从小牛肠系膜动脉和静脉分离血管段并用作生物测定法检测小肠血管活性 关键词：小牛，肠系膜动脉，肠系膜静脉，血管活性，生物测定，小肠

摘要

小肠经常暴露于可能影响血流并对其营养吸收产生负面影响的毒素。利用多通道肌动图仪及肠系膜动脉和静脉分离组织，可对感兴趣化合物或毒素的血管活性进行筛选。

摘要

哺乳动物的胃肠道系统会持续接触各种化合物（有益或有害），这些化合物可能影响该系统的血流进出。小肠血流量的变化可能导致其吸收功能受到影响。在反刍动物中，人们对饲料经发酵和消化过程释放的毒素日益关注，该领域被认为具有提升生产效率的潜力。与本文相关的视频描述了一种 体外 使用多通道肌动描记仪开发的一种生物测定法，用于筛选化合物对离体牛肠系膜动脉和静脉横切片的血管活性。将血管组织安装并平衡于肌动描记仪后，即可应用该生物测定法：作为筛选工具，评估目标化合物引起的收缩反应或血管活性；通过使用特异性激动剂进行药理学靶向，确定受体类型的存否；通过加入一种或多种拮抗剂，确定特定受体的功能作用；或评估目标化合物与拮抗剂之间可能存在的相互作用。整个过程中可实时采集数据，且来自单个动物的组织可接受大量不同实验处理（ 体外 优势），并分别代表毛细血管床两侧的血管系统，以准确反映小肠动脉输入和静脉输出血供的实际情况。

引言

组织床血流的改变可能对器官功能产生重大影响。小肠的主要功能之一是营养物质的吸收。肠道吸收表面的动脉血流对于营养物质的吸收至关重要，并且随着食糜沿肠表面移动，血流量会增加以促进营养吸收¹。血流减少可导致跨上皮梯度下降，从而降低营养物质的吸收效率²。除了营养物质外，小肠还可能接触到次生代谢产物、药物或毒素，这些物质会影响肠系膜局部的血流。在反刍动物中，饲料中的化合物（例如，氨基酸等营养物质或麦角生物碱等毒素）可通过前胃的发酵过程释放出来。如果这些化合物在瘤胃发酵的微生物代谢过程中未被降解，它们将随着食糜在动物胃肠道中的移动而被吸收或与其他组织发生相互作用。

有多种不同的方法可用于测量血流 体内 (例如，多普勒超声、留置式血流计、放射性标记微球以及指示剂稀释技术）来评估不同实验条件或治疗干预的效果。然而，在Mulvany和Halpern之前，用于研究血管平滑肌机械或药理特性的方法仅限于大血管³ 发表了一篇文章，描述了一种利用金属丝支撑的血管环在肌动描记仪中进行实验的技术。自该技术发展以来，研究人员对相关的肌动描记仪系统不断进行改进，使其能够适用于多种不同类型管状结构的评估。该系统还经过调整，可采用固定杆来安装较大的血管。⁴ 在不希望采用灌注技术的情况下。

由于不同解剖来源的血管之间以及不同物种动物中相同血管之间存在差异，因此无法轻易将一种血管或动物类型的数据外推至其他血管或不同动物类型中的相同血管⁵。因此，每当改变这些因素时，都必须开发并验证独立的生物测定方法。近年来，已针对牛外侧隐静脉以及右侧瘤胃动脉和静脉开发了多种基于这些技术的生物测定方法^6,7。

