用于检测表观遗传药物对疟疾蚊虫发育、繁殖力及存活率影响的毒理学实验

摘要

本研究建立了一种检测表观遗传药物DZNep对蚊虫发育、繁殖力及存活率影响的实验方案。本文描述了将DZNep通过水相暴露处理于蚊虫未成熟阶段，以及通过血液暴露处理于成蚊阶段的方法，同时介绍了S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAH hydrolase）抑制活性的检测方法。

摘要

杀虫剂抗性对疟疾防控项目构成了重大挑战。蚊虫能够快速适应环境中的多种变化，使得疟疾防控成为热带国家普遍存在的难题。杀虫剂抗性蚊群的出现，促使人们有必要探索用于媒介蚊虫控制的新型药物靶点通路及相关化合物。表观遗传药物在癌症研究中已有广泛应用，但其对昆虫的影响尚不明确。本研究提供了一种简便的实验方案，用于评估3-Deazaneplanocin A（DZNep）——一种处于实验阶段的癌症治疗用表观遗传药物——对疟疾传播媒介Anopheles gambiae的毒理学效应。在暴露于DZNep的未成熟蚊虫中，观察到死亡率随浓度升高而增加，同时个体体型减小；该化合物还降低了成年蚊虫的生殖力，相较于对照组处理具有显著差异。此外，与对照组相比，暴露于DZNep后蚊虫体内S-腺苷高半胱氨酸（SAH）水解酶活性呈现药物依赖性下降。本实验方案为研究人员提供了一种简单、分步操作的流程，用于评估实验性药物的多种毒理学终点指标，进而展示了一种独特的多角度方法，可用于研究水溶性表观遗传药物或感兴趣化合物对媒介蚊虫及其他昆虫的毒理学效应。

引言

疟疾是全球由昆虫引起的死亡人数最多的疾病。据估计，全球每年约发生2.19亿例疟疾病例，导致约66万人死亡，其中大多数发生在非洲¹。尽管已作出多方努力，疟疾防控项目仍面临诸多挑战。虽然杀虫剂处理过的蚊帐和室内滞留喷洒是防控项目的关键组成部分，但当地蚊虫种群对杀虫剂产生的抗性阻碍了这些措施的实施²。蚊虫抗药性种群的迅速增加，主要归因于疟疾传播蚊虫能够快速适应环境变化并利用不同的生态位^3,4,5。为了克服现有的杀虫剂抗性机制，有必要探索新型杀虫靶标和下一代化合物。一种用于评估实验性杀虫剂对疟疾蚊虫不同生活阶段效果的简单、分步操作方案，将显著促进上述研究工作的开展。

药物对细胞系和动物模型作用的药理学研究，已确立了表观遗传药物作为调控细胞和生物体遗传与生理特性的有效工具。DNA甲基化和组蛋白修饰是两种表观遗传机制，可在不改变DNA序列的前提下影响多细胞生物的基因表达⁶。翻译后修饰（如甲基化）在维持细胞完整性与基因表达中发挥关键作用，并可能影响多个基本生物学过程^7,8,9。在某些昆虫物种中的研究表明，表观遗传机制在卵子发生、干细胞维持¹⁰以及剂量补偿¹¹等过程中具有重要作用。然而，这些机制在病媒生物中的相关研究仍属空白。利用化合物调控蚊虫中的这一系统，可能为发现新型杀虫剂靶向通路提供线索。3-脱氮表萘普霉素A（DZNep）是一种已知的....

方案

注意：本实验方案的三个部分分别描述了DZNep药物对幼蚊的水相暴露、通过血液暴露于成年雌蚊以研究其对生殖力的影响，以及利用简单的比色法测定DZNep对SAH水解酶的抑制作用。这些实验的示意图见图1。

