核酸，蛋白质与甲基转移和辅酶类似物序列特异性标签

Summary

DNA和蛋白质序列特异性标记的亲和力，或使用DNA或蛋白质的甲基和合成的辅助因子的类似物的荧光报告基团。取决于酶，氮丙啶或双活化的辅助因子类似物的辅因子特异性的用于一个或两个步骤的标签。

Abstract

S -Adenosyl -1-甲硫氨酸（的AdoMet或SAM）依赖性甲基转移（转移酶）催化激活甲基来自的AdoMet中的DNA，RNA，蛋白质和小生物分子转移到特定的位置。这种自然甲基化反应可扩展到各种各样的使用合成的辅助因子的类似物的烷基化反应。更换的AdoMet的反应性锍中心与氮丙啶环的导致辅因子可加上由各种DNA MTases的DNA。这些氮丙啶辅助因子可配记者团在腺嘌呤部分的不同位置，并用于ethyltransferase- EP3受体激动剂诱导DNA（笑DNA） 的 L-阿贝尔ING S equence 专用的M。作为一个典型的例子，我们给出一个协议的pBR322的质粒DNA的生物素化在5'- ATCG T-3'序列与该DNA转移酶M.BseCI和氮丙啶辅因子6BAz在一个步骤。延长活化甲基与不饱和烷基结果另一类的AdoMet类似物的是用以米 ethyltransferase定向T的一个ctivatedģroups（MTAG）转让（BOT）的。由于延长侧链由锍中心和不饱和键激活时，这些辅因子被称为双活化的AdoMet类似物。这些类似物不仅用作辅因子用于DNA MTases，如氮丙啶辅因子，而且还用于RNA，蛋白质和小分子MTases。它们通常用于转移酶底物与在第二化学步骤标记报告基团独特的官能团的酶促修饰。这被例示在一个协议组蛋白H3蛋白质的荧光标记。一个小炔基是从辅因子类似物SeAdoYn由组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）转移酶SET7 / 9随后的单击标签转移到蛋白质炔基化组蛋白H3与TAMRA叠氮化物。与辅酶类似物转移酶介导的标签是一个有利的技术，许多令人兴奋的应用，包括识别和功能研究转移酶底物，以及DNA基因分型和甲基化检测。

Introduction

核酸^1,2和蛋白质^3,4特定的标签是功能性表征，医学诊断和（纳米）生物技术重大利益的。在这里，我们对这些生物聚合物是基于 S -adenosyl -1-甲硫氨酸（的AdoMet或SAM）依赖性甲基转移（MTases）提出了一种酶标记方法。这类酶（EC 2.1.1。）的目标的核酸和蛋白质的特定残基中的各个位置上的亲核（氮，氧，硫和碳原子）和自然传输的辅助因子的AdoMet（ 图^1A）5的活化的甲基。此外，MTases可以利用合成的辅助因子的类似物与亲和标记，荧光团或其它标签（ 图^1B）6特异性标记。已经开发了两个班的AdoMet类似物：氮丙啶辅助因子局长 equence 专用的M ethyltransferase- 我 L阿贝尔荷兰国际集团 （笑^）7和双启动的AdoMet类似物对M ethyltransferase定向T的一个 ctivated 摹 roups转让^{（BOT）（MTAG）8。}

Protocol

1.一般说明

1. 商店氮丙啶辅因子6BAz（在DMSO中）和蛋白质转移酶SET7 / 9在-80℃，所有其他试剂包括双活化的辅助因子SeAdoYn和DNA转移酶M.BseCI（在50％甘油）在-20℃下。
2. 使用消光系数_{ε269nm（6BAz）=16000}厘米^-1 M ^-1和_ε260nm处 （SeAdoYn）=15400厘米^-1 M ^-1，在去离子水通过紫外/可见光谱确定6BAz和SeAdoYn的浓度。通过Bradford测定法在280nm确定MTases的浓度，或者，如果消光系数是可用的， 通过直接吸收。
3. 尽量避免产生气泡密集移液器或涡流，以防止酶失去活性。相反，轻轻吹打上下混合。
4. 当从储备溶液的DMSO加入氮丙啶辅因子确保测定中的终DMSO浓度为少超过5％。总是包含在试验缓冲液，以防止非特异性反应用DNA的10mM镁离子。
5. 当从酸性储备溶液添加双活化的辅助因子使用小体积（高度浓缩的储备溶液），以避免pH值的变化，并确保所述测定溶液的pH值不显著变化。避免硫醇， 例如 ，β巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），在测定缓冲液中，因为它们可以用通过所需要的铜离子络合点击干扰反应。

