使用甲基转移酶和辅因子类似物对核酸和蛋白质进行序列特异性标记

摘要

利用DNA或蛋白质甲基转移酶及合成辅因子类似物，可对DNA和蛋白质进行序列特异性的亲和性或荧光报告基团标记。根据酶对辅因子的特异性，可采用氮丙啶或双活化辅因子类似物进行一步或两步标记。

摘要

S-腺苷-l-甲硫氨酸（AdoMet 或 SAM）依赖性甲基转移酶（MTase）可催化将 AdoMet 中的活化甲基转移至 DNA、RNA、蛋白质及小分子生物分子的特定位点。利用合成辅因子类似物，这一天然甲基化反应可拓展至多种烷基化反应。将 AdoMet 中反应性锍中心替换为氮丙啶环，可获得能被多种 DNA 甲基转移酶（DNA MTase）与 DNA 共价偶联的辅因子。这些氮丙啶辅因子可在腺嘌呤部分的不同位置引入报告基团，并用于 S序列特异性 M乙基转移酶-我诱导的 Labeling DNA（SMILing DNA）。作为一个典型示例，我们提供了在5’-ATCG位点对pBR322质粒DNA进行生物素标记的实验方案A一步法利用DNA甲基转移酶M.BseCI和氮丙啶辅因子6BAz对T-3’序列进行修饰。通过不饱和烷基取代活化甲基可得到另一类AdoMet类似物，用于 m乙基转移酶导向的 T转移 A激活的 G基团（mTAG）。由于延长的侧链被锍中心和不饱和键活化，这些辅因子被称为双活化AdoMet类似物。这些类似物不仅可作为DNA甲基转移酶（MTase）的辅因子（如同氮丙啶类辅因子），还可用于RNA、蛋白质及小分子甲基转移酶。它们通常用于通过独特的功能基团对MTase底物进行酶促修饰，随后在第二步化学反应中用报告基团进行标记。本文以组蛋白H3蛋白的荧光标记方案为例进行说明：首先，组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）甲基转移酶Set7/9将辅因子类似物SeAdoYn中的丙炔基团转移至组蛋白H3上，随后通过点击化学反应将炔基化的组蛋白H3与TAMRA叠氮化物进行标记。利用辅因子类似物实现的甲基转移酶介导标记技术为多种前沿应用提供了支持，包括MTase底物的鉴定与功能研究，以及DNA分型和甲基化检测。

引言

核酸的特异性标记^1,2 和蛋白质^3,4 对于功能表征、医学诊断以及（纳米）生物技术具有重要意义。本文介绍一种基于酶促反应的生物大分子标记方法 S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（AdoMet 或 SAM）依赖性甲基转移酶（MTases）。这类酶（EC 2.1.1.）作用于核酸和蛋白质中特定残基上的个别亲核位点（氮、氧、硫和碳原子），并天然地将辅因子 AdoMet 中活化的甲基转移图1A)⁵此外，甲基转移酶可利用合成的辅因子类似物，通过亲和标签、荧光基团或其他标记物实现特异性标记（图1B)⁶两类AdoMet类似物已被开发出来：用于偶联反应的氮丙啶辅因子 S序列特异性的 M乙基转移酶-I诱导的 Labeling （SMILing）⁷ 以及双活化的 AdoMet 类似物用于 m乙基转移酶导向的 T转移 A激活的 G群体（mTAG）⁸.

方案

1. 一般说明

1. 将叠氮环丙烷辅因子6BAz（溶于DMSO）和蛋白甲基转移酶Set7/9于-80 °C保存，其余试剂包括双活化辅因子SeAdoYn以及DNA甲基转移酶M.BseCI（溶于50%甘油）均于-20 °C保存。
2. 测定6BAz和SeAdoYn的浓度 通过 使用消光系数 ε 的紫外/可见光光谱法_{269 nm} (6BAz) = 16,000 cm⁻¹^-1 M^-1 和 ε_260nm (SeAdoYn) = 15,400 cm^-1 M^-1 在去离子水中。通过 Bradford 法测定 MTases 的浓度，或者，如果已知消光系数，则 通过 280 nm 处的直接吸收
3. 尽量避免通过剧烈移液或涡旋产生气泡，以防酶活性损失。应通过轻柔地上下移液进行混合。
4. 添加溶于DMSO的氮丙啶辅因子储备液时，务必确保反应体系中DMSO的终浓度低于5%。反应缓冲液中应始终包含10 mM镁离子，以防止与DNA发生非特异性反应。
5. 从酸性储备液中添加双活化辅因子时，应使用小体积（高浓度储备液），以避免pH变化，并确保测定溶液的pH无明显改变。避免使用巯基化合物， 例如，因为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）可能与反应所需的铜离子发生络合，从而干扰点击化学反应。

