本研究建立了一种检测表观遗传药物DZNep对蚊虫发育、繁殖力及存活率影响的实验方案。本文描述了将DZNep通过水相暴露处理于蚊虫未成熟阶段，以及通过血液暴露处理于成蚊阶段的方法，同时介绍了S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAH hydrolase）抑制活性的检测方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
杀虫剂抗性对疟疾防控项目构成了重大挑战。蚊虫能够快速适应环境中的多种变化，使得疟疾防控成为热带国家普遍存在的难题。杀虫剂抗性蚊群的出现，促使人们有必要探索用于媒介蚊虫控制的新型药物靶点通路及相关化合物。表观遗传药物在癌症研究中已有广泛应用，但其对昆虫的影响尚不明确。本研究提供了一种简便的实验方案，用于评估3-Deazaneplanocin A（DZNep）——一种处于实验阶段的癌症治疗用表观遗传药物——对疟疾传播媒介Anopheles gambiae的毒理学效应。在暴露于DZNep的未成熟蚊虫中，观察到死亡率随浓度升高而增加，同时个体体型减小；该化合物还降低了成年蚊虫的生殖力，相较于对照组处理具有显著差异。此外，与对照组相比，暴露于DZNep后蚊虫体内S-腺苷高半胱氨酸（SAH）水解酶活性呈现药物依赖性下降。本实验方案为研究人员提供了一种简单、分步操作的流程，用于评估实验性药物的多种毒理学终点指标，进而展示了一种独特的多角度方法，可用于研究水溶性表观遗传药物或感兴趣化合物对媒介蚊虫及其他昆虫的毒理学效应。
引言
疟疾是全球由昆虫引起的死亡人数最多的疾病。据估计，全球每年约发生2.19亿例疟疾病例，导致约66万人死亡，其中大多数发生在非洲1。尽管已作出多方努力，疟疾防控项目仍面临诸多挑战。虽然杀虫剂处理过的蚊帐和室内滞留喷洒是防控项目的关键组成部分，但当地蚊虫种群对杀虫剂产生的抗性阻碍了这些措施的实施2。蚊虫抗药性种群的迅速增加，主要归因于疟疾传播蚊虫能够快速适应环境变化并利用不同的生态位3,4,5。为了克服现有的杀虫剂抗性机制，有必要探索新型杀虫靶标和下一代化合物。一种用于评估实验性杀虫剂对疟疾蚊虫不同生活阶段效果的简单、分步操作方案，将显著促进上述研究工作的开展。
药物对细胞系和动物模型作用的药理学研究，已确立了表观遗传药物作为调控细胞和生物体遗传与生理特性的有效工具。DNA甲基化和组蛋白修饰是两种表观遗传机制，可在不改变DNA序列的前提下影响多细胞生物的基因表达6。翻译后修饰（如甲基化）在维持细胞完整性与基因表达中发挥关键作用，并可能影响多个基本生物学过程7,8,9。在某些昆虫物种中的研究表明，表观遗传机制在卵子发生、干细胞维持10以及剂量补偿11等过程中具有重要作用。然而，这些机制在病媒生物中的相关研究仍属空白。利用化合物调控蚊虫中的这一系统，可能为发现新型杀虫剂靶向通路提供线索。3-脱氮表萘普霉素A（DZNep）是一种已知的组蛋白甲基化抑制剂，其对多种癌症的影响已有广泛研究12,13,14,15,16。DZNep是一种稳定的水溶性表观遗传药物，可间接抑制组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶（EZH2），而EZH2是哺乳动物细胞中多梳抑制复合物2（PRC2）的组成部分。PRC2在调控多细胞生物干细胞生长中具有重要作用，而组蛋白甲基化是PRC2介导基因沉默的关键环节。在免疫缺陷小鼠中，经DZNep预处理的细胞已被证实其致瘤性降低17。该药物正逐渐被用于研究其他疾病，例如与EZH2相关的非酒精性脂肪肝病18。DZNep是一种公认的S-腺苷高半胱氨酸（SAH）水解酶抑制剂19,20。SAH水解酶的抑制会导致SAH积累，从而通过限制可利用的甲基供体基团，抑制甲基转移酶活性。SAH是一种氨基酸衍生物，多种生物（包括昆虫）在代谢通路中均会利用该物质。最近一项研究表明，低剂量DZNep可能影响昆虫的滞育并延缓其发育21。
