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方法文章

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

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⸱

DOI：

10.3791/52047

⸱

2015年1月12日

 ,  , 
1Cardiac Surgery, University of Michigan, 2Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine

本文内容

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摘要

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。

摘要

心脏祖细胞（CPCs）具有分化为心肌细胞、平滑肌细胞（SMC）和内皮细胞的能力，在针对心脏病的细胞治疗中具有广阔前景。在多种分离CPCs的方法中，将胚胎干细胞（ESC）分化为CPCs的方法因其可提供无限的细胞来源而在该领域受到广泛关注。因此，已开发出多种从ESC分化获得CPCs的策略。本实验方案描述了从小鼠和人ESC中分化并纯化胚胎期CPCs的方法。由于利用细胞表面标志物分离胚胎期CPCs存在困难，本方法通过构建携带荧光报告基因的ESC系，使其在CPC特异性cre重组酶表达时激活荧光信号，从而可通过荧光激活细胞分选（FACS）富集CPCs。本方案详细说明了由ESC形成拟胚体（EBs）以实现CPC定向分化与富集的操作步骤。所获得的CPCs可进一步用于心肌谱系分化及其他生物学功能检测。该方案已优化，适用于高效、稳定地从小鼠和人ESC中获得CPCs。

引言

目前，心脏病仍是全球首要死因，过去二十年中的死亡率几乎未发生变化（美国心脏协会）。迫切需要开发新的治疗策略，以有效预防或逆转心力衰竭。随着干细胞生物学的快速发展，基于细胞的治疗成为一种有前景的策略1。在此背景下，多能心脏祖细胞（CPCs）因其具有增殖能力且仅定向分化为心肌谱系，可能是该疗法的理想细胞来源。因此，建立高效且稳定的生成与分离心脏祖细胞的方法，对心脏细胞治疗研究具有重要意义。

本方案重点关注早期胚胎发育过程中鉴定出的胚胎期心脏前体细胞（CPCs）及其由胚胎干细胞（ESCs）分化生成的方法。已有多种心脏前体细胞从胚胎心脏、成体心脏甚至骨髓中分离获得。2在胚胎发育过程中，骨形态发生蛋白（BMPs）、Wnt家族成员（wingless-type MMTV integration site family members）以及Nodal信号可诱导Mesp1的定向分化。+ 多能中胚层3Mesp1+ 细胞随后分化为胚胎期CPCs4这些心脏祖细胞通常表达HCN4、NK2同源框5（Nkx2-5）、Isl LIM同源框1（Isl1）、T-box 5（Tbx5）和心肌增强因子2C（Mef2c），形成第一和第二心脏区，并在心脏发生过程中贡献于心脏的主要结构。5-10Nkx2-5+ 和 Isl1+Mef2c+ CPCs 能够分化为心肌细胞、平滑肌细胞（SMCs）和内皮细胞5-8因此，这些心脏前体细胞（CPCs）将分化为心脏血管以及心脏组织，是基于细胞的心脏治疗的理想细胞来源。因此，生成CPCs 体外 一直是心血管研究的主要课题。由于胚胎干细胞（ESCs）具有无限增殖能力，并代表囊胚阶段的内细胞团（ICM）细胞，因此通过模拟自然胚胎发育过程将ESCs分化为胚胎期心脏前体细胞（CPCs），被认为是获取CPCs的合理且有效的方法。

从胚胎干细胞（ESCs）获得心前体细胞（CPCs）的一种广泛应用的方法是将ESCs聚集成拟胚体（EBs）11。为了提高分化效率，研究人员基于心脏发育的知识，使用了明确的化学物质和生长因子12-14。然而，目前尚无被领域内广泛接受的明确CPC标志物，尤其是缺乏公认的细胞表面标志物。为解决这一问题，可通过Cre/loxP系统对ESCs进行基因工程改造，使其在Isl1+或Mef2c+ CPC及其衍生物中表达荧光报告基因。具体方法是将cre重组酶基因敲入到Isl1/Mef2c启动子/增强子的控制之下。当cre重组酶切除flox-stop密码子后，可在组成型启动子驱动下激活修饰后的荧光蛋白RFP或YFP基因（如ISL1:cre;pCAG-flox-STOP-flox-GFP或RFP/Isl1-cre;Rosa26YFP/Mef2c-cre;Rosa26YFP）5,6。一旦ESCs分化为第二心区CPCs，由Isl1/Mef2c启动子/增强子驱动的cre即可激活荧光报告基因，从而通过流式细胞术（FACS）富集CPCs。简而言之，本方案采用拟胚体聚集体方法启动ESCs的分化；为提高分化效率，对分化细胞施加抗坏血酸（AA）以及Bmp4、Activin A和Vegf等生长因子处理13,15。该方案可高效、稳定地实现小鼠和人源ESCs向CPC的分化。

