于评估基因和环境对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）某一类社会性互动行为的影响。

摘要

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是一种新兴的模式生物，用于研究社会互动的多个方面。例如，果蝇会回避先前被处于应激状态的同种个体占据过的区域，这是由于应激过程中释放了一种被称为果蝇应激气味物（Drosophila stress odorant, dSO）的挥发性物质所致。利用T型迷宫装置，可以以一种经济且可靠的方法定量检测响应果蝇对dSO的回避行为。本文介绍了获得显著行为反应所需的关键实验条件：果蝇必须经历应激刺激才能释放dSO，同时需要足够数量的释放果蝇，以引发响应果蝇对dSO存在的强烈回避反应。果蝇的遗传背景会显著影响其对dSO的回避行为，而群体规模则无明显影响。其中，Canton-S和Elwood品系在回避dSO方面表现优于Oregon和Samarkand品系。该行为学实验将有助于揭示这一社会行为背后的机制，并可用于评估基因和环境因素对dSO释放与回避行为的影响。此类实验还可纳入一系列简单的诊断测试中，用于识别突变体或特定环境条件下存在的社会行为缺陷。

引言

该方法的目的是独立于求偶和攻击行为，轻松量化黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中一种新的简单社会行为特征。

社会互动对于社会中个体的正常发育和健康，以及整个社会群体的功能都至关重要。由于这些互动具有高度复杂性，因此需要大样本量以及能够简化行为分析的系统，因为目前对社会行为的遗传和神经基础仍知之甚少。Drosophila melanogaster 是一种强大的遗传学模型，可用于揭示社会互动的遗传和神经基础。事实上，D. melanogaster 具有一系列复杂的社交行为，且已有研究对其社交行为进行了一些直接测量1-7。然而，大多数研究主要集中在相对复杂的社交行为上，例如攻击性互动3,6、求偶行为的各个方面3,8-12，以及社会经验如何影响其他行为（如学习或昼夜节律）13-17。此外，许多此类实验依赖于对果蝇群体复杂互动模式的分析，通过视频追踪和计算机软件处理由此产生的大量数据。这类分析极为宝贵，能够带来重要的新见解，例如群体中果蝇之间互动的动态特征7。然而，一个局限在于这些实验方法难以被广泛推广，且人们对个体间相互识别的潜在机制了解有限。换句话说，个体发出信号并被另一个体识别的基础机制至今仍不清楚18。

相比之下，果蝇也表现出一种简单的行为——社会性回避，即个体远离受胁迫果蝇释放的信号：黑腹果蝇应激气味（D. melanogaster Stress Odorant，简称 dSO19）。在高通量检测中，该行为可被量化为对其他果蝇释放的应激信号的回避，即社会性回避行为19。实验中将果蝇置于T型迷宫装置内，使其选择是否回避含有dSO的小瓶。利用该检测方法，已证实CO2是dSO的组成成分之一，并解析了响应CO2所必需的部分神经环路19。

此处介绍的社会回避实验在概念上类似于西摩·本泽尔（Seymour Benzer）实验室开发的简单行为学实验，后者使数代研究人员能够解析复杂行为20使用T型迷宫实验可以经济高效地进行社交回避分析，从而促进对社交行为的广泛研究。例如，我们近期利用该实验方法证明，自闭症的不同遗传风险因素在社交行为实验中具有相反的作用效果。针对一个自闭症候选基因的突变体—— neurobeachin21,22 — 在社会空间方面存在缺陷（在其他地方已有描述）23以及社交回避24异常的多巴胺能信号传导也被认为在人类自闭症的病因中起一定作用25,26与神经沙滩蛋白（neurobeachin）实验结果相反，我们发现社交回避行为表现不受该蛋白水平升高或降低的影响 果蝇囊泡单胺转运蛋白 (VMAT) 在多巴胺能细胞中，尽管社交空间与这些水平直接相关 VMAT27. 使用不同方法获得的对比结果 neurobeachin 和 VMAT 强调了识别各种形式反社会行为的可能性，从而揭示调节对他人反应的不同潜在神经回路。

