短暂性或永久性脑缺血模型中白细胞亚群的体视学与流式细胞术表征

摘要

脑卒中后脑内髓系细胞的表征可通过体视学结合光学分数器方法，或通过脑白细胞悬液的流式细胞分析来实现。这两种技术均有助于对缺血性脑组织中主要髓系细胞亚群进行准确的表型区分。

摘要

人们认为，小胶质细胞的活化以及血液来源的巨噬细胞和中性粒细胞的外渗在脑卒中后的脑损伤中发挥着关键作用。这些骨髓源性细胞亚群可表现出不同的表型和功能，因此需要加以区分和表征，以研究其调控机制及其对组织损伤的贡献。本实验方案提供了两种不同的脑免疫细胞表征方法：一种精确的体视学方法和流式细胞术分析。体视学方法基于光学分数法（optical fractionator），通过系统随机取样估算感兴趣区域（梗死脑组织）中细胞的总数。第二种表征方法提供了一种简单的方法来分离脑白细胞悬液，并通过流式细胞术对其进行表征，从而可鉴定小胶质细胞、浸润的单核细胞以及缺血组织中的中性粒细胞。此外，本文还详细描述了一种仅影响小鼠大脑皮层的脑缺血模型，该模型可产生高度可重复的梗死灶且死亡率较低，以及采用Cavalieri法通过组织学脑切片处理来表征梗死体积的操作步骤。

引言

小胶质细胞的形态学、表型及基因表达改变，以及血液来源的巨噬细胞和中性粒细胞的外渗与活化，被认为在脑损伤后的病理生理级联反应中发挥关键作用^1-4。本实验方案提供了两种方法，用于估算缺血性脑组织中不同髓系细胞亚群的数量，并对其进行表型特征分析。此外，方案还描述了一种小鼠脑缺血的实验模型，该模型包括对远端大脑中动脉（MCA）和颈总动脉（CCA）进行短暂性或永久性结扎，并介绍了如何使用体视学软件通过精确的Cavalieri法评估梗死体积。

表征缺血脑组织中髓系细胞亚群的第一种方法是基于光学分馏器原理的体视学方法⁵。这是生命科学领域最常用的体视学探针，具有高精度和较低的误差系数^5-7。当组织被切成切片时，该方法是细胞定量的最佳选择，因为它避免了因组织切片化而导致的细胞计数估计偏差。该方法是表征缺血组织中浸润性中性粒细胞亚群数量、动态变化及表型改变的一种非常有力的技术⁸。

第二种表征方法基于Campanella及其合作者提出的改良方案⁹，该方法可简便地分离脑组织中的白细胞悬液，并通过流式细胞术对其进行表征。与传统的免疫组织化学技术相比，流式细胞术可根据CD45表达水平的差异，区分小胶质细胞（CD45^loCD11b⁺）和浸润的髓系细胞（CD45^hiCD11b⁺）^9-13。此外，还可区分缺血组织中的促炎性单核细胞（CD45^hiCD11b⁺Ly-6G^-Ly-6C^hi）、中性粒细胞（CD45^hiCD11b⁺Ly-6G⁺）以及其他白细胞亚群。该方法为评估脑缺血实验模型中的神经炎症提供了一种可靠且快速的检测手段。然而，组织处理过程可能影响缺血组织中不同细胞群体的活化状态及其数量，因此该方法提供的是半定量的表征结果。