本文建立了一种用于研究水溶性化合物对蚊虫不同生活阶段影响的稳健实验方案。该方案包含三个部分：分别用于检测水溶性化合物对蚊虫幼体、成年吸血雌蚊以及成年雄蚊和雌蚊酶活性的影响。首先，将DZNep溶于水中，用于研究其对蚊虫幼体发育和存活的影响。实验采用两种浓度，以比较药物暴露量增加10倍后可能产生的差异。为探究药物对成年雌蚊的影响，将DZNep加入去纤维蛋白羊血中，并通过人工饲血方式喂食雌蚊，随后检测药物对雌蚊生殖力的影响。最后，采用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）作为指示剂，进行酶活性测定实验，以评估DZNep对成年雄蚊和雌蚊SAH水解酶抑制作用的影响。尽管本方案以疟疾媒介蚊种Anopheles gambiae为研究对象，但可轻松适用于研究目标化合物对其他蚊种或其他昆虫的影响。需要注意的是，本方案中详述的技术可能不适用于在水或水性介质中溶解度有限或不溶的药物。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：本实验方案的三个部分分别描述了DZNep药物对幼蚊的水相暴露、通过血液暴露于成年雌蚊以研究其对生殖力的影响，以及利用简单的比色法测定DZNep对SAH水解酶的抑制作用。这些实验的示意图见图1。
1. 幼蚊发育与存活率检测
注意：本部分介绍一种影响蚊子幼虫发育和存活的水溶性药物的使用方法。
- 孵化 A. gambiae 28 °C 下将卵置于蒸馏水（dH₂O）中2O）并饲养至2nd 龄幼虫
- 取一个无DNA酶、无RNA酶的六孔细胞培养板，加入10 ml dH₂O2O 至每孔。
- 选择2龄蚊子幼虫nd 龄期，每孔加入15条幼虫。加入2之前nd 将龄期幼虫转移至培养板，置于纸巾上2-3秒以吸去多余水分。
- 使用彩色编码胶带标记孔位以实现实验随机化。每块板上每种测试浓度标记2个孔图2).
- 配制 1 mM DZNep 盐酸盐（分子量 = 298.73）储备液：将 0.3 mg DZNep 溶于 1 ml 去离子水中2O. 向标记好的孔中加入 DZNep.HCl 储存液，使终浓度分别为 0.5 µM 和 5.0 µM。
注意：该储备液可在 4℃ 保存 °C用于短期（1天至1个月）或-20 °C，用于长期保存（超过一个月）。
注意：上述浓度的储备液加入后不会显著改变孔中水的体积。然而，对于更高浓度的情况，建议将化合物溶解于幼虫培养基中，以避免化合物被不必要的稀释。 - 向每个孔中加入等量的片状鱼食。盖上培养板，于28℃孵育。 °C 的培养箱中
- 记录经 DZNep 处理与未处理的幼蚊在 24 小时暴露期后的死亡率。移除并丢弃所有死亡的幼虫。此后每天重复记录一次，直至所有幼虫死亡或化蛹并羽化为成虫。每两天记录一次幼虫的大小。 即， 0、2、4、6、8天，直至化蛹。
- 使用适当的统计分析软件分析幼虫发育和死亡率数据。
注意：可以使用 Microsoft Excel 中的条形图来表示死亡率数据。使用 JMP 或 SPSS 等软件进行多变量方差分析（MANOVA），可揭示药物不同剂量是否对蚊子幼虫的存活率产生显著差异。
2. 通过人工饲喂器给药测定雌性蚊虫繁殖力的实验
注意：本部分详细说明将药物加入血液，并通过人工饲喂系统喂食给成年雌性蚊子的方法。
- 为对照组和实验组分别设置成蚊笼，每笼中雌雄蚊虫数量相等。两组均提供浸有10%蔗糖溶液的棉球，持续至雌蚊准备吸血（对于Anopheles gambiae，3-5天为最佳时间）。
- 在血液喂养前2小时，移除棉球，确保雌蚊处于饥饿状态。