本生物测定方法旨在专门研究麦角生物碱对支持小肠的血管系统的影响。据报道，饲喂的生物碱中有50-60%出现在皱胃内容物中，但仅有5%在粪便中被回收⁸。Strickland 等⁹在一篇关于麦角生物碱的综述中指出，现有数据表明小肠可能是麦角肽类生物碱吸收的最重要部位。Eckert 等¹⁰回顾了麦角生物碱的生物药剂学特性，并指出一旦穿过上皮屏障，麦角生物碱可通过淋巴系统转运至锁骨下静脉，或经由肠系膜静脉进入门静脉血液。Rhodes 等¹¹报道，在摄食高内生真菌感染（高麦角生物碱）饲料的阉牛中，十二指肠和结肠的血流量减少。Foote 等¹²利用右侧瘤胃动脉和静脉生物测定法证明，麦角生物碱在瘤胃血管系统中具有血管活性。随后，Foote 等¹³在体内实验证明，瘤胃暴露于麦角生物碱会导致瘤胃上皮血流量下降。这种流向瘤胃吸收表面的血流量减少同时导致营养物质（挥发性脂肪酸）通量降低。鉴于大量麦角生物碱从前胃进入小肠；因此推测其对小肠血管系统和营养吸收可能产生类似影响。这促使了牛近端回肠肠系膜动脉和静脉生物测定法的建立。

方案

本研究中采用的实验步骤无需经过肯塔基大学动物护理与使用委员会的批准，因为未使用活体动物。在采集本研究中所用任何样本之前，所有动物均已通过击晕枪击晕并放血致死。该操作在肯塔基大学的联邦检验屠宰设施内进行。美国农业部食品安全检验署的官方代表对涉及活体动物的所有操作及尸体处理过程进行了监督。

1. 仪器准备

1. 为尽量缩短组织样本采集至实验开始之间的时间，在采集实验组织前应预先设置好仪器并准备好缓冲液（或者如果有其他人员可用，这些任务可同时进行）。
   注意：这不仅可最大限度延长组织保持活性的时间以用于实验，而且某些实验可能持续较长时间（或希望在一天内完成多个实验），因此通常应尽可能早地开始准备。
2. 启动配套计算机、数据采集设备、水浴装置（用于缓冲液）和肌动仪单元。将校准设备放置在肌动仪单元上，开启肌动仪加热功能（预设为 37.5 °C），并让仪器单元和校准设备升温至预设温度。
   1. 在计算机上打开先前创建的 Chart 软件设置文件，并开始运行（但暂不采集数据）。
3. 使设备预热 10 分钟。
   1. 开始采集数据。
   2. 将所有通道归零。
   3. 检查每个通道（每个多通道肌动仪含 4 个通道）的校准情况，并在必要时进行校准，以将该通道对应的力传感器输出的电信号标准化为由经认证的 2 克砝码所提供的 2 克力。
   4. 完成校准和单位转换后，将后续所有数据存储为克（g）。各实验室可根据自身需求进行相应调整；仪器和软件也支持使用其他单位，例如毫牛顿（mN）和伏特（V）。
4. 确保气体管路无堵塞，并打开气体供应（95% O₂/5% CO₂）至肌动仪单元。在整个实验过程中持续向所有缓冲液（肌动仪腔室内的缓冲液）通入气体。
5. 用 70% 乙醇充满所有肌动仪腔室，浸泡 10 分钟，随后移除乙醇，并重复进行第二次 10 分钟的浸泡。
   1. 移除乙醇后，用去离子水冲洗三次，再用配制好的缓冲液冲洗三次（缓冲液配制方法见第 2 节），第三次加入的缓冲液保留在腔室内。
      注意：此时设备可在此状态下闲置，直至缓冲液和组织准备就绪且工作人员准备好继续实验。