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方案

1. 实验室自制设备与试剂（其他材料参见材料清单）

  1. 准备果蝇冷麻醉装置以进行果蝇操作。
    1. 裁剪一块多孔聚乙烯膜，用于覆盖一个小型塑料盒（长12.7 cm，宽10.2 cm），通常使用移液器吸头盒的顶盖（长12.7 cm，宽10.2 cm，深3.8 cm）。
    2. 将塑料盒内装满碎冰，盖上多孔聚乙烯膜。 
  2. 准备T型迷宫装置；参照先前详细描述的装置进行改装28-31。
  3. 按文献32所述方法准备果蝇吸虫器。
  4. 准备光趋性反应装置，以便在无应激条件下将果蝇转移进出测试小瓶：
    1. 使用反向电流装置，具体方法如文献29,33所述。

注意：T型迷宫也可用于其他用途，如文献28所述。

  1. 确保光照条件均匀：在覆盖白色实验台垫的实验台上进行实验，并面向一块白色板进行。
    注：本实验所用果蝇品系为黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）野生型：Canton-S、Oregon 和 Samarkand 果蝇，来自本实验室保种品系34；Elwood 果蝇于 2011 年秋季采集自美国纽约州长岛亨廷顿地区的 Elwood 社区。

2. 实验前果蝇的准备

进行实验前1-2天： 

  1. 将果蝇饲养在标准的玉米粉-琼脂-糖蜜-酵母培养基上，25 °C 条件下，12 小时光照/12 小时黑暗循环。
  2. 在进行实验前 1–2 天，用低温麻醉法收集应答果蝇
    1. 使用漏斗将果蝇从培养瓶转移至 50 ml Falcon 管中。
    2. 将装有果蝇的 Falcon 管置于冰面，放入保温冰桶中。
    3. 将装有碎冰的低温麻醉装置置于 -4 °C 环境中预冷。
    4. 等待 5 分钟，使果蝇进入冷昏迷状态。
    5. 将果蝇转移至低温麻醉装置的多孔聚乙烯板上。
    6. 在低温麻醉装置上收集应答果蝇。在室温下，利用体视显微镜将 3–7 日龄的雄性和雌性果蝇分开，并以每组 40 只的规模维持培养。
  3. 在进行实验前 1–2 天收集释放果蝇。
    1. 使用口吸管从培养瓶中轻柔地收集 Canton-S 混合性别的果蝇，并控制其数量。
    2. 将这些果蝇以每组 60–100 只的规模维持培养，作为释放果蝇。
    3. 根据所需数据点的数量，准备相应数量的释放果蝇样本。
  4. 在收集应答果蝇和释放果蝇后，至少给予一个晚上的恢复时间，以尽量减少低温麻醉和口吸管收集对行为产生的干扰效应。
  5. 在实验前至少 1 天打开测试小瓶的包装袋，使袋内陈旧的、带有塑料气味的空气被新鲜空气取代。

实验开始前2小时：

  1. 确保实验进行的房间温度保持在 23-25 °C，光照均匀，湿度高于 30%。
  2. 将反应者和信号发出者果蝇转移至装有新鲜食物的离心管中，以确保这些果蝇未处于饥饿状态。
  3. 将果蝇置于实验台面上适应环境 2 小时，以适应实验环境。

