从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。
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摘要
摘要
骨骼肌的修复与再生依赖于卫星细胞的作用，这些细胞是定居在肌肉中的干细胞。可通过酶消化法从人体肌肉活检样本中分离卫星细胞，并在体外培养中研究其成肌特性。从酶消化过程中获得的两种主要贴壁细胞类型在数量上分别为：（i）卫星细胞（称为成肌细胞或肌肉前体细胞），最初通过CD56鉴定；+ 以及随后的CD56+/结蛋白+ 细胞和（ii）源自肌肉的成纤维细胞，鉴定为CD56– 和 TE-7+成纤维细胞在培养中增殖效率很高，在混合细胞群体中可能过度生长并取代肌源性细胞，从而成为培养物中的优势细胞。因此，在研究各类细胞在培养中固有行为时，从人肌肉组织中分离和纯化不同类型细胞是一个重要的方法学考量。本文描述了一种基于温和酶解的细胞分选系统，即使用胶原酶和中性蛋白酶对细胞进行消化，随后采用磁性激活细胞分选技术（MACS），该方法可同时实现高纯度（>95% 成肌细胞）且产量良好（约 2.8 x 106 ± 8.87 × 105 细胞/克组织，7天后 体外) 用于培养实验。该方法基于将混合的肌肉来源细胞群体与连接有抗CD56抗体的磁性微珠孵育，随后使细胞通过磁场。CD56+ 被微珠标记的细胞被磁场滞留，而CD56– 细胞可不受阻碍地流经层析柱。分选过程任意阶段的细胞悬液均可接种并进行培养。在特定干预处理后，可通过特异性抗体进行免疫荧光标记，并结合图像处理与分析软件，对细胞形态以及包括核转录因子在内的蛋白质表达与定位进行定量分析。
引言
骨骼肌的修复与再生依赖于卫星细胞1的作用，即成肌干细胞2,3。体内这些细胞处于可逆的静息状态，位于每条肌纤维的肌膜与基底膜之间；当肌肉组织受损、修复和再生时，它们被激活，进而增殖、融合并分化3。可通过酶消化法从年轻和老年个体的人体肌肉活检样本中分离卫星细胞4，并在原代培养中进一步研究其成肌特性5。该分离过程的效率，包括细胞群体的得率和纯度，取决于所采用的方法，且在不同样本间可能存在差异。酶消化后获得的两种主要贴壁细胞类型为卫星细胞（现称为成肌细胞或肌肉前体细胞），最初被鉴定为CD56+/desmin阳性细胞；以及来源于肌肉的成纤维细胞，被鉴定为CD56–、TE7+细胞5。成纤维细胞具有快速增殖能力，且在细胞间接触时不会像成肌细胞那样发生不可逆的生长停滞和终末分化；因此，在混合细胞群体中，成纤维细胞可能过度生长并占据培养体系的主导地位。
成纤维细胞常常被视为肌肉生物学家的困扰，然而，目前人们越来越关注成纤维细胞本身作为独立研究对象的价值，尤其是研究发现它们在肌肉修复过程中与成肌细胞具有协同作用6。因此，在研究这两种细胞在体外培养中的固有行为时，从人类肌肉组织中分离和纯化不同细胞类型便成为一项重要的方法学考量。荧光激活细胞分选（FACS）是一种可用于分选细胞以进行后续研究和/或计数与分析的技术。FACS已被证明能够可靠地富集人类成肌细胞，但迄今为止，用于后续培养的细胞产量仍较低7。鉴于体细胞（如卫星细胞来源的成肌细胞）增殖潜能有限，且衰老相关的增殖与分化能力显著下降4，因此需要更为温和的技术手段。单根肌纤维培养提供了另一种较为温和的方法，可用于获取仍处于其亚膜龛位的小鼠卫星细胞，以及在体外激活后的卫星细胞8,9。然而，这种方法通常难以应用于人类肌肉活检样本（因为极少能获得从肌腱到肌腱的完整肌纤维），这意味着许多致力于研究人类肌肉来源细胞的研究实验室可能无法采用该技术。此外，单纤维培养所能提供的细胞数量极为有限。