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方案

1. 从小鼠ESC诱导小鼠胚胎CPC

  1. 准备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层。
    1. 将MEF培养基（含10% FBS的DMEM）预热至37 °C。
    2. 准备明胶包被的培养板。
      1. 向6孔板的每个孔中加入1 ml 0.1%明胶水溶液，或向10 cm培养皿中加入5 ml。
      2. 将培养板或培养皿置于37 °C或室温下至少30分钟。使用前吸除明胶溶液。
    3. 在37 °C水浴中快速解冻经辐照处理的MEFs，并轻轻摇动。
    4. 轻柔地将细胞转移至15 ml或50 ml锥形管中，加入5 ml预热的MEF培养基，缓慢混匀后在200 × g条件下离心5分钟。
    5. 用MEF培养基重悬细胞并计数活细胞。接种时使用以下体积的MEF培养基：6孔板每孔2 ml，10 cm培养皿10 ml。
    6. 以每板/皿1–2 × 106的密度将细胞接种至6孔板或10 cm培养皿中。
    7. 将MEF培养板/皿置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育至少24小时后使用。
      注意：超过一周的MEF培养板/皿应弃用。
  2. 准备小鼠胚胎干细胞（ESCs）
    1. 将Isl1-cre; Rosa26YFP/ Mef2c-cre; Rosa26YFP小鼠ESCs在MEFs上培养至约90%汇合度。使用以下成分配制ES细胞培养基：410 ml DMEM、75 ml FBS、0.1 mM MEM NEAA、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM丙酮酸钠、100 U青霉素/链霉素和0.1 mM β-巯基乙醇。
    2. 按照步骤1.1.2所述方法准备明胶包被的6孔板。
    3. 吸除培养板中的培养基，并用DPBS清洗细胞。
      1. 吸除DPBS，向6孔板的一个孔中加入0.4 ml 0.25%胰蛋白酶，于37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟。加入1 ml预热的ES培养基以终止胰酶反应。
    4. 收集细胞并在200 × g条件下离心，吸除上清液。用1 ml ES细胞培养基重悬细胞并进行计数。
    5. 以3 × 104/cm2的密度将ESCs接种至明胶包被的培养板上，于37 °C、5% CO2条件下培养约2天，直至细胞达到约90%汇合度。每天更换培养基。
    6. 当ESCs达到90%汇合度时，重复步骤1.2.2–1.2.5，以彻底去除MEF饲养层。
  3. 通过拟胚体（EB）形成诱导心前体细胞（CPC）分化
    1. 配制分化培养基：36 ml IMDM、12 ml Ham’s F12、2 mM L-谷氨酰胺、0.34 ml BSA（7.5%）、0.25 ml N2、0.5 ml B27、50 µg/ml抗坏血酸（AA）和0.45 mM 1-巯基甘油。
    2. 吸除细胞培养基，并用DPBS清洗。吸除DPBS后，向6孔板的一个孔中加入0.4 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C条件下孵育5分钟。
    3. 加入1 ml分化培养基终止反应，并反复吹打使细胞团块分散为单细胞。
    4. 将ESCs在200 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
      1. 用1 ml分化培养基重悬1 × 106个ESCs，计数后将细胞以1 × 105个细胞/ml的浓度接种于低吸附培养皿中，于37 °C进行初次EB聚集培养。
    5. EB形成两天后，将EB从培养皿转移至50 ml离心管中，在200 × g条件下离心1分钟。弃去上清液，并用10 ml不含Ca2+和Mg2+的DPBS清洗EB一次。
    6. 吸除DPBS，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。加入4.5 ml分化培养基终止反应，并反复吹打使EB解离为单细胞。
    7. 在200 × g条件下离心细胞5分钟，吸除上清液后用1 ml分化培养基重悬细胞。
    8. 计数细胞后，将2 × 106个细胞稀释至1 × 105个细胞/ml的浓度于分化培养基中。向培养基中加入VEGF、Bmp4和Activin A，使其终浓度分别为5 ng/ml、0.8 ng/ml和5 ng/ml。将细胞接种于培养皿中，在37 °C进行第二次EB形成。
    9. 第二次EB形成40小时后，将EB转移至50 ml离心管中，用DPBS清洗一次，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶于37 °C消化5分钟，并反复吹打使EB解离为单细胞。
    10. 用含5 ng/ml VEGF、10 ng/ml bFGF和12.5 ng/ml FGF10的Stempro-34培养基重悬细胞，以2 × 105/cm2的密度接种于明胶包被的培养板中。在37 °C培养箱中继续培养约32小时，随后进行CPC分离。
  4. 分离小鼠心前体细胞（mCPCs）
    1. 吸除培养基并用DPBS清洗。向培养板中加入0.5 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。加入4.5 ml分化培养基终止反应，并反复吹打使细胞解离为单细胞。离心收集细胞后，用含2% FBS的PBS重悬细胞，用于FACS纯化。
    2. 将未分化的ESCs上样至分选仪作为阴性对照。调节电压以调整前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），选择目标细胞群。利用前向散射对侧向散射图以及前向散射高度对宽度图排除碎片和双联体。在选定的亚群中，根据ESCs对照的分布情况，在直方图中设定YFP阳性门控以消除细胞自发荧光。从YFP+门控中收集YFP+ CPCs。
    3. 将纯化的CPCs（YFP+细胞）接种至6孔板中，使用分化培养基（见步骤1.3.1），在37 °C继续培养3–5天，以诱导CPCs分化为心肌细胞和SMCs。