方案

注意：所有实验方案均遵循马德里康普顿斯大学动物福利委员会的指南（遵循欧盟指令 86/609/CEE 和 2003/65/CE）。

1. 脑缺血模型

注意：本文中的脑缺血模型涉及通过尼龙缝合线结扎永久性或暂时性阻断双侧颈总动脉（CCA）和大脑中动脉（MCA）。

1. 术前准备
   1. 通过高压灭菌器或玻璃珠灭菌器对所有手术器械进行灭菌。同时使用70%乙醇对手术区域进行消毒。
   2. 使用适当的麻醉剂对小鼠进行麻醉。采用异氟烷2.5%诱导麻醉，随后以异氟烷1.5%维持麻醉，气体混合比例为空气80% / 氧气20%，通过麻醉蒸发器给药。在麻醉期间，向小鼠眼部涂抹人工泪液以防止角膜干燥。
   3. 将小鼠置于与反馈装置连接的加热垫上，将温度探头插入直肠，并在手术过程中将体温维持在生理水平（36.5 ± 0.5 ºC）。
2. 通过结扎法阻断颈总动脉
   1. 将小鼠仰卧位固定，并用胶带固定四肢。使用70%乙醇或聚维酮碘对皮肤进行消毒，并剪除颈部腹侧上部的毛发。
   2. 在手术显微镜下，于颈部腹侧中线处做一个约1 cm的切口。
   3. 分离所有软组织（包括下颌下腺、舌下腺和腮腺等腺体组织），辨认位于气管外侧的左侧颈总动脉（CCA）。牵开肌肉，暴露左侧CCA，并小心将其与迷走神经分离。
   4. 分离完成后，使用6/0尼龙缝线结扎左侧CCA。可打永久结或滑结（若需建立短暂性脑缺血模型，则使用滑结以允许再灌注）。
   5. 将腺体组织复位，并使用6/0尼龙缝线缝合颈部皮肤切口。
      注：假手术动物接受与MCAO动物相同的手术操作，但不结扎CCA。
3. 通过结扎法实现远端大脑中动脉阻塞
   1. 将小鼠右侧卧位固定，并用胶带固定。使用70%乙醇或聚维酮碘对头部皮肤进行消毒，并剪除小鼠头部毛发（剪除后清除毛发）。
   2. 在手术显微镜下，于眼睛与耳朵之间做一皮肤切口。将皮肤牵开并用胶带固定。
   3. 从右向左在颞肌上做一水平切口，随后在颞肌右侧做第二条垂直切口（注意避免损伤颞静脉）。将颞肌从颅骨表面分离，并用缝线牵拉固定，以保持清晰的颅骨视野。
   4. 使用冷的无菌生理盐水清洗颅骨表面，透过颅骨透明区域确定左侧大脑中动脉（MCA）的准确位置。使用不锈钢钻头在颧弓与鳞状骨之间的额叶区域进行直径约1 mm的圆形开颅。小心去除颅骨，暴露MCA。
   5. 向脑表面滴加少量冷的无菌生理盐水，使用镊子小心剥离脑膜（硬脑膜和蛛网膜）。
   6. 在MCA分叉为额支与后支之前的远端主干处进行结扎。使用9/0尼龙缝线结扎左侧MCA，可打永久结或滑结（若需建立短暂性脑缺血模型，则使用滑结以允许再灌注）。CCA与MCA阻断之间的时间间隔约为10–20分钟，具体时长取决于操作者的熟练程度。
   7. 将颞肌复位，并使用6/0尼龙缝线缝合皮肤切口。
   8. 将小鼠放回笼中恢复麻醉（通常需5–10分钟），并腹腔注射（I.P.）布托啡诺（0.3 mg/kg）。
      1. 术后监测数小时，观察小鼠是否出现不适（在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位前不得无人看护）。由于术后常出现体重下降，建议将软化食物置于培养皿中以便摄食。
   9. 待动物完全恢复后，将其重新与其它动物合笼饲养。
   10. 若需建立短暂性MCAO模型，可再次麻醉小鼠，松解CCA和MCA上的滑结以实现再灌注（通常在阻塞后0.5–2小时进行）（图1）。
       注：假手术动物接受与MCAO动物相同的手术操作，但不结扎MCA。

2. 脑组织的灌注与切片

1. MCAO 后 24 或 48 小时，通过腹腔注射致死剂量的麻醉剂处死小鼠（例如， 戊巴比妥钠，腹腔注射 86 mg/kg，或过量异氟烷
2. 用0.1 M磷酸盐缓冲液灌注小鼠，随后用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）配制的4%多聚甲醛（PFA）灌注。
3. 按如下步骤取出脑组织：
   1. 在脊髓上方将动物断头。
   2. 在头部皮肤上做一后向前切口以暴露颅骨。在颅骨侧壁与颅底交界处做两个侧向切口，并移除小块骨组织。
   3. 沿矢状缝切开颅骨。
   4. 使用镊子去除覆盖在每个半球上的颅骨以暴露大脑。用解剖刀将脑组织从颅骨分离，并将其转移至4% PFA溶液中。
4. 在4 ºC条件下，用4% PFA溶液后固定3小时。
5. 去除PFA溶液，将脑组织在30%蔗糖溶液中孵育48小时，以进行冷冻保护。
6. 去除蔗糖溶液，将脑组织在低温异戊烷（-40 ºC）中快速冷冻。将冷冻脑组织于 –80 ºC 保存。
7. 使用冷冻切片机获取小鼠脑的冠状切片（30 µm）。将十套连续切片收集于冷冻保护液中。每套连续切片包含约14–16张冠状切片，切片间距为300 μm，可充分覆盖小鼠脑从bregma后方1.94至-2.46范围内的结构。