- 组装两个人工血液喂食器，每个由一个倒置的宽底玻璃漏斗（直径 = 50 mm，长度 = 70 mm）和外围用工业胶密封的塑料部分构成。通过连接件将塑料管（直径 = 7 mm）连接至两个喂食器的进出口（直径 = 10 mm），用于水的流入和流出。将两个喂食器分别标记为“对照组”和“5 μM DZNep”。
- 使用市售加热元件设置喂食程序。进入“菜单”后选择“设置”，再选择“设定值”；预设程序将显示出来。选择“SP1”并将温度设定为37 °C。
注意：加热元件可确保所提供的血液维持恒定温度。可根据不同蚊虫或昆虫种类使用其他程序设置。 - 取一桶水，将加热元件完全浸入水中。
- 裁剪一块方形Parafilm膜（50 mm × 50 mm），拉伸成薄而透明的膜状，覆盖在人工喂食器底部。另裁一段Parafilm（50 mm × 10 mm），拉伸后用于密封喂食器边缘。
- 将喂食器与加热元件通过管道连接，组成完整系统。系统组装完成后，开启电源并选择“SP1”，按“Enter”键启动系统。
注意：水将被加热至37 °C，并保持该温度恒定。 - 使用温度计监测水桶中水的温度。
注意：连接件和管道有助于在整个系统中维持水的持续循环，从而确保血液温度保持在37 °C。 - 在平底托盘中加入10%次氯酸钠溶液，用于处理可能发生的血液溢出，进行去污染。
- 向一个微量离心管中加入2 ml去纤维羊血，标记为“对照组”。对另一个标记为“5 μM DZNep”的实验管重复相同操作。向“5 μM DZNep”实验管中加入6 μl DZNep储备液（见步骤1.5），轻轻翻转数次以充分混匀血液与药物。室温孵育10分钟。
- 使用移液器将2 ml对照组和实验组血液分别加入相应标记的喂食器顶部。使用后的移液器应丢弃至次氯酸钠溶液中。用黑色袋子覆盖蚊笼，并定期向笼内呼气，以促进雌蚊吸血。
- 让蚊虫吸血约30分钟。吸血完成后，关闭加热元件，取出喂食器并撕去Parafilm膜。将喂食器浸泡于次氯酸钠溶液中约5分钟，随后用去离子水充分冲洗。
- 移除喂食器后，在笼内放置含糖水的棉球，维持48小时。在笼内放置盛有水和滤纸的产卵皿，过夜以促进产卵。每个产卵皿应根据对应的实验组或对照组浓度进行标记。
- 次日取出产卵皿，在体视显微镜下观察卵的数量和结构。使用Q-colors5软件获取图像，统计卵的数量，并分析实验组与对照组之间产卵数量的差异。
注意：可采用非配对t检验判断两组间卵数差异是否显著（p ≤ 0.05）。
3. 药物对蚊虫酶抑制作用的生化测定
注意：本部分描述了一种使用DTNB作为指示剂的酶活性测定方法，用于确定DZNep对成年雄性和雌性蚊虫SAH水解酶抑制作用的影响。
- 配制 0.1 M Na2HPO4 （磷酸氢二钠）溶液，通过加入14.19 g Na2HPO4 至 1 L 的 dH2O. 接下来，配制 0.1 M NaH2PO4 （磷酸二氢钠）溶液，通过加入13.79 g NaH2PO4 至 1 L 的 dH2O.
- 滴定 0.1 M Na2HPO4 0.1 M NaH 溶液2PO4 溶液调至 pH 8.5。
注意：这将是0.1 M Na的工作储备液2HPO4 （pH 8.5） - 配制 0.1 M Na 的匀浆溶液2HPO4 （pH 8.5），通过加入 0.3% Triton X-100。
注意：匀浆液可在 4℃ 下保存 oC. - 将6.15 mg SAH（分子量 = 384.4）溶于10 ml 0.1 M Na中，配制1.6 mM SAH溶液2HPO4 (pH 8.5)
- 将 6.3 mg DTNB 溶解于 10 ml 0.1 M Na 中，配制 1.6 mM DTNB（MW = 396.4）溶液2HPO4 （pH 8.5）。新鲜配制的DTNB溶液使用前置于冰上保存。
- 配制1 mM DZNep·HCl（分子量 = 298.73）溶液：将0.3 mg DZNep溶解于1 ml dH₂O中2O. 接下来，将1 mM DZNep溶液用dH₂O稀释成一系列浓度，范围从1,000 µM至0.002 µM2O.