2. 由人胚胎干细胞衍生人心脏祖细胞

  1. 准备饲养层细胞
    1. 按上述方法制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层，密度为 2 × 104/cm2。
  2. 维持人胚胎干细胞（hESCs）
    1. 常规在MEF上使用标准hESC培养基（Knockout DMEM/F-12 385 ml、Knockout SR 100 ml、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM NEAA、0.1 mM β-巯基乙醇、10 ng/ml基础FGF）维持人ISL1:cre;pCAG-flox-STOP-flox-GFP或RFP ESCs。在进行心脏分化前，将人ESCs转移至无饲养层条件下培养至少2代。
  3. 在无饲养层条件下准备人ESCs
    1. 准备用于人ESCs培养的包被培养板。
      1. 在4 °C过夜解冻Matrigel。将一个50 ml离心管置于冰上，并向管中加入30 ml冷的DMEM/F12培养基。
      2. 向冷培养基中加入1 ml Matrigel，充分混匀。将1 ml冷的Matrigel-DMEM/F12混合液加入6孔板的一个孔中，或5 ml加入10 cm培养皿中。
      3. 将培养板/培养皿置于4 °C过夜或室温放置2小时。使用前吸除液体。
    2. 将人ESCs传代至上述包被板中：吸除MEF培养板中的培养基，用DPBS冲洗人ESCs。然后向6孔板的一个孔中加入1 ml分散酶（1 mg/ml）。将细胞置于37 °C培养箱中孵育，直至克隆边缘开始脱落。
    3. 移除分散酶溶液，用DPBS冲洗两次，然后向每孔加入2.5 ml mTeSR培养基或MEF条件培养基。
    4. 使用细胞刮刀刮取细胞，并轻轻吹打使hESC克隆分散为小细胞团块。
    5. 将ESCs细胞团块转移并按1:3比例稀释接种至包被板中。
    6. 每孔加入2 ml mTeSR培养基或MEF条件培养基，并每日更换培养基。
    7. 在包被板上使用mTeSR培养基或MEF条件培养基培养人ESCs至少2代。
  4. 诱导人ESCs向心前体细胞（CPC）分化
    1. 当细胞融合度约为90%时，吸除培养基并用DPBS冲洗。随后将hESCs在含0.5 mg/ml分散酶的溶液中于37 °C孵育20分钟。
    2. 用DPBS冲洗hESCs两次，使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，然后将细胞团块重悬于分化培养基（DMEM/F12含18% FBS、0.1 mM NEAA、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM β-巯基乙醇和50 µg/ml抗坏血酸）中。
    3. 将细胞转移至6孔超低吸附培养板中以形成拟胚体（EB）。
    4. 次日更换分化培养基。
    5. 每3天更换一次培养基，并维持EB悬浮培养。
  5. 分离人CPCs（hCPCs）
    1. 在分化第9天或之前收集EB，用于人CPC的分离。
    2. 吸除培养基，用DPBS冲洗EB两次。向6孔板每孔加入0.5 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C作用5分钟。
    3. 加入等体积的分化培养基终止反应。反复吹打使EB解离为单细胞。以200 × g离心5分钟收集细胞，重悬于含2% FBS的DPBS中。用40 µm细胞筛过滤，然后按照1.4.3节所述方法通过FACS分选RFP+ CPC细胞。
    4. 将分选后的hCPCs接种至明胶包被的培养板上。在分化培养基中培养7–9天，使其分化为心肌细胞和平滑肌细胞。接种7天后，改用含5% Knockout SR的DMEM/F12培养基继续培养已分化细胞。