2. 缓冲液的制备

1. 配制1 L Krebs-Henseleit缓冲液，用于组织样本的运输和处理，以达到以下终浓度：11.1 mM D-葡萄糖；1.2 mM MgSO₄；1.2 mM KH₂PO₄；4.7 mM KCl；118.1 mM NaCl；3.4 mM CaCl₂；24.9 mM NaHCO₃。
   1. 将9.6 g Krebs盐加入约900 ml去离子水中，在搅拌器上搅拌混合。
   2. 每升所需缓冲液中依次加入0.373 g二水合氯化钙和2.1 g碳酸氢钠。
   3. 用95% O₂/5% CO₂气体混合物对缓冲液通气20分钟。
   4. 通气后，将pH调节至7.05（过滤会使pH升高；最终目标pH应为7.4），并定容至1 L。
   5. 将缓冲液过滤除菌后转入洁净的已灭菌1 L培养瓶中，4 °C保存备用。
2. 另配Krebs-Henseleit缓冲液，用于肌动描记实验，配制方法同步骤2.1中用于运输的Krebs-Henseleit缓冲液，但需额外添加与收缩力实验相关的化合物。
   注：通常本实验所需缓冲液体积为2 L即可，但具体体积应根据实验时长、肌动描记仪腔室数量以及缓冲液更换次数（与处理物添加相关）进行适当增减。
   1. 在通气步骤（步骤2.1.3）之前，每升待配缓冲液中加入9.1 mg盐酸去甲替林。
   2. 配制1.0 μM盐酸普萘洛尔溶液，并向每升Krebs-Henseleit缓冲液中加入1 ml该溶液。该缓冲液需在使用当天配制，并保持在肌动描记仪工作温度下（使肌动描记仪内温度维持在37.5 °C）。
      注：添加盐酸去甲替林可抑制生物胺的再摄取机制，从而加快实验添加物从浸泡血管的缓冲液中的清除。加入普萘洛尔可防止处理化合物非特异性结合β-肾上腺素能受体。

3. 血管系统的收集与制备

1. 尽快从尸体中取出胃肠道。一旦动物不再表现出任何非自主反射，立即移除头部和皮张，并将尸体垂直悬挂。胃肠道（从食管到肛门）的摘除应由经批准的屠宰场工作人员在规定时间内完成（<击晕后20分钟内）。
   注：具体操作时间通常受限于采集肠道的场所/设施及其工作人员所遵循的标准操作程序或联邦法规要求。
   1. 在大多数设施中，应在与进入食品供应链的胴体加工区域分离的独立位置进行胃肠道操作。选择附近一个方便的地点，将胃肠道取出并铺开展开以便检查。
2. 将胃肠道铺开后，辨认小肠、连接小肠与盲肠的回盲褶，以及位于回盲褶近端延伸出的回肠瓣（图1A）。
   1. 使用解剖刀或手术刀，在回肠瓣中部的肠系膜膜上轻轻划开一个小切口。用两个食指钝性分离脂肪和结缔组织，暴露肠系膜血管（图1B）。
3. 从肠系膜上的该瓣状突起或膨大处，分离出多支暴露的肠系膜动静脉束分支（长度约2 cm），这些血管为该段回肠提供支持（图1C）。
   1. 若使用镊子夹持组织，务必避免直接夹持或牵拉血管，因为在移除过程中任何拉伸都可能损伤血管并对其功能产生不利影响¹⁴。最佳的血管摘除方法是：在待取血管段的两端横向剪断，然后沿已分离的血管段侧面或平行方向剪开。为便于操作，可连同部分周围组织一并取下，以便用镊子夹持。
   2. 用一对镊子将组织样本浸入装有冰冻克雷布斯-亨塞尔特缓冲液（Krebs-Henseleit buffer）的试管中，并置于冰上保存，直至可在实验室进行后续处理。
4. 将组织样本置于切割台面或培养皿中，并部分浸入冰冻的克雷布斯-亨塞尔特缓冲液中。
   1. 使用#5精细镊、诺伊斯虹膜剪以及放大灯或解剖显微镜（2.5至5.0倍放大倍率即可），仔细剥离周围脂肪和结缔组织，并分离动脉与静脉。先在一端识别血管开口，再用镊子小心夹住血管周围的筋膜。
   2. 将剪刀尖端滑入抬起的筋膜下方，沿血管平行方向剪开。完成初始切口后，可用剪刀沿血管两侧继续剪切，进一步分离脂肪和结缔组织。在尽量减少血管在实验台暴露时间的前提下，确保血管尽可能清洁。
   3. 将血管放回装有新鲜克雷布斯-亨塞尔特缓冲液的试管中，于4 °C保存（样本采集后最多可保存24小时，仍可获得有效的收缩功能数据）。
   4. 使用剃刀刀片将用于肌动图仪（myograph）的血管切成所需数量的2 mm节段（使用组织切片器有助于获得一致的横截面）。
   5. 在解剖显微镜下（12.5倍放大倍率）检查每个节段，确保其无异常、分支、瓣膜或在解剖和清洗过程中意外造成的表面损伤。如发现任何异常、分支、瓣膜或表面损伤，应更换该血管节段。
5. 将合格的切段血管（浸没于克雷布斯-亨塞尔特缓冲液中）置于冰上或4 °C保存，直至准备安装至肌动图仪腔室（通常<30分钟）。
6. 轻柔地将血管安装至肌动图仪上，将支撑针插入血管腔内，并通过肌动图仪上的微调装置逐步增加张力，注意避免将血管拉伸至超过2至3 g的读数。
7. 当所有腔室均安装完毕后，抽吸各腔室中的缓冲液，重新加入5.0 ml缓冲液，并启动15分钟计时器，开始平衡期及实验。

