从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

摘要

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。

摘要

心脏祖细胞（CPCs）具有分化为心肌细胞、平滑肌细胞（SMC）和内皮细胞的能力，在针对心脏病的细胞治疗中具有广阔前景。在多种分离CPCs的方法中，将胚胎干细胞（ESC）分化为CPCs的方法因其可提供无限的细胞来源而在该领域受到广泛关注。因此，已开发出多种从ESC分化获得CPCs的策略。本实验方案描述了从小鼠和人ESC中分化并纯化胚胎期CPCs的方法。由于利用细胞表面标志物分离胚胎期CPCs存在困难，本方法通过构建携带荧光报告基因的ESC系，使其在CPC特异性cre重组酶表达时激活荧光信号，从而可通过荧光激活细胞分选（FACS）富集CPCs。本方案详细说明了由ESC形成拟胚体（EBs）以实现CPC定向分化与富集的操作步骤。所获得的CPCs可进一步用于心肌谱系分化及其他生物学功能检测。该方案已优化，适用于高效、稳定地从小鼠和人ESC中获得CPCs。

引言

目前，心脏病仍是全球首要死因，过去二十年中的死亡率几乎未发生变化（美国心脏协会）。迫切需要开发新的治疗策略，以有效预防或逆转心力衰竭。随着干细胞生物学的快速发展，基于细胞的治疗成为一种有前景的策略¹。在此背景下，多能心脏祖细胞（CPCs）因其具有增殖能力且仅定向分化为心肌谱系，可能是该疗法的理想细胞来源。因此，建立高效且稳定的生成与分离心脏祖细胞的方法，对心脏细胞治疗研究具有重要意义。

本方案重点关注早期胚胎发育过程中鉴定出的胚胎期心脏前体细胞（CPCs）及其由胚胎干细胞（ESCs）分化生成的方法。已有多种心脏前体细胞从胚胎心脏、成体心脏甚至骨髓中分离获得。²在胚胎发育过程中，骨形态发生蛋白（BMPs）、Wnt家族成员（wingless-type MMTV integration site family members）以及Nodal信号可诱导Mesp1的定向分化。⁺ 多能中胚层³Mesp1⁺ 细胞随后分化为胚胎期CPCs⁴这些心脏祖细胞通常表达HCN4、NK2同源框5（Nkx2-5）、Isl LIM同源框1（Isl1）、T-box 5（Tbx5）和心肌增强因子2C（Mef2c），形成第一和第二心脏区，并在心脏发生过程中贡献于心脏的主要结构。^5-10Nkx2-5⁺ 和 Isl1⁺M....

方案

1. 从小鼠ESC诱导小鼠胚胎CPC

1. 准备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层。
   1. 将MEF培养基（含10% FBS的DMEM）预热至37 °C。
   2. 准备明胶包被的培养板。
      1. 向6孔板的每个孔中加入1 ml 0.1%明胶水溶液，或向10 cm培养皿中加入5 ml。
      2. 将培养板或培养皿置于37 °C或室温下至少30分钟。使用前吸除明胶溶液。
   3. 在37 °C水浴中快速解冻经辐照处理的MEFs，并轻轻摇动。
   4. 轻柔地将细胞转移至15 ml或50 ml锥形管中，加入5 ml预热的MEF培养基，缓慢混匀后在200 × g条件下离心5分钟。
   5. 用MEF培养基重悬细胞并计数活细胞。接种时使用以下体积的MEF培养基：6孔板每孔2 ml，10 cm培养皿10 ml。
   6. 以每板/皿1–2 × 10⁶的密度将细胞接种至6孔板或10 cm培养皿中。
   7. 将MEF培养板/皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育至少24小时后使用。
      注意：超过一周的MEF培养板/皿应弃用。
2. 准备小鼠胚胎干细胞（ESCs）
   1. 将Isl1-cre; Rosa26YFP/ Mef2c-cre; Rosa26YFP....

结果

本方案展示了从多种胚胎干细胞系中诱导获得心前体细胞（CPCs）的方法。通过将胚胎干细胞（ESCs）聚集成胚状体（EBs），使其分化为心前体细胞。ESCs通常在MEF饲养层上常规培养（图1A, F），在诱导分化前需去除饲养层。将ESCs在分化培养基中聚集形成EBs（图1B, G）后，对形成的EBs使用Bmp4和Activin A处理，以促进小鼠细胞系中中胚层的分化（图1C）。通过荧光蛋白YFP/RFP的表达可识别ESCs向心肌谱系的分化情况（图1D）。CPCs通过流式细胞分选（FACS）进行纯化（图1H），随后进一步培养以分化为心肌细胞和平滑肌细胞。cTnT和SM-MHC的染色结果表明CPCs具有向心肌细胞和平滑肌细胞分化的潜能（图1 E,I,J）。通常，从小鼠ESCs分化方案中可获得80–90%的CPCs，而从人ESCs分化方案中可获得0.5–5%的CPCs。

讨论

该方案结合了使用生长因子引导小鼠胚胎干细胞（mESCs）分化以及人胚胎干细胞（hESCs）自发分化为心前体细胞（CPCs）的方法。利用带有荧光报告基因标记的CPC谱系，可通过流式细胞术（FACS）高效地识别和分离CPCs。经FACS纯化的CPCs仍具有分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的能力，并且其基因表达谱与体内来源的细胞相似。因此，由于这些CPCs能够形成心肌组织和血管结构，可成为基于细胞的心脏治疗的重要资源。

本方案中的一个关键步骤是在体外分化过程中确定获得高纯度和高产量心肌前体细胞（CPCs）的正确时间点。许多因素（例如，血清批次、细胞系、等）可能影响多能干细胞向CPCs的分化。强烈建议进行预实验，以优化分化条件并确定分离CPCs的合适时间窗口。

本方案中，CPC 的纯化依赖于由组织特异性 cre 重组酶激活的荧光报告基因。报告基因的特异性取决于心血管前体细胞标志物启动子以及 cre 重组酶的保真度。近年来，基因组编辑工具（如 CRISPR/Cas9 系统）的发展使得在 ESCs .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FBS	Thermo Scientific	SH30070.03E
Knockout SR	Life Technology	10828028
Knockout DMEM	Life Technology	10829018
DMEM	Life Technology	11965118
NEAA	Life Technology	11140050
GlutaMAX	Life Technology	35050061
N2	Life Technology	17502048
B27	Life Technology	12587010
Ham’s F12	Life Technology	11765062
IMDM	Life Technology	12440061
Pen/Strep	Life Technology	15140122
Pyruvate	Life Technology	11360070
Dispase	Life Technology	17105041
Stempro-34	Life Technology	10639011
DMEM/F12	Life Technology	11330032
BSA	Life Technology	15260037
Trypsin	Life Technology	25200056
Ascobic Acid	Sigma	A5960
1-Thioglycerol	Sigma	M1753
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
VEGF	R&D	293-VE
Bmp4	R&D	314-BP
ActivinA	R&D	338-AC
bFgf	R&D	233-FB
Fgf10	R&D	345-FG
mTeSR	Stemcell Technologies	5850
Matrigel	BD Biosciences	354277