本文介绍一种基于温和酶消化的细胞分选系统，首先使用胶原酶和分散酶对细胞进行消化，随后进行两轮连续的磁性激活细胞分选（MACS），可获得高纯度（>95% 成肌细胞）和高得率（约 2.8 × 106 ± 8.87 × 105 个细胞/克组织），适用于体外培养实验。CD56 被认为是原位（in situ10）和体外（in vitro11）鉴定人卫星细胞的金标准表面标志物，是磁珠结合的理想候选表面标记。在此方法中，与含铁氧化物和多糖的超顺磁性磁珠偶联的 CD56 抗体与细胞结合后，将细胞悬液通过置于强磁场中的高梯度磁性细胞分离柱12,13。分离柱内填充有铁磁性钢丝绒或铁球基质，可将磁力线聚焦至其表面，从而产生强磁梯度（约 4 特斯拉）14。在此类柱中，即使弱磁性的细胞也会被吸引并吸附至柱表面14。未结合的细胞（CD56‒）流过分离柱，而被磁性微珠标记的 CD56+ 细胞则被保留在柱内，直至移出磁场后被洗脱收集12,15。
分选过程任一阶段的细胞悬液均可按所需密度接种，用于后续实验。在特定干预处理后，可利用免疫细胞化学方法鉴定细胞成分，通过宽场或共聚焦荧光显微镜成像，并采用图像分析方法进行定量分析，该方法可对任意给定图像中所有标记细胞进行快速、客观的测量。在本实验室中，我们已采用这种双重免疫磁珠分选结合图像分析的方法16，证明CD56–人成纤维细胞可高效转分化为脂肪细胞，而起源于卫星细胞的成肌细胞则对这种脂肪生成转化具有高度抗性5。
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方案
注意：在我们实验室开展的研究中，所有受试者均签署了书面知情同意书，同意参与研究；所有实验均获得英国国家卫生服务伦理委员会（伦敦研究伦理委员会；编号：10/H0718/10）的批准，并遵循《人体组织法》和《赫尔辛基宣言》的规定进行。
1. 肌肉活检前的初始准备（15 分钟）
- 配制人骨骼肌生长培养基。取一个无菌的50 ml锥形离心管，加入2.5 ml补充剂混合液、10 ml胎牛血清、抗生素（青霉素/链霉素）和谷氨酰胺至相应终浓度（表1），然后用骨骼肌基础培养基定容至50 ml。
- 取15 ml骨骼肌基础培养基加入无菌的20 ml锥形离心管中并称重。称重后将该管置于冰上，用于接收人肌肉组织样本。
- 在另一个20 ml离心管中，用骨骼肌基础培养基溶解胶原酶D和分散酶II的储备液，配制成终浓度均为2 mg/ml的酶解液，总体积为10 ml。通过0.22 μm滤器过滤除菌。将无菌酶混合液置于37 °C孵箱或水浴中预热15分钟。
注意：该酶混合液比胰蛋白酶更温和，更有利于维持细胞活力17。 - 准备一个培养皿和一对无菌手术刀备用。
2. 肌肉活检操作流程（45 分钟至 1 小时）
- 在招募参与者之前，须从所有相关管理机构、委员会和医疗保健提供方获得完整的伦理审批和程序许可（包括对实验人员进行相关疫苗接种）例如， 伦理的、机构的、政府的 等等。).