DNA 通过

Results

DNA通过氮丙啶辅因子一步法标签

本实施例中进行反应用DNA转移酶M.BseCI，该修改的双链5'- ATCG T-3'序列中的第二个腺嘌呤残基和具有一个识别位点上的pBR322的质粒（ 图4A）。为了测试质粒标签，pBR322中是用限制性内切酶（REase）R.TaqI（5'-TCGA-3'）的挑战。 R.TaqI具有七个位点上的pBR322，其中之一包括在M.BseCI站点。如果出现标签，所述M.BseCI站点将被保护，以防止裂解，并与683个碱基对（bp）的一个新的片段将形成，而其他两个片段会消失（315和368碱基对）。当然，当与其它DNA MTases不同REases与相应的识别序列分析DNA标记应该采用。

在图4B中的琼脂糖凝胶清楚地显示了显示ANCE与683碱基对（泳道3）一种新的片段。这表明M.BseCI部位标记发生。仅在测定（泳道3）示出了该片段。的“辅因子”控制（泳道5），以及在“酶”的.......

Discussion

DNA与DNA MTases和氮丙啶辅助因子（笑DNA）中的一个步骤的标签是一个强大的方法，但计划实验时，有些方面应该考虑。

氮丙啶辅：用于DNA标记的6BAz浓度M.BseCI为60微米。当使用其它DNA MTases辅因子浓度应被优化， 例如 ，浓度低至20μM的已使用用该DNA转移酶M.TaqI ^19。低6BAz浓度具有四倍过量的链霉（结合位点相对于生物素在测定的总量）的能够孵育REase后直接加入不与分析由EMSA干扰的优点。否则的生物素化的DNA应提纯以除去多余的辅助因子和避免在琼脂糖凝胶电泳该DNA的拖尾现象。当现货解决方案DMSO添加氮丙啶辅助因子，确保在日终DMSO浓度Ë测定是小于5％。太多DMSO可灭活酶。始终将氮丙啶辅助因子在-80℃，以避免退化。

脱氧核糖核酸转移酶：氮丙啶辅因子与DNA的酶促耦合可导致强烈的产物抑制剂和该DNA MTases具有化学计量的量使用。因此，应始终使用超过1当量DNA转移酶的。大多数DNA MTa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6BAz			根据 Weinhold 等人于 2012 年 3 月 6 日发布的专利号 US 8,129,106 合成。
&β;-巯基乙醇	Serva	28625
乙酸	Fisher Scientific	10304980
丙烯酰胺/双溶液，37.5：1	Serva	10688
超纯琼脂糖	Invitrogen	16500100
过硫酸铵 （APS）	Serva	13375
Bis-Tris	Gerbu	1304
硼酸	Gerbu	1115
溴酚蓝钠盐	Serva	15375
硫酸铜 （II）	Aldrich	C1297
氯仿	Fisher Scientific	10020090
考马斯亮蓝	Serva	17525
EDTA 二钠盐	Gerbu	1034
乙醇	默克	100983
凝胶红色（10,000x 水中）	生物钕	41003
甘油 （99.5%）	Gerbu	2006
FastRuler 低分子量 DNA 分子量标准	Thermo Scientific	SM1103
组蛋白 H3			从 Philipp Voigt 博士和 Danny Reinberg 教授处获得的表达质粒;根据 T. J. Richmond 等人，J. Mol. Biol. 1997， 272， 301-311 进行表达和分离。
M.BseCI			表达质粒;根据 Kapetaniou 等人，Acta Cryst. 2006， F63， 12-14 进行表达和分离。
甲醇	Fisher Scientific	10675112
氯化镁  六水合物	J.T. Baker	4003
MOPS	Gerbu	1081
氯化钠	Gerbu	1112
pH 试纸（中和）	默克	1,095,330,001
pBR322	Thermo Scientific	SD0041
R.TaqI （10 u/µl）	Thermo Scientific	ER0671
SeAdoYn			根据 Willnow 等人合成，ChemBioChem 2012， 13， 1167-1173。
Set7/9			表达质粒从 Danny Reinberg 教授处获得，根据 D. Reinberg 等人进行表达和分离，Genes Dev.2002， 16， 479-489。
链霉亲和素	Gerbu	3058
（+）-L-抗坏血酸钠	Sigma Life Science	A7631
SDS 颗粒	Gerbu	1833
磷酸氢二钠	默克	106,586
TAMRA 叠氮化物			参考文献 30 合成：Willnow 等人，ChemBioChem 2012,13,1167-1173。
TaqI 缓冲液 （10x）	Thermo Scientific	B28
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺 （TEMED）	Acros Organics	42058
Tris-HCl	Gerbu	1028
Tris-X（TRIS-碱）	Gerbu	1018
Tris（3-羟丙基三唑基甲基）胺 （THPTA）	Sigma-Aldrich	762342