4. 实验

1. 将所有血管段平衡 1.5 小时，以达到 1.0 g 的稳定静息张力。
   1. 每 15 分钟更换一次 Krebs-Henseleit 孵育缓冲液。
   2. 在平衡过程中，持续调整血管段的张力至 2 g，然后让其松弛至约 0.80 g。注意避免血管过度松弛（可能从支架上滑脱）。尽量达到一个稳定的基线张力，使血管在无需手动调节的情况下维持 1 g 的张力。
2. 在平衡期间，配制 1.32 M 的 KCl 水溶液作为参考溶液。
3. 完成满意的平衡后，向浴槽中加入 500 μl 的 1.32 M KCl 溶液，使最终体积为 5.5 ml 时溶液中 KCl 浓度为 0.12 M。
   1. 加入 1.32 M KCl 后，不要手动调节张力，因为该刺激引起的最大反应用于评估组织活性，并可用于标准化处理数据（例如 激动剂的浓度-反应曲线）。
   2. 每 15 分钟更换一次缓冲液，直至张力恢复至 1.0 g 的基线水平。
4. 一旦达到基线，立即更换缓冲液并同时启动 1 分钟计时器。所有浴槽应同时进行此操作，以避免开始时间错开。
   1. 在 1 分钟倒计时期间，涡旋待加标准品，并为 1 号浴槽准备注释。
   2. 根据实验要求，以 25 μl 的等分量将标准品加入各个浴槽（以确保处理液体积不超过总体积的 0.5%）。
   3. 当最后一个标准品加入后，启动 9 分钟计时器。
   4. 在 9 分钟标准品孵育结束后，移除含处理液的缓冲液，向各浴槽加入 5.0 ml 新鲜缓冲液，并启动 2.5 分钟计时器。
   5. 重复步骤 4.4.4。
   6. 在第二次 2.5 分钟冲洗结束时，抽真空清除浴槽中的缓冲液，加入新鲜缓冲液，并启动 1 分钟计时器，倒计时至第二次标准品添加的开始时刻。
5. 按此循环完成当天所有标准品的添加。
6. 在最后一次标准品添加及随后的 9 分钟孵育期间，准备 1.32 M KCl 参考化合物，用于实验结束时加入 500 μl 作为参考剂量。
7. 在最后一次处理添加后的 1 分钟间隔结束时，加入 KCl 并启动 9 分钟计时器。
   注：KCl 的添加用于在实验结束时确认组织活性，对于施加后引起反应极小的处理尤为有用。
8. 在最后一次 9 分钟参考化合物孵育结束后，抽真空或移除所有浴槽中的缓冲液，不再添加新鲜缓冲液。结束实验。
9. 保存 Chart 文件，取出血管段并妥善处理，并按照仪器制造商提供的清洁规程（可能为实验室特有）对肌动图设备进行清理。