3. 尼氏染色与梗死体积估算

1. 甲苯胺蓝尼氏染色
   1. 将脑组织切片贴附于防脱载玻片上。为通过尼氏染色切片的卡瓦列里法（Cavalieri method）测定梗死体积，采用1/20的切片采样比例（即步骤2.7中收集的十组连续切片中的一组的每隔一片；大约共使用7-8张切片，切片间距约为600 μm）。注意保持正确的前后方向（梗死区域位于右侧）。
   2. 按以下步骤进行常规尼氏染色：
      1. 将载玻片上的切片干燥数小时。
      2. 将载玻片上的切片复水，并用0.1%甲苯胺蓝溶液染色5分钟。
      3. 用梯度乙醇（70%、90%和100%；每次更换持续5分钟）脱水。用二甲苯清洗载玻片上的切片，滴加二甲苯中含Distrene-80增塑剂的DPX封片剂，盖上盖玻片。
2. 使用体视学软件在尼氏染色的连续切片中通过卡瓦列里法估算梗死体积
   1. 使用表1中所示参数，结合体视学系统通过卡瓦列里法¹⁴量化梗死体积，该系统包括配备摄像头的显微镜、XYZ电动计算机载物台及体视学软件（以下主要说明适用于PC系统，其他操作系统的操作可能有所不同）。
   2. 按正确顺序开启PC、显微镜、载物台控制器和摄像头。启动体视学软件。
   3. 将10倍物镜移至工作位置，并在物镜下拉菜单中选择10倍。
   4. 在第一张尼氏染色切片上移动，找到合适的参考点。点击鼠标设定参考点（要自由移动需激活“joy free”按钮）。
   5. 估算“贴片切片厚度”（即考虑收缩后的实际切片厚度）。按下“Focus Position Meter”按钮，从切片底部到顶部测量并计算厚度。
   6. 为对侧半球、同侧半球及梗死区域创建轮廓工具。
      1. 点击“Display”菜单，选择“Display Settings”，打开显示设置对话框。
      2. 选择“Contours”选项卡，点击“add Contour type”按钮。
      3. 为每个待量化区域创建轮廓，并使其在轮廓下拉菜单中可见。点击确定。
   7. 为对侧半球、同侧半球及梗死区域创建标记工具。
      1. 点击“Display”菜单，选择“Display Settings”，打开显示设置对话框。
      2. 选择“Markers”选项卡，通过双击可用标记修改标记名称。使其在标记栏中可见。点击确定。
   8. 激活切片管理器。
      1. 点击“Tools/Serial Section Manager”菜单。使用“new section”按钮添加新切片。该按钮将打开“Serial Section Setup”对话框。
      2. 将“Block Advance”设置为30 µm。将“mounted section thickness”设置为步骤3.2.5中估算的数值。
      3. 将“Evaluation Interval”设置为20。使用1/20的切片采样比例。
      4. 将“起始切片编号”设为1。将第一张切片顶部的Z轴值设为0。点击确定。
   9. 绘制轮廓以勾勒对侧半球边界。
      1. 从轮廓下拉菜单中选择在步骤3.2.6中预先创建的对侧半球工具。
      2. 绘制轮廓以勾勒对侧半球边界。
      3. 完成对侧半球轮廓绘制后，右键点击鼠标并选择“close contour”。
   10. 使用卡瓦列里法估算对侧半球轮廓体积。
       1. 点击“Probes”菜单，选择Cavalieri Estimator。将“Grid Spacing”设为100 µm，将“Grid Rotation”设为0，将“Block Advance”设为30 µm。点击确定。
       2. 从标记栏中选择“对侧半球”按钮。在对侧半球轮廓内右键点击。
       3. 选择“Paint Cavalieri Markers Mode”。再次在对侧半球轮廓内右键点击，选择“Paint Markers into Contour”。
       4. 通过点击Probes菜单中的Cavalieri Estimator关闭该估算器，并从标记栏中取消激活对侧半球标记按钮。
   11. 对同侧半球和梗死区域重复相同步骤（步骤3.2.7和3.2.8）。在每张切片区域估算完成后保存数据。
   12. 在其余尼氏染色切片中计算对侧、同侧及梗死区域的体积。
       1. 按照步骤3.2.6创建新切片。不要修改“Serial Section Setup”对话框中已输入的数值。点击确定。
       2. 在新切片中重复步骤3.2.7至3.2.8。
   13. 将定量结果导出至电子表格文件。
       1. 在Stereo Investigator菜单中点击“Probes”，选择“Display Probe Run List”，打开“Previous Stereological Runs Dialog”。
       2. 通过点击选择所有切片。按下“View Results”按钮，打开“Cavalieri Estimator Results”窗口，其中显示各区域的估算面积和体积。
       3. 要将结果导出至电子表格文件，点击“Copy all Results to Clipboard”，然后粘贴至Excel文件中，汇总各区域获得的主要结果（表2）。
   14. 以mm³表示梗死体积，或使用以下公式以半球梗死百分比（%IH）表示¹⁵：%IH = InfVol/ContrVol*100，其中