- 在腿部周围建立无菌区域（例如，使用无菌手术单覆盖，并用抗菌消毒剂（氯己定）彻底清洁活检部位周围的区域。
- 在志愿者腿部股外侧肌筋膜表面的皮下区域局部注射2%利多卡因，以麻醉拟进行活检的部位。
- 使用无菌手术刀经皮肤和筋膜切开约5 mm宽的切口，并进行Bergström针芯活检操作18 通过附加吸力。
- 使用无菌镊子将肌肉从针管中取出，并立即浸入冰上的基础培养基中。应尽快将组织运送至实验室进行后续处理，尽管在24小时或更长时间后仍可获得有活力的成肌细胞。
- 向受试者说明情况，用多条无菌粘性皮肤闭合胶带清洁并封闭切口部位，并以无菌方式覆盖外层防水敷料。
3. 分离肌肉来源的前体细胞（1小时30分钟）
- 取出含有肌肉样本的离心管并称重（用纸巾擦拭以确保管外干燥）。通过从含有培养基和样本的离心管重量中减去仅含培养基的离心管重量，计算出肌肉样本的净重。
- 轻轻旋转溶液数次，以清洗肌肉样本上的血液。室温下静置30-60 秒，使肌肉沉淀。
- 使用电子移液器或抽吸装置移除管中大部分培养基，但保留约2-3 ml液体。
- 将离心管倒置于无菌培养皿上，使残留液体将肌肉样本转移至培养皿中；使用无菌手术刀取出任何残留的肌肉碎片。旋转培养皿以充分收集剩余液体，并用移液器吸除。去除所有可见的脂肪或结缔组织。
- 对于重量为100-400 mg的活检样本，加入3 ml预热的酶溶液，并使用无菌手术刀将肌肉样本切成极小的碎片（<1-2 mm3）。
- 使用宽口25 ml移液管吸取肌肉碎片和酶溶液，转移至无菌10 ml锥形管中。用额外的3-5 ml胶原酶和分散酶溶液冲洗培养皿，并使用较小的10 ml移液管收集残留的肌肉碎片，一并放入锥形管中。具体体积无需精确。
- 将离心管置于37 °C培养箱（或水浴）中孵育60分钟，每隔15分钟用10 ml移液管吹打混匀一次（trituration）。
- 1小时后，加入等体积的新鲜预热生长培养基以终止酶解反应，然后将细胞悬液通过100 μm滤网，以去除较大的肌纤维碎片。将过滤后的细胞溶液在室温（20-25 ˚C）下以657 × g离心6分钟。
- 将细胞沉淀重悬于5-7 ml生长培养基中，接种至未包被的T-25组织培养瓶中。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养7天，每48小时更换一次培养基。此阶段肌源性细胞体积较小、呈圆形，难以与非肌源性细胞区分。
- 首次换液时，将上清液离心以收集未贴壁细胞。将沉淀重悬于新鲜培养基中，重新接种。
- 培养7天后，确保大多数肌源性细胞（以及成纤维细胞）已贴壁，但尚未达到汇合状态。纯化肌源性前体细胞，并根据Gherardi和Chazaud实验室最初建立并由我们进一步优化的方案19,205进行磁珠分选（MACS）。
4. 基于CD56表达的免疫磁珠细胞分选（1.5小时）
- 7天后，冲洗细胞单层（此时通常含有50-60%的成肌细胞）5用室温磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，以去除分离过程中残留的非黏附细胞和碎片。
- 消化细胞（使用含 Ca²⁺ 的 0.04% 胰蛋白酶）2+在含0.73 mM EDTA的无钙镁PBS中孵育3分钟。待细胞脱落后，加入5-10 ml骨骼肌生长培养基以防止过度消化。在室温（20-25 ˚C）下以657 × g离心6分钟收集细胞，弃上清后用适量完全培养基重悬，用于细胞计数。
