从小牛肠系膜动脉和静脉分离血管段并用作生物测定法检测小肠血管活性 关键词：小牛，肠系膜动脉，肠系膜静脉，血管活性，生物测定，小肠

摘要

小肠经常暴露于可能影响血流并对其营养吸收产生负面影响的毒素。利用多通道肌动图仪及肠系膜动脉和静脉分离组织，可对感兴趣化合物或毒素的血管活性进行筛选。

摘要

哺乳动物的胃肠道系统会持续接触各种化合物（有益或有害），这些化合物可能影响该系统的血流进出。小肠血流量的变化可能导致其吸收功能受到影响。在反刍动物中，人们对饲料经发酵和消化过程释放的毒素日益关注，该领域被认为具有提升生产效率的潜力。与本文相关的视频描述了一种 体外 使用多通道肌动描记仪开发的一种生物测定法，用于筛选化合物对离体牛肠系膜动脉和静脉横切片的血管活性。将血管组织安装并平衡于肌动描记仪后，即可应用该生物测定法：作为筛选工具，评估目标化合物引起的收缩反应或血管活性；通过使用特异性激动剂进行药理学靶向，确定受体类型的存否；通过加入一种或多种拮抗剂，确定特定受体的功能作用；或评估目标化合物与拮抗剂之间可能存在的相互作用。整个过程中可实时采集数据，且来自单个动物的组织可接受大量不同实验处理（ 体外 优势），并分别代表毛细血管床两侧的血管系统，以准确反映小肠动脉输入和静脉输出血供的实际情况。

引言

组织床血流的改变可能对器官功能产生重大影响。小肠的主要功能之一是营养物质的吸收。肠道吸收表面的动脉血流对于营养物质的吸收至关重要，并且随着食糜沿肠表面移动，血流量会增加以促进营养吸收¹。血流减少可导致跨上皮梯度下降，从而降低营养物质的吸收效率²。除了营养物质外，小肠还可能接触到次生代谢产物、药物或毒素，这些物质会影响肠系膜局部的血流。在反刍动物中，饲料中的化合物（例如，氨基酸等营养物质或麦角生物碱等毒素）可通过前胃的发酵过程释放出来。如果这些化合物在瘤胃发酵的微生物代谢过程中未被降解，它们将随着食糜在动物胃肠道中的移动而被吸收或与其他组织发生相互作用。

有多种不同的方法可用于测量血流 体内 (例如，多普勒超声、留置式血流计、放射性标记微球以及指示剂稀释技术）来评估不同实验条件或治疗干预的效果。然而，在Mulvany和Halpern之前，用于研究血管平滑肌机械或药理特性的方法仅限于大血管³ 发表了一篇文章，描述了一种利用金属丝支撑的血管环在肌动描记仪中进行实验的技术。自该技术发展以来，研究人员对相关的肌动描记仪系统不断进行改进，使其能够适用于多种不同类型管状结构的评估。该系统还经过调整，可采用固定杆来安装较大的血管。⁴ 在不希望采用灌注技术的情况下。

由于不同解剖来源的血管之间以及不....

方案

本研究中采用的实验步骤无需经过肯塔基大学动物护理与使用委员会的批准，因为未使用活体动物。在采集本研究中所用任何样本之前，所有动物均已通过击晕枪击晕并放血致死。该操作在肯塔基大学的联邦检验屠宰设施内进行。美国农业部食品安全检验署的官方代表对涉及活体动物的所有操作及尸体处理过程进行了监督。

1. 仪器准备

1. 为尽量缩短组织样本采集至实验开始之间的时间，在采集实验组织前应预先设置好仪器并准备好缓冲液（或者如果有其他人员可用，这些任务可同时进行）。
   注意：这不仅可最大限度延长组织保持活性的时间以用于实验，而且某些实验可能持续较长时间（或希望在一天内完成多个实验），因此通常应尽可能早地开始准备。
2. 启动配套计算机、数据采集设备、水浴装置（用于缓冲液）和肌动仪单元。将校准设备放置在肌动仪单元上，开启肌动仪加热功能（预设为 37.5 °C），并让仪器单元和校准设备升温至预设温度。
   1. 在计算机上打开先前创建的 Chart 软件设置文件，并开始运行（但暂不采集数据）。
3. 使设备预热 10 分钟。
   1. 开始采集数据。
   2. 将所有通道归零。
   3. 检查每个通道（每个多通道肌动仪含 4 个通道）的校准情况，并在必要时进行校准，以将该通道对应的力传感器输出的电信号标准化为由经认证的 2 克砝码所提供的 2 克力。
   ....