InfVol（梗死组织体积）= ΣInfArea_i，
ContrVol（对侧半球体积）= ΣContrArea_i

4. 采用光学分数法对脑缺血后浸润性中性粒细胞进行体视学定量分析

1. 脑切片染色：
   1. 为通过光学分馏器法¹⁶估算MCAO后浸润的中性粒细胞总数，使用1/10的切片采样比例。采用常规免疫荧光技术，使用大鼠抗Ly6G抗体（1A8）及相应的二抗对游离脑切片进行中性粒细胞免疫染色。此外，尽管核标记物（如DAPI或TOPRO）复染对中性粒细胞的识别并非必需，但有助于更清晰地识别梗死区域。
   2. 将脑切片贴附于防脱显微镜载玻片（superfrost）上，确保梗死区域位于右侧。
2. 通过光学分馏器法对缺血脑组织中浸润的白细胞进行定量
   1. 使用表3中所示参数，结合体视学系统通过光学分馏器法对缺血脑组织中浸润的白细胞进行定量。重复第3节中的步骤3.2.1–3.2.5。
   2. 按照第3节步骤3.2.6所述方法，创建用于梗死区域的轮廓工具。
   3. 按照第3节步骤3.2.7所述方法，创建用于中性粒细胞的标记工具。
   4. 激活切片管理器并创建新的切片，如第3.2.8步所述。本例中，将“评估间隔”设置为10（即采用1/10切片采样比例来估算中性粒细胞数量）。
   5. 从轮廓下拉菜单中选择“梗死区域”轮廓工具（此前已在步骤4.2.1中创建）。在10倍物镜下绘制轮廓以圈定梗死区域。随后切换至100倍物镜进行中性粒细胞定量（切记在物镜下拉菜单中选择100倍物镜）。
   6. 点击“Probes”菜单并选择“Optical Fractionator”。将计数框的“XY放置”参数在X和Y方向上均设置为230。将“Grid Rotation”设置为0。将“Block Advance”设置为30 µm。点击确定。
   7. 从标记工具栏中选择“中性粒细胞”按钮。在梗死区域内标记染色的中性粒细胞。标记完成后，点击“Probes”和“Optical Fractionator”以关闭光学分馏器探针。随后取消激活标记工具栏中的中性粒细胞按钮。
   8. 对每一张切片重复相同的流程（4.2.4–4.2.9）。
   9. 将定量结果导出至电子表格文件。
      1. 点击Stereo Investigator菜单中的“Probes”，选择“Display Probe Run List”，打开“Previous Stereological Runs”对话框。
      2. 通过点击选中所有切片，按下“View Results”按钮，打开“Optical Fractionator Results”窗口，其中将显示估算的中性粒细胞数量。
      3. 点击“Copy all Results to Clipboard”将所有结果复制到剪贴板，并粘贴至电子表格文件中。

5. 脑组织解离与流式细胞术分析

注意：对新鲜脑组织进行流式细胞术分析以表征髓系亚群，可作为此前在固定并免疫染色的脑切片上进行中性粒细胞表征的替代方法。

1. 脑组织解离与单细胞悬液制备
   1. 为每只动物配制 10 ml RPMI（Roswell Park Memorial Institute 培养基）-Percoll 溶液，其中包含 8 ml RPMI、1 ml 30% Percoll 和 1 ml 10× PBS（磷酸盐缓冲液）。
   2. 按照步骤 2.3 所述方法，在MCAO后取出小鼠脑组织。
   3. 在显微镜下，从缺血侧脑组织的小鼠脑中分离出同侧皮层的梗死核心区及周边半暗带区域（假手术组和未处理动物取相应区域）。称量脑组织重量，并将其放入 5 ml 冰冷的 RPMI-Percoll 溶液中（称重步骤可用于实验组之间的归一化处理）。
   4. 使用 Potter-Elvehjem 型组织研磨器（带聚四氟乙烯杵头）将组织研磨成单细胞悬液。
   5. 将细胞悬液转移至 50 ml 超速离心管中，并向样品中加入额外 5 ml RPMI-Percoll 溶液。
   6. 在 25 ºC 条件下以 7,800 × g 离心 30 分钟。离心后，确保溶液顶部出现对应于髓鞘的白色层。
   7. 小心移除髓鞘层，并通过 40 µm 尼龙滤网将全部细胞悬液（包括沉淀细胞）过滤。
   8. 在滤网上加入 10 ml RPMI，确保所有细胞均被洗脱，然后将滤液收集至 50 ml 离心管中。再加入 30 ml RPMI，混匀后在室温下以 600 × g 离心 10 分钟。
   9. 弃去上清液，用 1 ml PBS 重悬白细胞沉淀。加入 4 ml 裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl、10 mM NaHCO₃ 和 0.1 mM EDTA），在室温下孵育 2–3 分钟以裂解红细胞。随后在 4 ºC 条件下以 600 × g 离心 10 分钟。
2. 细胞染色与流式细胞术
   1. 配制用于流式细胞术的标记染色液，每份样品包含 200 μl PBS-BSA（1%）、1:100 Fc-Block、1:40 anti-CD45-PercP 大鼠抗体、1:40 anti-Ly6G-APC 大鼠抗体、1:40 anti-CD11b-FITC 大鼠抗体和 1:40 anti-Ly-6C-PE 大鼠抗体。
   2. 将细胞重悬于标记染色液中，冰上孵育 45 分钟。
   3. 用 1 ml 冷 PBS 洗去标记染色液，在 4 ºC 条件下以 600 × g 离心 10 分钟。弃去上清后，用 100 µl FACS Flow 缓冲液重悬细胞沉淀，并通过流式细胞仪检测全部细胞悬液。
   4. 使用流式细胞分析软件对细胞亚群进行表征与定量。
      1. 本方案所配制的标记染色液可识别的主要白细胞亚群如下：CD45^loCD11b⁺：常驻小胶质细胞；CD45^hiCD11b⁺Ly-6G⁺：中性粒细胞；CD45^hiCD11b⁺Ly-6G^-Ly-6C^hi：促炎性单核细胞。