- 使用所需方法对细胞悬液的小样进行计数（例如， 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并计算起始细胞数量和细胞活力。
- 在96孔板中接种若干孔（必要时可使用更大的容器），用于在分选前通过免疫细胞化学或基于流式细胞术的方法对细胞群体进行表征（其中成纤维细胞和成肌细胞将是最丰富的细胞类型）。
- 向细胞悬液中加入15 ml无菌PBS以稀释细胞和培养基。再次离心细胞，并将其重悬于170 µl室温分选缓冲液（含1% BSA的MACS洗涤液，经0.22 µm滤器过滤除菌）中。
- 加入35 μl充分混匀的与CD56一抗（克隆号AF12-7H3，130-050-401）偶联的磁性微珠至细胞悬液中，用移液器混匀，于4 ˚C孵育15分钟，孵育至一半时间时轻轻振荡混匀。
- 孵育后，用10 ml MACS分选缓冲液稀释细胞与磁珠混合液，657 × g离心6 min。将细胞重悬于1 ml分选缓冲液中。
- 将MACs分离器（磁铁）放入MACS固定架中。由于磁场较强，安装磁铁时需小心操作。将分选柱插入支架，并安装预分离滤器。用移液器吸取1 ml分选缓冲液通过预分离滤器和分选柱，以进行润滑。
- 紧接着，轻轻混匀细胞悬液，并将全部1 ml液体通过预分离滤器滴入层析柱中。
- 用1 ml（或500 μl）溶液洗涤柱子三次 缓冲液进行分选。在第一次分选时，将未滞留并通过柱子的细胞收集到含有少量培养基的无菌50 ml锥形管中。这些细胞为第一次分选获得的CD56– 组分将高度富集结缔组织成纤维细胞。洗涤过程中切勿让柱子干燥。
- 洗涤后，移除预分离滤器，并向柱中加入 2.5 ml MACS 缓冲液。随后立即从磁铁上取下柱子 并收集首次分选的CD56+ 将组分收集到另一个50 ml圆锥形管中，方法是将柱塞推入层析柱顶部。
注意：推杆与柱子顶部的配合非常紧密，操作时可能较为困难；然而，必须在柱子仍充满缓冲液的情况下进行操作，因此需要迅速完成。避免用力过猛或过快地按压推杆。 - 铺板前，使用台盼蓝染色法等方法评估细胞活力。从8个1 mm区域确定活细胞百分比。2 计数区域（血细胞计数板的两个计数室）。
注意：根据所需的纯度，细胞可进行单次或两次分选。若操作得当，这些细胞对两次分选过程耐受性良好，存活率很高 >95%. 对于双次分选，设置另一列， 用1 ml分选缓冲液润滑，并从步骤4.6继续操作。- 若需进行成像，可将细胞直接接种于置于24孔板中的玻璃盖玻片上21 并用您选择的细胞外基质分子包被，以促进细胞黏附（例如 胶原蛋白或层粘连蛋白）。此处使用 0.1–0.5 mg/ml 的 I 型胶原蛋白（collagen-I）表3).
5. 分离后立即分选人肌肉来源的成纤维细胞。
- 为在分离后立即纯化成纤维细胞前体细胞，请采用上述方案，并作如下修改：
- 分离后立即将细胞重悬于完全培养基中，先通过100 µm细胞筛过滤一次，再通过40 µm细胞筛过滤一次。加入5 ml PBS，以657 × g离心6分钟。
- 将细胞重悬于MACS分选缓冲液中，加入抗人成纤维细胞微珠，室温孵育15–30分钟。
- 使用LS柱和Midi-MACS分离器（表3），并安装40 µm预分选滤器。
- 根据所需纯度进行一次或两次分选，尽快将细胞转移至含血清的培养基中，进行细胞计数，并以所需密度接种。