1. 幼蚊发育与存活率检测

注意：本部分介绍一种影响蚊子幼虫发育和存活的水溶性药物的使用方法。

1. 孵化 A. gambiae 28 °C 下将卵置于蒸馏水（dH₂O）中₂O）并饲养至2^nd 龄幼虫
2. 取一个无DNA酶、无RNA酶的六孔细胞培养板，加入10 ml dH₂O₂O 至每孔。
3. 选择2龄蚊子幼虫^nd 龄期，每孔加入15条幼虫。加入2之前^nd 将龄期幼虫转移至培养板，置于纸巾上2-3秒以吸去多余水分。
4. 使用彩色编码胶带标记孔位以实现实验随机化。每块板上每种测试浓度标记2个孔图2).
5. 配制 1 mM DZNep 盐酸盐（分子量 = 298.73）储备液：将 0.3 mg DZNep 溶于 1 ml 去离子水中₂O. 向标记好的孔中加入 DZNep.HCl 储存液，使终浓度分别为 0.5 µM 和 5.0 µM。....

结果

图1 是各项检测的示意图，描述了本文所列实验步骤的各个阶段。由于本实验方案基于蚊子的不同生命阶段，因此此处详述的实验无需遵循特定顺序。用户可根据样本的可获得性，选择同时进行一项或多项检测。

图2展示了用于不成熟蚊虫发育和存活率检测的培养板设置。测试浓度和重复次数可根据用户需求和药物可获得性进行调整。在不成熟蚊虫检测中，将DZNep的1 mM储备液加入含有蚊虫的水中，以达到0.5 µM和5 µM的终浓度，同时设置不含药物的对照组孔。实验结果表明，对照组孔中存活的幼虫和蛹数量多于经DZNep处理的孔。

图3展示了DZNep对实验期间疟疾蚊虫总体存活率的影响。结果表明，表观遗传药物DZNep可抑制蚊虫的生长与发育，并导致幼蚊死亡。大多数暴露于0.5 μM药物浓度下的蚊虫在实验第10天前死亡，而暴露于5 μM浓度下的大量个体在第8天前死亡。相比之下，对照组（无药物）蚊虫的死亡率未受影响，且在实验第8天时.......

讨论

成功应用本方案有几个关键步骤。对于幼虫实验，应仔细标记并正确设置每个测试浓度的重复。随机化处理测试样品，并向相应的测试孔中加入指定量的药物，是本实验设置的重要组成部分。在加入2^nd 将蚊子幼虫放入96孔微孔板时，可将每条幼虫置于纸巾上2-3秒以去除多余水分。为防止干燥，必须立即使用钝头镊子将幼虫转移至微孔板的孔中，以确保每个孔中的水体积和药物浓度符合预期。在转移幼虫以测量体长时，建议将其置于冰上数分钟，以保持其静止状态。若将本方案用于其他化合物，需注意确定加入每孔的母液量；在此类情况下，可在向各微孔板孔中加入幼虫前，直接将计算量的化合物溶于水中。

进行血液饲喂实验时，必须适当饥饿蚊虫，即在实验开始前至少2小时移除糖水。若未做到这一点，可能导致吸血不充分，进而显著影响成年雌蚊的产卵量。此外，药物在血液中的充分混匀和均匀分布也十分关键，因为DZNep需要数分钟才能完全溶解。若在药物处理后立即饲喂血液，DZNep将无法在蚊虫体内均匀分布。强烈建议使用新鲜的去纤维血（即采血日期不超过一周），以获得更佳的实验结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔微孔板	Fisher Scientific	12565561
细胞培养板	CytoOne	CC7682-7506
离心机	Sorvall Fresco	76003758	可使用其他型号的离心机
彩色胶带卷	Fisher	S68134
解剖显微镜	Olympus	SZ
DTNB	Sigma Aldrich	D8130
DZNep.HCl	Sigma Aldrich	SMLO305
培养皿杯
滤纸	Fisher	09-795E
玻璃饲喂器	Virginia Tech
玻璃组织匀浆器
加热元件	Fisher Scientific	NC0520091
培养箱	Percival scientific	I36VLC8	可使用其他型号的培养箱
微量离心管，2 ml	Axygen	22-283
微量离心管，1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
移液器	Eppendorf	4910 000.069
Na2HPO4	Fisher Scientific	M-3154
NaH2PO4	Fisher Scientific	M-8643
pH计	Mettler Toledo 7easy	S20
酶标仪	Spectramax	M2
SAH	Sigma Aldrich	A9384	于 -20 °C 保存
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787