结果

此处所示的脑缺血模型仅在皮层产生梗死，而不影响纹状体组织，因为供应纹状体的MCA豆纹动脉分支未被阻塞（图1）。通过尼氏染色，受损区域可被识别为皮层的浅染区域（图2）。该模型在MCAO术后24小时具有高度可重复的梗死体积（采用Cavalieri法在尼氏染色切片上估算的%IH为15.89 ± 0.28）（图2）。采用Cavalieri法估算梗死体积是一种精确度高、误差低的方法，这一点体现在Gundersen的对侧和同侧半球以及梗死区域的误差系数（CE）中（表2）。受损组织体积可用mm³ 表示，也可使用3.2.13节中的公式以% IH表示。此外，通过估算同侧和对侧区域的总体积，可计算水肿指数，以校正梗死体积，避免对受损组织体积的高估（表2）。

由于脑组织经过连续切片处理，可利用光学分数法（图3 和 表4）对缺血区域中特定细胞亚群（如浸润的中性粒细胞）的总数进行精确估算，相关参数见 表3。本方案显示，在小鼠pMCAO术后24小时和48小时，梗死区域中性粒细胞（Ly6G阳性细胞）总数估计分别为 23,328 ± 3,623 和 82,856 ± 8,143（图3D）。与既往研究一致，中性粒细胞浸润程度与梗死面积呈直接正相关（图3E）。采用光学分数法估算中性粒细胞数量是一种精确度高、误差较小的方法，其误差通过Gundersen的CE值得以反映（表4）。

白细胞分离与流式细胞术表征方案可从缺血小鼠同侧半球皮层中分离出 47,922 ± 23,174 个髓系细胞，占细胞悬液中总事件数的 10–30%。采用该方案捕获的绝大多数事件表现出较低的 FSC 参数，提示其主要为细胞碎片图4）。CD11b 染色显示 CD11b⁺ 细胞具有更高的FSC值（图4），表明细胞碎片不会被此标记物标记，且如前所述，可通过将FSC阈值设为200来将其从后续分析中排除⁹该方法获得的细胞碎片量存在差异，表明样本处理过程中的差异（处理时间、组织保存、样本温度、髓鞘去除效率）可能产生影响。 等。) 可以解释这一现象。此外，还需使用细胞滤网以避免样品中存在细胞团块；此步骤需在细胞染色前完成。采用图示的设门策略进行分析。 图5 基于CD11b和CD45的表达，我们能够区分缺血组织中的常驻髓系细胞与浸润性髓系细胞。该CD11b⁺ 与未处理组和假手术组相比，缺血半球中CD45低表达的细胞数量增加，表明小胶质细胞在缺血后发生增殖图4，图5 和 表5）。这种差异很可能是由于来自外周的细胞浸润所致，这一点由CD11b的出现得以证实⁺CD45^你好 缺血脑组织中的细胞亚群（图4，图5 和 表5）在幼稚型脑组织和假手术脑组织中数量较少。浸润细胞对CD11b的贡献⁺ 脑缺血过程中细胞群体的变化是一个高度动态的过程⁴在结扎法MCAO模型中，其值可占总CD11b的30%至60%⁺ 细胞，具体数量取决于病灶大小以及表征时间。中性粒细胞被鉴定为Ly-6G⁺ 细胞是采用该脑缺血模型在小鼠脑缺血后24小时缺血脑组织中数量最多的浸润性细胞群体，占CD11b的70-80%⁺CD45^你好其余细胞主要是CD11b的一个亚群⁺CD45^你好Ly-6G^-Ly-6C^你好 促炎性单核细胞。在此模型中，该细胞群体在大脑中动脉闭塞（MCAO）后24至48小时内，于缺血性脑区的数量将增加。