6. 免疫细胞化学染色（1天及过夜）。
- 在冰上预冷的 PBS 中加入等体积的 8% 多聚甲醛，轻轻振荡孵育 10 分钟，对细胞进行原位固定。10 分钟后吸除固定液，并用 PBS 洗涤两次。
- 如需对细胞表面抗原进行免疫染色，先用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 封闭细胞至少 1 小时，然后加入相应的一抗（表 4）。
- 对于细胞内抗原，在固定后加入含 0.2% Triton-X 100、1% BSA 和 0.01% NaN3 的 PBS 溶液，孵育 10 分钟以通透细胞，随后进行封闭并加入一抗。所有一抗孵育步骤均在室温（或 4 °C）下于摇床上轻轻振荡孵育过夜。
- 去除未结合的一抗，用冷 PBS 洗涤细胞三次。室温下加入种属特异的荧光标记二抗（表 4）孵育 1 小时。
- 去除未结合的二抗后，用 PBS 更换三次洗涤细胞，然后在摇床上加入 1 μg/ml 的荧光 DNA 染料 Hoechst 33342 溶液，孵育 10 分钟进行复染。
- 如需同时观察细胞表面抗原和细胞内抗原，应首先使用针对细胞表面抗原的一抗及其相应的二抗进行染色。随后，用冷 PFA 再次固定细胞，进行通透、封闭，并加入针对胞质或核内抗原的一抗，再使用相应的二抗进行染色。
- 染色完成后，用弯头镊子将盖玻片从孔中取出，用蒸馏水冲洗盖玻片背面。将盖玻片细胞面朝下置于载玻片上的抗荧光淬灭封片剂液滴中22。
7. 细胞油红O染色与免疫荧光染色联合应用（2小时）
- 通过油红O（1-([4-(二甲苯偶氮)苯甲基]偶氮)-2-萘酚）染色揭示接种于24孔板中细胞的脂质含量5,23。首先配制0.5%（w/v）油红O储备液：将500 mg油红O溶解于60 ml 99%三乙基磷酸酯和40 ml蒸馏水中。避光、室温保存，直至使用。
- 使用当天，配制36%（w/v）三乙基磷酸酯工作液，包含12 ml油红O储备液和8 ml蒸馏水。用42号滤纸过滤该溶液，以去除所有结晶的油红O（结晶会影响成像质量）。
- 将此工作液在水浴中温和加热1小时，随后以1,200 × g离心6分钟。弃去上清液，再次通过42号滤纸过滤，并转移至新的20 ml离心管中。
- 在细胞完成固定、通透和免疫染色后，吸除PBS，每孔加入500 μl油红O/三乙基磷酸酯溶液，孵育60分钟。本实验所用浓度的Triton-X用于细胞膜通透化处理，不会影响细胞内脂质含量23。
注意：油红O可被540–580 nm波长激发，因此可在荧光显微镜下使用Texas-Red滤光片检测其发射信号23。需注意，若细胞染色非常强（即脂质含量极高），油红O的荧光信号偶尔会渗漏至远红通道（i.e.，very high fat content）。 - 孵育结束后，吸除多余的油红O染液，并用500 μl PBS洗涤细胞5次。按照第6节所述免疫染色方法封片。通过明场/相差显微镜或使用Texas Red滤光片（无偏移，EX BP 560/40，BS FT 585，EM BP 630/75，Carl Zeiss）的落射荧光显微镜检测油红O染色结果。
8. 获取荧光显微镜图像以用于后续分析
注意：用于定量比较的切片须使用相同的溶液染色，并在相同的条件下拍摄例如， 曝光、相机和采集设置 等。）并在同一显微镜会话中采集。所有采集后的图像处理也应完全一致，并严格遵循数字图像的建议指南。24.