3. 进行社交回避实验

  1. 每天在同一时间段进行实验，建议在授时因子时间ZT5至ZT9之间的下午3–4小时内完成。
  2. 将T型迷宫放置在敲击垫上，并拧紧螺丝夹，确保升降装置稳定。
  3. 将应答果蝇转移至新的测试小瓶中，并将装有应答果蝇的小瓶快速固定在T型迷宫的上部。
  4. 倾斜T型迷宫装置，并在敲击垫上轻敲，使果蝇落入升降装置中。
  5. 将升降装置的上部向下移动，使果蝇位于T型迷宫的上段与下段之间，但需注意保持升降装置高于选择点，以防止果蝇逃逸。
  6. 准备装有dSO的小瓶（参见第5节，制备此前被果蝇占据过的无dSO小瓶）。
    1. 在应答果蝇适应新环境的同时，将释放果蝇放入一个测试小瓶中。
    2. 用一小团棉花封住小瓶口，防止果蝇逃出。
    3. 将该小瓶在迷你涡旋振荡器上进行机械震荡，具体操作如下：震荡15秒，取出静置5秒，重复3次，总计55秒。
    4. 将释放果蝇从小瓶中移出（可转移至食物小瓶中），并迅速将装有dSO的小瓶放入T型迷宫装置的任意一侧。
    5. 每次新实验运行时，交替更换装有dSO小瓶的放置侧。
  7. 在T型迷宫的另一侧放置一个装有新鲜介质的测试小瓶。
  8. 将升降装置完全降下，使果蝇可在新鲜小瓶与含dSO小瓶之间进行选择，同时启动计时器。
  9. 让果蝇在新鲜小瓶与含dSO小瓶之间自由选择1分钟，除非另有说明。
  10. 1分钟后，将升降装置升起，将果蝇分别隔离至新鲜小瓶、dSO小瓶以及滞留在升降装置中的果蝇。
  11. 统计每个小瓶及升降装置中果蝇的数量。
  12. 对每种基因型或实验条件重复上述步骤。

4. 分析社交回避数据

  1. 统计每种基因型每个试管中的果蝇数量，并将数据转录至电子表格中。
  2. 使用电子表格程序，通过从无dSO试管中的果蝇数量减去含dSO试管中的果蝇数量，再除以果蝇总数，计算每种基因型的性能指数（Performance Index, PI）。
  3. 使用统计分析软件对PI的均值进行比较，以分析实验结果。
    1. 理想情况下，每次实验应设置2-3个内部重复，并在不同日期进行3次独立重复实验，使用不同的瓶子或杂交组合30。
    2. 采用正态分布统计检验方法，因为数据符合正态分布。
    3. 当检测单一效应时（即密度效应——图2），使用单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行多重比较的事后检验（逐列比较），或使用简单的t检验将每个结果与对照组进行比较。
    4. 当进行分组实验时，应使用双因素方差分析（two-way ANOVA）同时检验两种条件和性别效应（空试管、应激与非应激果蝇；以及性别效应——图1）。

5. 制备先前未受胁迫果蝇使用过的样品管——替代步骤 3.5 至 3.6

  1. 利用趋光性准备未受应激的果蝇管作为对照。
  2. 将果蝇转移至测试管中，并将其插入计数逆流装置，对侧位置放置新的空管。
  3. 将装置水平放置，使远端管正对一盏15 W荧光冷白光灯，并用黑色布料覆盖。
  4. 让果蝇缓慢移动至新管中，此过程可能需要数分钟。当大部分果蝇朝远端管的光源方向行走时，开始计时1分钟。
  5. 轻轻移开黑色布料，调换光源位置，再用黑色布料重新覆盖，并允许果蝇离开测试管。
  6. 此时，按照步骤3.2至3.5启动选择实验，跳过3.6和3.7。
  7. 移动装置的滑块，将已离开测试管的果蝇与另一侧果蝇分离开。
  8. 立即将已空出的测试管用于T型迷宫选择实验，操作同3.7。

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结果

社会回避实验是一种可靠的检测方法，用于量化黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）识别其他果蝇释放的应激信号（dSO）的能力，从而评估其社会互动的一个方面。该实验使用一种常用于多种行为学检测的装置，称为T型迷宫，使果蝇在两个不同选项（左侧或右侧）之间进行选择19,28-31。在此实验中，通过计算并比较果蝇的表现指数（PI），来量化其回避dSO的效率。PI值为0表示果蝇在两侧的分布为50-50，即无回避行为；PI值为100表示所有果蝇均避开了dSO；而PI值为-100则表示所有果蝇均进入了含有dSO的样品管中。

将装有经机械刺激的果蝇释放的dSO的试剂瓶和一个新鲜（无dSO）的试剂瓶提供给果蝇。此处展示的代表性结果强调了该检测方法的有效性，以及获得最佳结果所需的一些已知条件。

对dSO的回避行为并非具有性别特异性，而是取决于果蝇是否处于应激状态。响应果蝇的性别对其回避dSO的行为没有影响（图1）。然而，仅让果蝇进入测试小瓶并不足以引发对该...