图1： 大脑中动脉结扎术的手术操作流程。 (A) 牵开颞肌后，在小鼠颅骨上进行小范围开颅。使用9/0缝线打结或活结对大脑中动脉（MCA）进行结扎。(B) MCAO模型产生的皮质损伤的代表性图像。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2： 采用卡瓦列里法（Cavalieri）对梗死体积进行定量。（A） 永久性大脑中动脉结扎（MCA ligation）后 24 小时的尼氏（Nissl）染色脑切片代表性图像。高倍镜图像显示尼氏染色后的低染色区域，该区域可识别 MCAO 后的损伤区域（梗死核心）。图中同时标示出梗死周边区域（P.I）。 （B） 采用卡瓦列里法对连续尼氏染色脑切片进行梗死体积定量，结果以梗死半球百分比（%IH）表示，检测时间为 MCAO 后 24 小时（n = 50 只小鼠）。

图3： 采用光学分数法（Optical Fractionator）对结扎后24小时和48小时梗死区域中性粒细胞进行立体学定量。（A） MCAO术后24小时缺血区域中浸润的中性粒细胞（Ly6G阳性细胞）代表性图像。轮廓线标示出梗死区域。 （B, C） 采用光学分数法对中性粒细胞进行定量的光学分选器示例。 （D） 梗死区域在24小时和48小时的总中性粒细胞定量结果（n = 4只小鼠）。 （E） MCA结扎后24小时和48小时中性粒细胞数量与梗死面积的相关性分析。 请点击此处查看该图的高清版本。

图4： 基于物理参数（SSC和FSC）对来自正常、假手术及缺血性（MCAO后24小时）半脑的脑白细胞进行代表性点图散点分析。 在所有组别中均鉴定出表达CD11b（红色）的细胞群。对该细胞群进行门控，并根据CD45的表达进一步表征。表达低水平CD45（绿色）的细胞存在于缺血性和非缺血性脑皮层中，对应于小胶质细胞。相反，表达高水平CD45（黄色）的细胞仅见于缺血性半脑，假手术组中仅有少量存在。对CD11b⁺CD45^hi 细胞群的进一步分析表明，中性粒细胞（Ly-6G⁺ 细胞，蓝色）和促炎性单核细胞（Ly-6C^hi 细胞，橙色）是脑浸润细胞中在卒中后24小时的主要亚群。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5： 区分缺血组织中常驻与浸润性髓系细胞的设门策略。 首先根据同型对照荧光强度对 CD11b⁺ 细胞进行设门（A）。图中右上角展示了缺血脑组织细胞悬液的代表性点图。此外，还显示了使用该技术获取的总事件数以及 CD11b⁺ 事件数的典型值（细胞数/缺血侧脑半球）；（A） CD11b⁺ 细胞的 CD45 荧光强度分析见图 B。图中右上角展示了经设门后的 CD11b⁺ 亚群中 CD45 与 CD11b 表达的代表性点图分析结果。此外，还显示了使用该技术每缺血侧脑半球获取的 CD45^lo 和 CD45^hi 细胞的典型数量（B）。

体视学点计数法（Cavalieri法）所用参数
切片厚度 (t)	30 µm
物镜倍数	10X
切片取样分数 (ssf)	1/20
切片间距	600 µm
网格间距	100 µm

表1： 用于梗死组织体视学定量分析的参数。

结果	对侧	同侧损伤	梗死
面积（µm²）	151,460,000	155,060,000	22,600,000
体积（µm³）	90,876,000,000	93,036,000,000	13,560,000,000
体积校正  超出体积 (µm³)	89,957,100,000	92,046,300,000	13,416,600,000
误差系数（Gundersen） m=0	0.068	0.077	0.067
误差系数（Gundersen） m=1	0.015	0.017	0.015
误差系数（Gundersen） alpha(q)	0.068	0.077	0.067
% 梗死半球		14.90
脑水肿（IPS体积/总体积）		1.02

表2： 使用Stereo Investigator软件通过Cavalieri方法测量对侧、同侧及梗死体积的代表性示例。

光学分数法所用参数
切片厚度 (tsf)	30 µm
物镜	100X
切片采样分数 (ssf)	1/10
计数框高度	40 µm
计数框宽度	40 µm
X 方向网格尺寸	230 µm
X 方向网格尺寸	230 µm
安全边界	2 µm
光学分馏器高度	14 µm

表3： 使用Stereo Investigator软件结合光学分数法探针对脑缺血后浸润性中性粒细胞进行体视学定量所用的参数。

通过光学分数法估算中性粒细胞数量
采样位点数量	430
形状因子	6.24
计数的总标记数	166
光学分数法估算的中性粒细胞数	117,608.03
误差系数（Gundersen），m=0	0.22
误差系数（Gundersen），m=1	0.09