结果

用于获得本研究结果的血管取自6头荷斯坦阉牛（体重425 ± 8 kg），采集时间间隔为3周。在图2中展示了典型的肠系膜静脉对KCl及逐步增加浓度的处理试剂所呈现的收缩反应示例。反应幅度会因血管尺寸（与供体动物体型相关）而有所差异，但也可能因采集和清洗过程中操作不当（如过度拉伸）而受到负面影响。因此，观察血管在KCl刺激下是否产生显著的收缩反应至关重要。若此时反应微弱或几乎无反应，则不应继续使用该血管进行后续实验操作。如图2中9分钟孵育阶段所示，随着试剂浓度递增，血管收缩反应也呈逐步增强趋势。尽管该趋势在此特定实验设计中是期望的结果，但在其他处理条件下未必出现，也不一定作为目标。实验结束时再次加入KCl，虽然该数据不用于后续数据分析，但极为关键，因为它可确认组织在实验结束时仍具有活性（若血管对所有处理试剂均无反应，则此步骤的重要性更为突出）。

图2 中的数据以张力克数记录。为了尽量减少个体动物之间及血管之间的差异，对这些数据进行标准化处理非常重要。因此，除了用作活性指标外，最大KCl...

讨论

开发该生物测定方法时面临的首要挑战是建立一个可重复的肠系膜血管采集位点。样本采集位点的一致性至关重要，因为小肠的功能在从空肠向回肠过渡的过程中会发生变化，因此肠系膜的特性也呈现出类似的规律性差异。肠系膜动脉和静脉的回肠分支最易于通过解剖标志进行识别。通过定位盲肠并沿回盲皱襞追踪至其在肠系膜左侧的终止点，该位置接近 cranial mesenteric artery¹⁵ 的末端。较长肠系膜区域（称为 flange）以及回盲皱襞的延伸部分（为牛类动物所特有）¹⁶ 使得在多个动物个体间进行取样具有高度可重复性。在该生物测定阶段，一个常见的严重错误是机械性牵拉。机械牵拉会对后续血管功能产生显著的负面影响¹⁴，研究者会发现，在取出及后续清洗过程中被过度操作或牵拉的血管对所用参考化合物将无反应。遗憾的是，这是在功能水平上评估血管制备质量的唯一可靠方法，对 KCl 无反应的血管不应继续用于获取可靠数据。

另外两个方法学验证步骤（未展示）促成了本文所呈现的最终方法，分别是使用其他化学物质作为参考化合物，以及检测血管在储存24小时后的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多通道肌动描记仪	Danish Myo Technologies	610M	肌动图仪对于该生物测定至关重要，但也可使用其他可满足实验需求的平台。
Powerlab 8/sp	ADInstruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	版本 7
力校准套件	Danish Myo Technologies	100055	专用于DMT肌动图仪
瓶顶过滤器	Nalgene	595-4520	0.22 μm 孔径；45 mm 颈部尺寸
#5 Jewler’s 钳	Miltex	555008FT	可使用任意品牌的镊子
诺伊斯虹膜剪	Miltex	18-1510	任何品牌的剪刀均可使用
解剖范围	蔡司	Stemi 2000-C	任何品牌的解剖显微镜均可使用
可调节组织基质	布雷因特里科学公司	TM C12	这并非检测的关键步骤，但可显著减少切片间长度的差异，并大幅加快切片过程。
克雷布斯-亨斯莱特缓冲液	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	无需购买Krebs液，可自行配制
氯化钙二水合物	Sigma-Aldrich	C7902-500G
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761-500G
去甲丙咪嗪盐酸盐	Sigma-Aldrich	D3900-5G
盐酸普萘洛尔	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO₂2	Scott Gross	UN3156