结果

用于获得本研究结果的血管取自6头荷斯坦阉牛（体重425 ± 8 kg），采集时间间隔为3周。在图2中展示了典型的肠系膜静脉对KCl及逐步增加浓度的处理试剂所呈现的收缩反应示例。反应幅度会因血管尺寸（与供体动物体型相关）而有所差异，但也可能因采集和清洗过程中操作不当（如过度拉伸）而受到负面影响。因此，观察血管在KCl刺激下是否产生显著的收缩反应至关重要。若此时反应微弱或几乎无反应，则不应继续使用该血管进行后续实验操作。如图2中9分钟孵育阶段所示，随着试剂浓度递增，血管收缩反应也呈逐步增强趋势。尽管该趋势在此特定实验设计中是期望的结果，但在其他处理条件下未必出现，也不一定作为目标。实验结束时再次加入KCl，虽然该数据不用于后续数据分析，但极为关键，因为它可确认组织在实验结束时仍具有活性（若血管对所有处理试剂均无反应，则此步骤的重要性更为突出）。

图2 中的数据以张力克数记录。为了尽量减少个体动物之间及血管之间的差异，对这些数据进行标准化处理非常重要。因此，除了用作活性指标外，最大KCl.......

讨论

开发该生物测定方法时面临的首要挑战是建立一个可重复的肠系膜血管采集位点。样本采集位点的一致性至关重要，因为小肠的功能在从空肠向回肠过渡的过程中会发生变化，因此肠系膜的特性也呈现出类似的规律性差异。肠系膜动脉和静脉的回肠分支最易于通过解剖标志进行识别。通过定位盲肠并沿回盲皱襞追踪至其在肠系膜左侧的终止点，该位置接近 cranial mesenteric artery¹⁵ 的末端。较长肠系膜区域（称为 flange）以及回盲皱襞的延伸部分（为牛类动物所特有）¹⁶ 使得在多个动物个体间进行取样具有高度可重复性。在该生物测定阶段，一个常见的严重错误是机械性牵拉。机械牵拉会对后续血管功能产生显著的负面影响¹⁴，研究者会发现，在取出及后续清洗过程中被过度操作或牵拉的血管对所用参考化合物将无反应。遗憾的是，这是在功能水平上评估血管制备质量的唯一可靠方法，对 KCl 无反应的血管不应继续用于获取可靠数据。

另外两个方法学验证步骤（未展示）促成了本文所呈现的最终方法，分别是使用其他化学物质作为参考化合物，以及检测血管在储存24小时后的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多通道肌动描记仪	Danish Myo Technologies	610M	肌动图仪对于该生物测定至关重要，但也可使用其他可满足实验需求的平台。
Powerlab 8/sp	ADInstruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	版本 7
力校准套件	Danish Myo Technologies	100055	专用于DMT肌动图仪
瓶顶过滤器	Nalgene	595-4520	0.22 μm 孔径；45 mm 颈部尺寸
#5 Jewler’s 钳	Miltex	555008FT	可使用任意品牌的镊子
诺伊斯虹膜剪	Miltex	18-1510	任何品牌的剪刀均可使用
解剖范围	蔡司	Stemi 2000-C	任何品牌的解剖显微镜均可使用
可调节组织基质	布雷因特里科学公司	TM C12	这并非检测的关键步骤，但可显著减少切片间长度的差异，并大幅加快切片过程。
克雷布斯-亨斯莱特缓冲液	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	无需购买Krebs液，可自行配制
氯化钙二水合物	Sigma-Aldrich	C7902-500G
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761-500G
去甲丙咪嗪盐酸盐	Sigma-Aldrich	D3900-5G
盐酸普萘洛尔	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO₂2	Scott Gross	UN3156