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讨论

本方案详细描述了社会回避实验的操作步骤。Canton-S 果蝇仅会回避先前果蝇受到过机械应激的培养管，且响应果蝇的性别和数量不会影响其社会回避行为表现。然而，响应果蝇的遗传背景对此行为具有显著影响。

成功进行本实验的几个关键步骤如下：1）始终在实验前2小时转移果蝇，并确保不干扰其环境；2）每天在相同时间进行实验，理想时间为光照开始后的第5个时钟时间（ZT5）至第9个时钟时间（ZT9）之间，以减少与昼夜节律相关的性能变异，从而降低运动能力和活动水平的可能波动；3）记录实验时的温度和湿度条件；最佳条件为温度约23–25 °C、湿度高于30%；4）在果蝇决策期间，确保不干扰T型迷宫装置；5）确保新使用的培养管至少提前24小时通风；6）实验过程中，必须始终轮换T型迷宫装置中测试管的位置，以避免果蝇对迷宫某一侧产生偏好。尽管尚需进一步实验验证，但经验表明，去翅果蝇（dSO）在不到5分钟内即可逃离“应激”管；相比之下，果蝇在受到应激后似乎可在长达1小时的时间内释放dSO。

在该实验方案中，有几个因素必须加以考虑。果蝇的年龄与社会回避行为之...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢 Rachelle Kanippayoor 在鉴定新野生型菌株属于 melanogaster 物种方面提供的帮助。R.W.F、O.F. 和 A.F.S. 负责研究设计；R.W.F.、M.N. 和 O.F. 进行了实验；R.W.F.、M.N.、O.F. 和 A.F.S. 分析了数据；R.W.F.、I.S.M. 和 A.F.S. 撰写了论文。

本工作由PSC-CUNY研究奖资助，该奖项由专业职员大会（The Professional Staff Congress）和纽约城市大学（The City University of New York）共同资助，授予A.F.S.；由西方大学（Western University）向A.F.S.和I.S.M.提供的内部资金资助；以及由美国西班牙裔健康联盟（National Alliance for Hispanic Health）的联盟/默克（Alliance/Merck）Ciencia（科学）西班牙裔学者项目提供的培训支持，和耶鲁大学艺术与科学研究生院（Yale Graduate School of Arts and Sciences）向R.W.F.提供的大学奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
体视变倍显微镜 Nikon  SMZ-645任何其他用于果蝇操作的标准显微镜均可使用
小型画笔 用于推动果蝇
多孔聚乙烯板，12" × 12"Flystuff - Genesee46-100http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100
用于低温麻醉盒的多孔塑料板
迷你闹钟计时器/秒表
Sharpie 记号笔
胶带
微型涡旋振荡器Fisher14-955-151 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail
用于果蝇的机械振荡——任何涡旋振荡器均可使用
Corning Life Sciences 货号：352017，Falcon 试管；圆底；一次性；无盖；14 ml；17 × 100 mmFisher14-959-8   http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0
可插入自制的T型迷宫和逆流装置中（见正文）
棉球实验结束后封闭试管用
三折板和白色实验台覆盖物提供白色背景和均匀光照
白色实验台覆盖物
击打垫任何鼠标垫均可使用
大块黑色布料在趋光性反应实验中用于覆盖逆流装置
冷白色光源 Home Depot1000516563http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423
任何类似功率为13–15 W的冷白色荧光直管灯均可使用