表4： 使用Stereo Investigator软件结合光学分数探针估算脑缺血后浸润中性粒细胞的代表性示例。

	Cd11b+	中性粒细胞	单核细胞	小胶质细胞
未处理组	25,863 ± 4,575.8	473 ± 75.8	525 ± 191.4	19,012 ± 1,523
假手术 24 小时	24,563 ± 5,263	873 ± 192.5	1,124 ± 391.5	23,734 ± 2,910
pMCAO 24 小时	47,922 ± 23,174	4,874 ± 748.7	4,826 ± 1,345	35,395 ± 10,833

表5： 采用流式细胞术检测脑缺血后小胶质细胞的代表性结果。

讨论

本文介绍的脑缺血模型在大脑中动脉结扎后24-48小时及7天，通过不同方法测定梗死体积，结果具有高度可重复性^8,15,17。与其他模型相比，该大脑中动脉阻塞（MCAO）模型的死亡率较低（低于1%），从而减少了研究中所需使用的动物数量。实现低死亡率的关键步骤是维持适当的无菌条件，以避免可能影响卒中诱导后动物存活率的感染。该MCAO模型不仅可用作永久性MCAO模型——这被认为是一种适用于转化研究的临床相关模型¹⁸，还可通过使用滑结对颈总动脉（CCA）和大脑中动脉（MCA）进行暂时性结扎，并在预定时间进行再灌注，从而构建短暂性缺血模型¹⁹。该方法已在小鼠和大鼠中成功应用^17,20。上述所有证据表明，通过结扎法建立的MCAO模型是一种高度灵活、具有多种应用前景的脑缺血模型。该技术的一个关键步骤是需要在体视显微镜下进行侵入性手术；开颅过程必须极为谨慎，以避免损伤颧骨及大脑中动脉。然而，假手术动物（经历相同手术操作但不进行CCA和MCA结扎）的使用为区分手术操作本身带来的效应提供了有效工具。采用该技术后脑损伤的程度可通过多种方法进行量化。我们的脑组织切片、尼氏染色及随后利用卡瓦列里原理（Cavalieri）估算体积的方案，能够准确量化受损区域，并减少此类研究所需使用的小鼠数量，因为连续的脑切片还可用于不同的免疫组织化学分析。为了更好地实施该方法，关键在于选择体视学软件中合适的参数（表1），这些参数将用于通过以下公式估算不同区域的体积：V = 1/ssf×a_f×t×ΣP_i （其中ssf为切片采样分数，t为切片的平均厚度，a_f为网格间距的面积，∑P为击中结构的点数）。

通过结扎法实现远端大脑中动脉阻塞（MCAO）可用于表征参与脑损伤后炎症过程的浸润性白细胞及免疫细胞亚群^8,131-4。本文提出了两种用于脑内免疫细胞特征分析的不同方法：一种是精确的体视学方法，另一种是流式细胞术分析，以更全面地表征多种白细胞亚群。

利用连续脑切片技术，可通过光学分馏器法¹⁶对中性粒细胞的总数进行定量。该方法通过在感兴趣区域（本研究中为梗死区域）内，以系统随机采样（SRS）方式布设一系列无偏虚拟计数空间，并在X、Y和Z方向上保持均匀间距，根据所采样的细胞数量来估算细胞总数。该方法为在结扎后不同时间点准确估算缺血脑组织中中性粒细胞总数提供了可靠工具。尽管本研究未展示，但该方案也可用于缺血后不同中性粒细胞亚群的估算²¹，以及对缺血脑组织中其他细胞群体的精确定量，例如其他浸润的白细胞（单核细胞/巨噬细胞），还可用于估算存活神经元数量，甚至可用于脑卒中后神经发生的定量分析。在目标区域实现准确估算最关键的步骤是选择合适的参数，如表3中所示的缺血区中性粒细胞定量所用参数。这些参数将被体视学软件用于通过公式 N = ΣQ- × 1/ssf × 1/asf × 1/tsf 计算总的阳性细胞数（N）（其中ΣQ-为使用分馏器法计数的细胞总数，ssf为切片采样分数，asf为采样面积分数，tsf为采样厚度分数）⁵。尽管该方法比其他定量技术（例如，每毫克组织中性粒细胞标志物分析、代表性图像的光密度分析或每视野中性粒细胞数量）更耗时，但其优势在于是一种无偏且可靠的定量方法，能够精确测定细胞数量。