- 开启显微镜和荧光光源，进行图像采集（宽场显微镜），并等待推荐时长，使荧光光源充分预热并稳定。
- 通过阻断到达相机的光路来设定相机的暗电流；以最高分辨率采集一幅图像，并用此图像校正后续采集的所有图像。
- 使用液体光导（由填充苯甲基硅油的氟塑料软管构成）传递落射荧光，激发免疫荧光探针，并通过倒置落射荧光显微镜配备的红色（滤光片组45 HQ Texas red无漂移）、绿色（滤光片组44 FITC特制无漂移）和蓝色（滤光片组49 DAPI无漂移）带通滤光片观察信号，显微镜配置10X、20X、40X平场复消色差物镜，数值孔径分别为0.25、0.75、0.95。
- 为避免像素饱和，使用图像采集软件中的“过曝”功能，为每种荧光标记找到检测器线性范围内的最佳曝光时间。记录每种荧光标记的标准化曝光参数。
- 捕获单个通道，并以记录设备支持的最高位深度（优选16位，即65,536级灰度）保存为灰度或伪彩色TIFF（标记图像文件格式）图像文件例如 配备于显微镜的冷却CCD（电荷耦合器件）。将图像分辨率设置为1,388 x 1,040或更高。图像中必须包含比例尺或已知尺寸的参照物。
- 尽可能将文件保存为16位标记图像文件格式（.tiff），而非 .jpeg 格式，以避免信息丢失25.
- 如果对光照均匀性存在疑虑（显微镜配套软件可能具备自动校正功能），可对无细胞但以与实验样本相同方式染色和封片的盖玻片拍摄“平场”图像；该图像可用于在图像分析软件中对采集后的数据进行光照不均校正。
- 为获取图像（共聚焦显微镜），每次成像实验均需优化检测器增益和激光功率（避免信号饱和）。通常，所测得的荧光强度与激光功率水平成正比。将针孔尺寸设为“1 airy”，以获得最佳信噪比（对于特别强的信号，针孔设为0.5 airy可进一步提高分辨率）。沿z轴对经抗体标记的细胞在不同焦平面采集光学切片，并为每个通道保存16位最大投影图像用于后续图像分析。
9. 使用图像处理与分析软件对荧光标记的细胞核转录因子进行测量（每个视野约5分钟）。
- 通过将一幅图像点击并拖动到另一幅图像中，访问单个 TIFF 图像文件并叠加相应的通道。每个通道随后将在图层面板中显示为独立的图层。
- 从滤镜菜单中选择“lighten”模式，以同时显示下方图层。或者，将顶层图层的不透明度调整为50%。
注意：Tiff 图像可采用“无损”的 Lempel–Ziv–Welch (LZW) 数据压缩方式保存，以减小文件大小且不丢失信息。 - 在分析窗口（Analysis > 选择数据点 > 自定义），选择分析并选择所需的测量参数（例如， 积分密度、平均密度、圆度、直方图等）。取消勾选其旁复选框以舍弃任何不必要的测量参数。若面积测量需以 µm 为单位，请点击分析 > 设置测量尺度。标尺工具将自动出现——用其描记标尺的长度，并输入已知的微米数值。软件随后会将面积测量结果转换为平方微米。
注意：如果选择了直方图分析，在记录测量数据时，将生成一个额外的文件夹（其位置可自行选择），其中包含电镜图像中每个独立选定区域的8位直方图，以及所有独立选定区域的叠加直方图（当进行多个选定区域时，该叠加图始终显示为Histogram-1）。该分析无法由软件以16位格式执行，但对考察感兴趣对象内像素强度的分布情况非常有用。 - 为分析细胞核荧光强度，首先构建 Hoechst 或 DAPI 染色 DNA 的代表性“颜色范围选择掩模”（CRSM），以定义细胞核区域。将所需通道图像叠加后，仅保留 Hoechst 通道图层可见，方法是确保图层选项卡中其旁边的“眼睛图标”被选中，且该图层被高亮（变为蓝色），同时取消选中所有其他图层。请确保图层选项卡中的混合模式下拉菜单已重置为“Normal”。
- 打开颜色范围对话框（选择 > 颜色范围），并将选择选项下拉菜单设置为“取样颜色”。将选择预览设为“快速蒙版”（红色背景），按住 Shift 键（出现“+”符号），使用出现的吸管工具在细胞核内点击，以选中细胞核内所有蓝色色调。
- 如果选中了不需要的色调，可按住 Alt 键（此时出现‘─’符号）并点击这些色调以移除。将模糊度标度保持在零，以确保仅包含手动选择的色彩色调，并且不应勾选“局部色彩簇”。
- 将此CRSM作为程序专用提取文件（.AXT文件）保存到计算机硬盘中。选择另一随机视野的细胞核，加载、更新并保存CRSM（选择，色彩范围，加载）。至少对五个随机视野重复此操作，以确保细胞核选取具有代表性。
- 使用灰度图像的彩色版本创建掩膜以分离特征，因为人眼对不同颜色色阶的分辨能力优于对不同灰度色阶的分辨能力26.