参考文献

  1. Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. TrackFly: virtual reality for a behavioral system analysis in free-flying fruit flies. J Neurosci Methods. 171, 110-117 (2008).
  2. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. 24, 1096(2009).
  3. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6, 297-303 (2009).
  4. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6, 451-457 (2009).
  5. Simon, J. C., Dickinson, M. H. A new chamber for studying the behavior of Drosophila. PLoS One. 5, 8793(2010).
  6. Wang, L., Dankert, H., Perona, P., Anderson, D. J. Inaugural Article: A common genetic target for environmental and heritable influences on aggressiveness. in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5657-5663 (2008).
  7. Schneider, J., Dickinson, M. H., Levine, J. D. Social structures depend on innate determinants and chemosensory processing in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2, 17174-17179 (2012).
  8. Miyamoto, T., Amrein, H. Suppression of male courtship by a Drosophila pheromone receptor. Nat Neurosci. 11, 874-876 (2008).
  9. Villella, A., Hall, J. C., Jeffrey, C. H. Chapter 3 Neurogenetics of Courtship and Mating in Drosophila. Advances in Genetics. 62, 67-184 (2008).
  10. Ejima, A., Griffith, L. C. Courtship Initiation Is Stimulated by Acoustic Signals in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 3, 3246(2008).
  11. Mery, F., et al. Public Versus Personal Information for Mate Copying in an Invertebrate. Current Biology. 19, 730-734 (2009).
  12. Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
  13. Billeter, J. -C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
  14. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr Biol. 18, 1373-1383 (2008).
  15. Kent, C., Azanchi, R., Smith, B., Formosa, A., Levine, J. D. Social context influences chemical communication in D. melanogaster males. Curr Biol. 18, 1384-1389 (2008).
  16. Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
  17. Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking Experience Affects Sleep Need in Drosophila. Science. 313, 1775-1781 (2006).
  18. Billeter, J. -C., Levine, J. D. Who is he and what is he to you? Recognition in Drosophila melanogaster. Curr. Opin. Neurobiol. 23, 17-23 (2013).
  19. Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
  20. Bonini, N. A Tribute to Seymour Benzer 1921-2007. 180, 1265-1273 (2008).
  21. Castermans, D., et al. The neurobeachin gene is disrupted by a translocation in a patient with idiopathic autism. Journal of Medical Genetics. 40, 352-356 (2003).
  22. Medrihan, L., et al. Neurobeachin, a protein implicated in membrane protein traffic and autism, is required for the formation and functioning of central synapses. J Physiol. 587, 5095-5106 (2009).
  23. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila: measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11, 243-252 (2012).
  24. Venkatesh, T., et al. Cold Spring Harbor Meeting: From Molecules to Circuit Behavior. , Cold Spring Harbor Laboratories. Cold Spring Harbor, NY. (2013).
  25. Hamilton, P. J., et al. De novo mutation in the dopamine transporter gene associates dopamine dysfunction with autism spectrum disorder. Mol Psychiatry. 18, 1315-1323 (2013).
  26. Gadow, K. D., et al. Association of dopamine gene variants, emotion dysregulation and ADHD in autism spectrum disorder. Research in Developmental Disabilities. 35, 1658-1665 (2014).
  27. Fernandez, R. W., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Simon, A. F. 54th Annual Drosophila Research Conference, , (2014).
  28. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J Vis Exp. , 2504(2011).
  29. Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: A Practical Approach. Roberts, D. B. 1, IRL. New York, NY. 265-317 (1998).
  30. Tully, T., Quinn, W. G. Classical-conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol [A]. 157, 263-277 (1985).
  31. Krashes, M. J., Waddell, S. Drosophila Aversive Olfactory Conditioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (2011).
  32. Ejima, A., Griffith, L. C. Ch. 30. Drosophila Neurobiology, A Laboratory Manual. Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. 475-481 (2010).
  33. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
  34. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299, 1407-1410 (2003).
  35. Vaux, D. L. Research methods: Know when your numbers are significant. Nature. 492, 180-181 (2012).
  36. Stowers, L., Logan, D. W. Sexual dimorphism in olfactory signaling. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 770-775 (2010).
  37. Simon, A. F., Liang, D. T., Krantz, D. E. Differential decline in behavioral performance of Drosophila melanogaster with age. Mechanisms of Ageing and Development. , 127-647 (2006).

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