脑部白细胞分离方法能够同时鉴定和定量多种免疫细胞亚型，且无需通过干扰系统来引入偏差 体内 染色或遗传操作。随后对特征明确的髓系细胞群进行细胞分选或免疫磁珠分离，可用于多种下游应用，例如基因或蛋白质表达的进一步研究。该方法获得的中性粒细胞、单核细胞和小胶质细胞的准确表征，相较于现有的免疫组织化学研究等方法具有更高的特异性，这一优势使得能够将特定功能归因于介导脑内先天免疫应答的不同髓系细胞。此外，该方法还可通过使用适当的标记物进一步拓展，用于表征其他脑内细胞群体，如血液来源的巨噬细胞（CD11b）⁺CD45^你好CD68⁺），并可应用于其他中枢神经系统病理或损伤的研究。因此，该技术为探索脑内炎症反应的异质性提供了重要工具。该技术的主要局限性在于需从新鲜脑组织制备白细胞悬液，此过程可能改变细胞的活化状态或其抗原特性。尽管该技术相较于免疫组织化学研究能够实现更详细的定性表征，但在基于细胞分离的定量分析方面准确性较低。尽管如此，本研究的细胞分离方案效率与其他已发表的方法相当⁹ 并且可以高效地用于检测对照组与MCAO组之间，甚至不同处理的MCAO组之间脑内免疫细胞数量的差异⁸.

本方案的关键步骤包括组织解剖、组织破碎以及髓鞘去除。在组织采集方面，可通过组织称重进行归一化处理，以避免因不同操作者解剖效果差异所导致的实验变异性。此外，不同MCAO组之间的归一化也可通过梗死体积（先前通过磁共振成像确定）来实现。另一种解决方法是使用缺血组和对照组小鼠的整个同侧半脑，甚至以缺血小鼠的对侧半脑作为对照，从而减少动物使用数量。尽管这种方法可避免各次解剖之间的差异，但存在一个主要缺点：由于总细胞数量增加，而仅位于同侧皮层梗死核心及周边区域的髓系细胞数量并未增加，因此引入了稀释效应。关于组织破碎，本方案描述了通过机械方法破碎脑组织细胞的操作步骤，避免使用酶解处理，防止细胞表面抗原发生改变^9,22，这对于后续对炎症细胞亚群进行定性和定量分析至关重要。除了制备目标细胞悬液外，强烈建议从脑组织样本中去除髓鞘，以避免对后续实验操作（如免疫磁珠细胞分选或流式细胞术^23,24）造成干扰。髓鞘去除可通过多种方法实现，例如蔗糖梯度、Percoll梯度或抗髓鞘磁珠法。本研究基于既往比较不同脑细胞悬液制备方法的研究结果，采用机械破碎联合Percoll梯度离心去除髓鞘，以提高细胞得率和存活率²⁵。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Photonic Led F1	WPI	571329-8	设备
Temp Controller	Panlab	HB 101/2	设备
Volvere GX	NSK	Ne22L	设备
显微镜	WPI	PZMIII-BS	设备
不锈钢钻头	FST	19007-14	手术材料
杜蒙特#5/45镊子	FST	11251-35	手术材料
杜蒙特#5SF镊子	FST	11252-30	手术材料
6/0缝线	LorcaMarin	55108	手术材料
9/0缝线	LorcaMarin	61966	手术材料
Nikon Eclipse	Nikon	TE300	设备
异氟烷	Esteve	571329-8	化学试剂
戊巴比妥钠	Vetoquinol	570681	化学试剂
冷冻切片机	Leica Microsystems GmbH	SM2000R	设备
Superfrost载玻片	Thermo Scientific	2014-07	实验材料
醋酸克里西林紫	Sigma	C5042	化学试剂
显微镜	Nikon	Nikon Eclipse TE300	设备
XYZ电动计算机控制载物台及控制器	Ludl Electronics Products		设备
Stereo Investigator系统	Microbrightfield	Version 7.003软件	软件
5 ml组织研磨器，Potter-Elv，带聚四氟乙烯研杵	Thomas Scientific	0913X70	实验材料
聚丙烯50 ml橡树岭离心管	Nalgene	3119-0050	实验材料
Percoll	Sigma	p1644-100	化学试剂
RPMI 1640	Lonza	BE12-702F	化学试剂
Beckman超速离心机	Beckman Coulter		设备
Beckman Coulter超速离心机转子45 Ti	Beckman Coulter		设备
BD无菌细胞筛，40微米	BD	BD 352340	实验材料
牛血清白蛋白	Sigma	A3733-500G	试剂
小鼠FcR封闭试剂	Miltenyi	130-092-575	抗体
CD11b-FITC，人和小鼠	Miltenyi	130-098-085	抗体
CD45-PE，小鼠	Miltenyi	130-102-596	抗体
抗-Ly-6G-APC，小鼠	Miltenyi	130-102-936	抗体
PerCP/Cy5.5抗小鼠Ly-6C	Biolegend	128012	抗体
BD FACS Flow	BD	342003	试剂
BD FACSCalibur；四色	BD	342975	设备
BD Cell Quest Pro软件	BD		软件
FlowJo软件	Treestar inc.		软件