方法在小鼠肾上腺嗜铬细胞细胞贴附电容测量

Summary

胞吐作用后，融合的质膜通过称为内吞作用的过程被回收。这种机制重组新的突触小泡以进行下一轮释放。通过使用小鼠肾上腺嗜铬细胞中的细胞附着电容记录来捕获和分析单个内吞事件。

Abstract

神经元传递是大脑内细胞通讯不可或缺的一部分。突触前膜的去极化导致称为胞吐作用的囊泡融合，介导突触传递。随后突触囊泡的检索对于在确定为内吞作用的过程中产生新的神经递质填充囊泡是必要的。在胞吐作用过程中，融合囊泡膜将导致表面积增加，随后的内吞作用导致表面积减少。在这里，我们的实验室演示了小鼠肾上腺嗜铬细胞中单个内吞事件的细胞附着电容记录的基本介绍。这种类型的电记录对于单个囊泡水平的胞吐作用和内吞作用的高分辨率记录很有用。虽然这项技术可以检测囊泡胞吐作用和内吞作用，但我们实验室的重点是囊泡内吞作用。此外，这项技术使我们能够分析单个内吞事件的动力学。这里描述了小鼠肾上腺组织解剖、嗜铬细胞培养、基本细胞附着技术以及随后测量单一内吞事件的单个痕量示例。

Introduction

突触传递是由含有神经递质的突触小泡的胞吐作用介导的，而这些囊泡必须经过神经末梢内本地吞再循环以维持长期的神经元沟通。由于突触传递在大脑中的重要作用，了解构成突触小泡循环是实现在整个蜂窝通信更好的理解的重要基础的分子机器。在细胞模型系统，肾上腺嗜铬细胞提供了一些最明确的洞察分子机制基础突触囊泡循环。胞吐作用，在神经递质释放的最后步骤，已经极大地研究并通过使用肾上腺嗜铬细胞^1,2的检查。事实上，大多数的分子玩家编排的形成，目标，对接和融合分泌颗粒已经确定，由于应用程序股利ERSE技术，嗜铬细胞^1。此外，通过提供一个机会以允许参与胞吐作用的蛋白质机械的单泡的分辨率，嗜铬细胞仍然是一个功能强大的模型，以解决囊泡融合³的问题。

细胞贴附电容测量首先在胞吐³中解决单囊泡融合利用。以通过细胞膜导纳测量与小区连接的配置^4-7膜片钳技术来检测囊泡一样小〜中直径为60nm已证明的胞吐作用。导纳的定义是多么容易的电路或设备将允许电流流动的措施;它是阻抗的倒数。因此，导纳测量提供的膜电容的理解。这是由小泡膜进入细胞膜的结合来实​​现;这表明掺入改变表面面积^8。每个囊泡融合导致膜电容^9,10逐步增加。此外，该导纳测量提供了膜电导和胞吐事件³中 ​​的融合孔导。由于这种技术提供了在胞吐过程中识别单囊泡动力学的独特工具，我们的实验室....

Protocol

注意：整个过程是根据美国国立卫生研究院的指导方针进行的，经批准由伊利诺伊大学芝加哥分校的动物护理和使用委员会。

1，解决方案和文化传媒准备

1. 保留所有的解决方案在-20°C至六个月。保持培养基在4℃下进行长达3个月。
2. 通过混合1毫升ITSX（胰岛素 - 转硒补充）的青霉素 - 链霉素溶液和1毫升到100毫升的DMEM制备100ml培养基。
3. 通过混合250毫升DMEM中，加入2.5ml的100mM的CaCl _2，和2.5毫升的50mM EDTA制备的酶溶液。
4. 通过混合225毫升DMEM，25毫升胎牛血清，625毫克的白蛋白，和625毫克的胰蛋白酶抑制剂的制备失活的解决方案。
5. 准备了154毫米的NaCl，5.6 mM的氯化钾，5.0毫米肝素钠，3.6毫米的碳酸氢钠，5.6毫米的葡萄糖洛克的解决方案。将pH调节至7.3，用NaOH。
6. 制备50毫克/毫升的聚-D-赖氨酸（PDL）溶液。用1毫克/毫升的最终浓度大衣盖玻片。
7. 制备140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，2mM的_氯化钙 ，1mM的MgCl ₂的，10毫米的HEPES-NaOH和10mM葡萄糖的细胞外溶液。将pH调节至7.3，用NaOH为〜310纳摩尔/ kg的渗透压。
8. 准备了50毫米的NaCl，100毫米TEACl，5 ....

Results

细胞存活率和千兆欧姆密封的质量是确定细胞贴附电容记录的质量是至关重要的。因此，为促使有效和高效的细胞培养物之前，电生理记录，和典型的活细胞被示出在图1中是至关重要的。实践和时间将是在实现千兆欧姆密封高品质很有帮助。如果人们可以清楚地看到，当在协议5.3步中描述的补丁吸管的临近细胞的细胞变形，有获得高品质的密封更好的机会。 图3显示膜电容的典型记录与相关的多个向下的步骤单囊泡内吞作用。

可行的小鼠肾上腺嗜铬细胞图1的例子细胞培养24小时后，箭头指向3可行的嗜铬细胞。 请点击这里查看该图的放大版本。.......

Discussion

细胞贴附电容测量要求，以顺利取得录音提供高品质的几个关键步骤：1）肾上腺编制可行的，健康的细胞; 2）客运专线涂层的盖玻片; 3）千兆欧密封的形成; 4）该系统的噪声电平;和5）的相位校正。

动物手术，修饰可以潜在地使是调整手术方法，以最适合的灵巧和防止剥离时发生损坏。此外，关于定位，除去肾上腺足够的做法是必要的，这将被用于电生理记录的细胞全部来自肾上腺髓质。对酶消化，这是重要的鼓泡用5％CO ₂ +95％O ₂的溶液中平衡的酶溶液。可以肯定的是，连接到所述气缸中的管子是足够紧，无泄漏。此外，要确保最终我Ñ​​解决方案，在整个15分钟的时间冒泡妥善安置;这可以通过使用放置一个20G的针头端已修成平头的管的端部，以便适当地引导空气流动来实现。此外，附加的时间为这个步骤不会伤害，只要该气流是不那么强大的溢出在管中的溶液。细胞滴定，将采取的做法的另一个关键组成部分。大多数细胞可能会被损坏，如果过度滴定;反之，如果滴定是不够的，会有非常少量的单个分离的细胞从组织中分离。为了有效地滴定，利用200微升枪头移液器上下7-8x，确保腺体通过200微升枪.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
聚-D-赖氨酸	Sigma	P0899
DMEM		15066024	避免紫外线
Dulbecco's 改良 Eagle Medium	Life Technologies
盖玻片	Carolina 生物	633029	12 毫米
青霉素 链霉素	Life Technologies	15140122	100 毫升
胰岛素-反式 Sel-X	Life Technologies	51500056	仅在冰上解冻！
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus 贴片放大器	HEKA
BNC-2090 数据采集板	National Instruments
Igor 数据采集软件	Wavemetrics
P-97 移液器拉拔器	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instruments	B150-110-10	外径：1.5 mm 内径： 1.10 mm 长度： 10 cm