- 使用核CRSM对染色的核区域进行分割。选定细胞核后，点击图像 > 调整 > 阈值调整并将滑块完全移至最右侧，使细胞核变为黑色。或者，右键单击并选择“填充”，然后选择“填充至：黑色”。随后点击“选择” > 反选，然后按删除键去除所有背景（如果出现选项，选择“填充为：白色”）。这将根据您的选择对图像进行二值化处理。然后从滤镜选项卡中加载分水岭插件，以分离重叠的细胞核（滤镜 > 二值图像 > 流域特征分离
- 如果多个细胞核严重重叠，请取消选中这些细胞核以将其从分析中移除（按住 Alt 键，使用套索工具在其周围大致绘制）。
- 在当前的二值化核层上，转到选择功能 > 颜色范围与 > 阴影区域，以选择单个细胞核。也可按住 Shift 键并在任意一个黑色细胞核内单击，立即选中所有细胞核。随后通过选择含有细胞核转录因子染色（如 myogenin）的图层，并取消选择所有其他图层，将该选区转移至该图层。此时， marching lines 将显示 myogenin 通道中细胞核的位置。
- 如果仅处理伪彩色图像，请单击通道面板（位于图层选项卡右侧），并仅选择绿色通道（此时图像将显示为灰色）。然后单击图像 > 模式 > 灰度。此时将出现警告提示“拼合可见图层并丢弃隐藏图层”，点击“确定”；随后另一警告提示“丢弃其他通道”，再次点击“确定”。此时图层调板中仅保留已选中的灰度核图像单一层。
- 在测量日志中点击“记录测量”以获取所选细胞核的数据。如果待分析的图层（例如 myogenin 染色）若已是原始的16位灰度图像，则直接点击“记录测量值”。
- 将选定的测量结果导出为 TXT 文件至您指定的位置。随后可在其他数据处理软件中进一步加工和分析。
注意：编辑 > 如有需要，按住 Alt、Ctrl 和 Z 键同时操作的后退命令可恢复所有先前的图层。 - 校正非特异性背景荧光27 因为荧光强度的测量结果始终是信号与背景的混合，所以要使结果具有定量性和可比性。
- 选择矩形选择工具，勾选“固定大小”，设置为20×20像素（或根据图像中细胞汇合度选择更大尺寸）。按住 Shift 键，在视野范围内选择十个或更多分散的背景区域。点击测量日志中的“记录测量值”。
- 计算所选10个背景区域每个像素的平均积分密度（即所有像素灰度值的总和，以“平均灰度值”形式显示在测量日志中）。将每个像素的平均背景密度乘以目标对象中的像素数量即， 每个细胞核）以获得每个对象的平均背景值。
- 从目标物体的原始积分密度中减去背景荧光，以获得最终经背景校正的数值。该方法可校正非特异性背景荧光在不同视野之间的潜在差异。
注意：必须仅选择真实的背景区域，因为此校正对最终数值有显著影响。建议使用放大镜功能放大后进行选择。 - 也可将校正后的总体背景值除以细胞核的面积（单位：像素），即取每个细胞核的平均灰度/强度，以尽量减少细胞核局部背景信号的潜在影响；随着细胞核尺寸增大，此类背景信号会对总整合密度值产生更大的贡献。图3C).