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结果

本方案展示了从多种胚胎干细胞系中诱导获得心前体细胞（CPCs）的方法。通过将胚胎干细胞（ESCs）聚集成胚状体（EBs），使其分化为心前体细胞。ESCs通常在MEF饲养层上常规培养（图1A, F），在诱导分化前需去除饲养层。将ESCs在分化培养基中聚集形成EBs（图1B, G）后，对形成的EBs使用Bmp4和Activin A处理，以促进小鼠细胞系中中胚层的分化（图1C）。通过荧光蛋白YFP/RFP的表达可识别ESCs向心肌谱系的分化情况（图1D）。CPCs通过流式细胞分选（FACS）进行纯化（图1H），随后进一步培养以分化为心肌细胞和平滑肌细胞。cTnT和SM-MHC的染色结果表明CPCs具有向心肌细胞和平滑肌细胞分化的潜能（图1 E,I,J）。通常，从小鼠ESCs分化方案中可获得80–90%的CPCs，而从人ESCs分化方案中可获得0.5–5%的CPCs。

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讨论

该方案结合了使用生长因子引导小鼠胚胎干细胞（mESCs）分化以及人胚胎干细胞（hESCs）自发分化为心前体细胞（CPCs）的方法。利用带有荧光报告基因标记的CPC谱系，可通过流式细胞术（FACS）高效地识别和分离CPCs。经FACS纯化的CPCs仍具有分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的能力，并且其基因表达谱与体内来源的细胞相似。因此，由于这些CPCs能够形成心肌组织和血管结构，可成为基于细胞的心脏治疗的重要资源。

本方案中的一个关键步骤是在体外分化过程中确定获得高纯度和高产量心肌前体细胞（CPCs）的正确时间点。许多因素（例如，血清批次、细胞系、等）可能影响多能干细胞向CPCs的分化。强烈建议进行预实验，以优化分化条件并确定分离CPCs的合适时间窗口。

本方案中，CPC 的纯化依赖于由组织特异性 cre 重组酶激活的荧光报告基因。报告基因的特异性取决于心血管前体细胞标志物启动子以及 cre 重组酶的保真度。近年来，基因组编辑工具（如 CRISPR/Cas9 系统）的发展使得在 ESCs ...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

感谢 Leonid Gnatovskiy 博士对本文的细致审阅和宝贵意见。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（HL109054）和密歇根大学 Samuel 和 Jean Frankel 心血管中心（启动基金）对 WZ 的资助，以及纽约大学医学院 Leon H Charney 心脏病学部对 BL 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FBSThermo ScientificSH30070.03E
Knockout SRLife Technology10828028
Knockout DMEMLife Technology10829018
DMEMLife Technology11965118
NEAALife Technology11140050
GlutaMAXLife Technology35050061
N2Life Technology17502048
B27Life Technology12587010
Ham’s F12Life Technology11765062
IMDMLife Technology12440061
Pen/StrepLife Technology15140122
PyruvateLife Technology11360070
DispaseLife Technology17105041
Stempro-34Life Technology10639011
DMEM/F12Life Technology11330032
BSA Life Technology15260037
Trypsin Life Technology25200056
Ascobic Acid SigmaA5960
1-ThioglycerolSigmaM1753
2-MercaptoethanolSigmaM3148
VEGFR&D293-VE
Bmp4R&D314-BP
ActivinAR&D338-AC
bFgfR&D233-FB
Fgf10R&D345-FG
mTeSRStemcell Technologies5850
MatrigelBD Biosciences354277

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Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 8/10/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

The following author is now listed as a co-corresponding author:

Lei Bu

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