结果

通过氮丙啶辅因子一步标记DNA

本示例反应使用DNA甲基转移酶M.BseCI进行，该酶可修饰双链5’-ATCGAT-3’序列中的第二个腺嘌呤残基，并在pBR322质粒上具有一个识别位点（图4A）。为检测质粒标记效果，将pBR322与限制性内切酶R.TaqI（5‘-TCGA-3‘）反应。R.TaqI在pBR322上有七个识别位点，其中一个包含在M.BseCI的识别位点内。若发生标记，M.BseCI位点将受到保护而不被切割，从而产生一个683个碱基对（bp）的新片段，同时另外两个片段（315和368 bp）消失。当然，在使用其他DNA甲基转移酶进行DNA标记分析时，应选用具有相应识别序列的不同限制性内切酶。

图4B 中的琼脂糖凝胶清晰地显示出一个大小为 683 bp 的新片段（第 3 泳道）。这表明 M.BseCI 位点已被成功标记。只有实验组（第 3 泳道）出现该片段，“辅因子”对照组（第 5 泳道）以及“酶”.......

讨论

使用DNA甲基转移酶和氮丙啶辅因子对DNA进行一步标记（SMILing DNA）是一种稳健的方法，但在设计实验时应考虑某些方面。

氮丙啶辅因子：使用 M.BseCI 进行 DNA 标记时，6BAz 的浓度为 60 µM。当使用其他 DNA 甲基转移酶时，应优化辅因子浓度，例如，在使用 DNA 甲基转移酶 M.TaqI 时已采用低至 20 µM 的浓度¹⁹。较低的 6BAz 浓度具有优势，即在与限制性内切酶（REase）孵育后，可直接加入过量四倍的链霉亲和素（相对于检测体系中生物素总量的结合位点数），而不会干扰 EMSA 分析结果。否则，应纯化生物素标记的 DNA 以去除多余的辅因子，避免在琼脂糖凝胶电泳过程中出现 DNA 拖尾现象。从 DMSO 储存液中添加氮丙啶辅因子时，需确保检测体系中 DMSO 的终浓度低于 5%。过高的 DMSO 浓度可能导致酶失活。氮丙啶辅因子应始终保存在 -80 °C，以防降解。

DNA甲基转移酶（DNA MTase）：氮丙.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6BAz			根据Weinhold等人，专利号US 8,129,106，2012年3月6日公布。
β-巯基乙醇	Serva	28625
乙酸	Fisher Scientific	10304980
丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1	Serva	10688
UltraPure 琼脂糖	Invitrogen	16500100
过硫酸铵（APS）	Serva	13375
Bis-Tris	格尔布	1304
硼酸	Gerbu	1115
溴酚蓝钠盐	Serva	15375
硫酸铜(II)	Aldrich	C1297
氯仿	Fisher Scientific	10020090
考马斯亮蓝	Serva	17525
EDTA 二钠盐	Gerbu	1034
乙醇	默克	100983
GelRed（水中，10,000 倍）	Biotium	41003
甘油（99.5%）	格尔布	2006
FastRuler 低分子量 DNA Ladder	赛默飞世尔科技	SM1103
组蛋白 H3			表达质粒由Dr. Philipp Voigt和Prof. Danny Reinberg提供；表达与纯化方法参照T. J. Richmond等，J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311。
M.BseCI			表达质粒由 Michael Kokkinidis 博士提供；表达与分离方法参照 Kapetaniou 等人，Acta Cryst. 2006, F63, 12-14。
甲醇	Fisher Scientific	10675112
氯化镁  六水合物	J.T. Baker	4003
MOPS	Gerbu	1081
氯化钠	格尔布	1112
pH 试纸（Neutralit）	默克	1,095,330,001
pBR322	赛默飞世尔科技	SD0041
R.TaqI（10 u/µl)	赛默飞世尔科技	ER0671
SeAdoYn			根据 Willnow 等人，ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173 合成。
Set7/9			表达质粒由Danny Reinberg教授提供，表达与纯化方法参照D. Reinberg等，Genes Dev. 2002, 16, 479-489。
链霉亲和素	Gerbu	3058
(+)-抗坏血酸钠	Sigma生命科学	A7631
SDS 颗粒	Gerbu	1833
二水合磷酸氢二钠	默克	106,586
TAMRA 叠氮化物			根据参考文献30合成：Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173。
TaqI 缓冲液（10×）	Thermo Scientific	B28
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）	Acros Organics	42058
Tris-HCl	Gerbu	1028
Tris-X（Tris碱）	Gerbu	1018
Tris(3-羟丙基三唑基甲基)胺（THPTA）	Sigma-Aldrich	762342