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结果
纯化的成肌细胞和成纤维细胞可在成脂分化培养基中培养三天，随后在成脂营养培养基中培养7至30天不等，以评估其成脂潜能。利用纯化的细胞群体，通过油红O染色结合成脂和成肌谱系标志物的免疫染色显示，仅有成纤维细胞组分具备成脂分化能力（图2）。成纤维细胞中大量脂肪的积聚肉眼可见（图A），其完全的转分化过程由细胞核内PPARγ的强烈表达所证实（图2 图B和C以及图3）。经15天处理后，这些细胞已将其残余的TE-7（一种结缔组织抗原）释放至基质上（图D）。相比之下，成肌细胞维持其正常表型，包括表达结蛋白（desmin）和肌球蛋白重链（myosin heavy chain）（图2 图E和F），且不上调细胞核内PPARγ的表达（图3C）。
肌源性细胞群（desmin）的定量分析示例+) 如图所示 图3图B显示了所分析的视野，图A显示了经背景校正后的荧光强度定量结果。该方法清晰地...
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讨论
我们已描述了一种免疫磁珠分选方法，可用于从小量肌肉活检组织样本中选择性富集人源肌肉来源前体细胞。该技术在我们的实验室中极为重要，不仅有助于克服人源肌肉来源细胞培养过程中被成纤维细胞过度生长所污染的问题，还有助于深入理解不同群体肌肉来源前体细胞的独特生物学行为。经纯化后的成肌细胞可用于蛋白质和/或基因表达变化的研究，或用于后续实验。
除了细胞纯化外，我们还详细描述了一种快速且简便的方法，用于分析荧光显微镜所得显微图像中的特定感兴趣区域。荧光显微镜的数字图像包含大量可供细胞生物学家提取的信息；实际上，像素中包含的数据并不一定都能被人眼直接识别。利用该技术，可从群体中大量单个细胞获取定量数据。与流式细胞术相比，图像分析的一个独特优势在于能够将蛋白质表达水平的变化与细胞形态变化或细胞间相互作用的变化相关联。此外，创建并保存优化且具代表性的选择掩膜的能力，使得可在多个视野中快速、准确且可重复地进行测量，从而降低人为偏差的可能性。
基于 MACS 的细胞纯化
该方法...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Carl Hobbs 和 Lindsey Majoram 提供的技术支持，以及 Pat Doherty 教授提供的显微镜设备使用许可。Agley 博士获得了伦敦国王学院研究生奖学金的支持。同时感谢 Spurrell 信托基金提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶 D | Roche | 11088866001 | |
| 分散酶 II | Sigma | D4693-1G | 使用前必须过滤除菌 |
| 胰蛋白酶/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm 细胞筛 | BD Biosciences | 352360 | |
| 胶原蛋白溶液（0.1% 乙酸中含 3 mg/ml） | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 注射器滤器（0.2 μm） | Sartorius | 17573ACK | 聚四氟乙烯（PTFE）膜 |
| CD56 人源微珠 | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | 注意微珠保质期有限 |
| 抗成纤维细胞微珠，人源 | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm 预分离滤器 | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| 大细胞柱 | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | 这些柱子配有流阻器。获得本文所述的高成肌纯度时，无需使用流阻器。 |
| LS 柱 | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs 分离器 | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | 该分离器适用于大细胞柱，但不适用于 LS 柱。 |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS 多联支架 | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | 使用前必须过滤除菌 | |
| 油红 O | Sigma | O0625 | |
| 三乙基磷酸酯 | Sigma | 538728 | |
| 沃特曼滤纸 | Sigma | Z241121-1PAK | 42 号，无灰。制备滤纸时，将圆形滤纸对折成半圆，再将半圆对折一次形成圆锥形。将圆锥形滤纸放入漏斗中用于过滤。 |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂 | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | 该试剂可购买含或不含 DAPI 的版本，且不会淬灭初始荧光。 |
| AxioVision | Carl Zeiss | 联系 Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe（从 Pugh Computers 购买） | ADPH16982* |
参考文献
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