- 为了测定DZNep对SAH水解酶的抑制作用，制备蚊虫的粗酶提取物：将10只未吸血的成蚊在1 ml预冷的0.1 M NaH2PO4 （pH 8.5），含 0.3% Triton X-100，使用玻璃组织匀浆器匀浆。将匀浆液转移至 1.5 ml 微量离心管中。
- 在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 5 分钟。将上清液转移至洁净的 1.5 ml 微量离心管中。以上清液作为酶源用于 SAH 生化测定。
- 对于空白处理（即，不加 DZNep，不加酶），加入 50 µl 1.6 mM SAH、50 µl 1.6 mM DTNB 和 100 µl 0.1 M Na2HPO4 （pH 8.5）加入至96孔平底微孔板的各个孔中。
- 对照组（即，不加 DZNep），加入 50 µl 1.6 mM SAH、50 µl 1.6 mM DTNB、50 µl 0.1 M Na2HPO4 （pH 8.5）及50 µl酶液（来自粗提物的SAH水解酶）加入各孔中。
- 对于DZNep处理，向各孔中加入50 µl 1.6 mM SAH、50 µl 1.6 mM DTNB、50 µl 酶液以及50 µl选定浓度的DZNep。每种处理及对照设4个重复。
- 使用96孔微孔板读数仪，在405 nm波长下每隔20秒读取一次SAH酶样品的光密度（OD），持续5分钟。
- 从每个孔获得的对照组和处理组OD值中减去空白OD值。使用以下公式计算SAH水解酶活性的剩余百分比：% 剩余活性 = (处理组OD / 对照组OD) × 100。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图1 是各项检测的示意图，描述了本文所列实验步骤的各个阶段。由于本实验方案基于蚊子的不同生命阶段，因此此处详述的实验无需遵循特定顺序。用户可根据样本的可获得性，选择同时进行一项或多项检测。
图2展示了用于不成熟蚊虫发育和存活率检测的培养板设置。测试浓度和重复次数可根据用户需求和药物可获得性进行调整。在不成熟蚊虫检测中，将DZNep的1 mM储备液加入含有蚊虫的水中，以达到0.5 µM和5 µM的终浓度，同时设置不含药物的对照组孔。实验结果表明，对照组孔中存活的幼虫和蛹数量多于经DZNep处理的孔。
图3展示了DZNep对实验期间疟疾蚊虫总体存活率的影响。结果表明，表观遗传药物DZNep可抑制蚊虫的生长与发育，并导致幼蚊死亡。大多数暴露于0.5 μM药物浓度下的蚊虫在实验第10天前死亡，而暴露于5 μM浓度下的大量个体在第8天前死亡。相比之下，对照组（无药物）蚊虫的死亡率未受影响，且在实验第8天时...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
成功应用本方案有几个关键步骤。对于幼虫实验，应仔细标记并正确设置每个测试浓度的重复。随机化处理测试样品，并向相应的测试孔中加入指定量的药物，是本实验设置的重要组成部分。在加入2nd 将蚊子幼虫放入96孔微孔板时，可将每条幼虫置于纸巾上2-3秒以去除多余水分。为防止干燥，必须立即使用钝头镊子将幼虫转移至微孔板的孔中，以确保每个孔中的水体积和药物浓度符合预期。在转移幼虫以测量体长时，建议将其置于冰上数分钟，以保持其静止状态。若将本方案用于其他化合物，需注意确定加入每孔的母液量；在此类情况下，可在向各微孔板孔中加入幼虫前，直接将计算量的化合物溶于水中。
进行血液饲喂实验时，必须适当饥饿蚊虫，即在实验开始前至少2小时移除糖水。若未做到这一点，可能导致吸血不充分，进而显著影响成年雌蚊的产卵量。此外，药物在血液中的充分混匀和均匀分布也十分关键，因为DZNep需要数分钟才能完全溶解。若在药物处理后立即饲喂血液，DZNep将无法在蚊虫体内均匀分布。强烈建议使用新鲜的去纤维血（即采血日期不超过一周），以获得更佳的实验结果。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Victor Marquez 提供 DZNep.HCl，感谢 Scotty Bolling 制造了饲血装置。An. gambiae 的 Mopti 和 SUA2La 菌株由疟疾研究与参考试剂资源中心（MR4）提供。本研究工作得到了弗拉林生命科学研究所以及美国国立卫生研究院资助项目 1R21AI094289（授予 Igor V. Sharakhov）的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔微孔板 | Fisher Scientific | 12565561 | |
| 细胞培养板 | CytoOne | CC7682-7506 | |
| 离心机 | Sorvall Fresco | 76003758 | 可使用其他型号的离心机 |
| 彩色胶带卷 | Fisher | S68134 | |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| 培养皿杯 | |||
| 滤纸 | Fisher | 09-795E | |
| 玻璃饲喂器 | Virginia Tech | ||
| 玻璃组织匀浆器 | |||
| 加热元件 | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| 培养箱 | Percival scientific | I36VLC8 | 可使用其他型号的培养箱 |
| 微量离心管，2 ml | Axygen | 22-283 | |
| 微量离心管，1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| 移液器 | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH计 | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| 酶标仪 | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | 于 -20 °C 保存 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
参考文献
- CDC Report. , Available from: http://www.cdc.gov/malaria (2010).
- Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
- Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. , (2014).
- Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147(2009).
- Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
- Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).
- Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
- Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
- Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962(2014).
- Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
- Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
- Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40(2011).
- Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
- Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
- Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
- Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
