人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

摘要

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。

摘要

骨骼肌的修复与再生依赖于卫星细胞的作用，这些细胞是定居在肌肉中的干细胞。可通过酶消化法从人体肌肉活检样本中分离卫星细胞，并在体外培养中研究其成肌特性。从酶消化过程中获得的两种主要贴壁细胞类型在数量上分别为：（i）卫星细胞（称为成肌细胞或肌肉前体细胞），最初通过CD56鉴定；⁺ 以及随后的CD56⁺/结蛋白⁺ 细胞和（ii）源自肌肉的成纤维细胞，鉴定为CD56^– 和 TE-7⁺成纤维细胞在培养中增殖效率很高，在混合细胞群体中可能过度生长并取代肌源性细胞，从而成为培养物中的优势细胞。因此，在研究各类细胞在培养中固有行为时，从人肌肉组织中分离和纯化不同类型细胞是一个重要的方法学考量。本文描述了一种基于温和酶解的细胞分选系统，即使用胶原酶和中性蛋白酶对细胞进行消化，随后采用磁性激活细胞分选技术（MACS），该方法可同时实现高纯度（>95% 成肌细胞）且产量良好（约 2.8 x 10⁶ ± 8.87 × 10⁵ 细胞/克组织，7天后 体外) 用于培养实验。该方法基于将混合的肌肉来源细胞群体与连接有抗CD56抗体的磁性微珠孵育，随后使细胞通过磁场。CD56⁺ 被微珠标记的细胞被磁场滞留，而CD56^– 细胞可不受阻碍地流经层析柱。分选过程任意阶段的细胞悬液均可接种并进行培养。在特定干预处理后，可通过特异性抗体进行免疫荧光标记，并结合图像处理与分析软件，对细胞形态以及包括核转录因子在内的蛋白质表达与定位进行定量分析。

引言

骨骼肌的修复与再生依赖于卫星细胞¹的作用，即成肌干细胞^2,3。体内这些细胞处于可逆的静息状态，位于每条肌纤维的肌膜与基底膜之间；当肌肉组织受损、修复和再生时，它们被激活，进而增殖、融合并分化³。可通过酶消化法从年轻和老年个体的人体肌肉活检样本中分离卫星细胞⁴，并在原代培养中进一步研究其成肌特性⁵。该分离过程的效率，包括细胞群体的得率和纯度，取决于所采用的方法，且在不同样本间可能存在差异。酶消化后获得的两种主要贴壁细胞类型为卫星细胞（现称为成肌细胞或肌肉前体细胞），最初被鉴定为CD56⁺/desmin阳性细胞；以及来源于肌肉的成纤维细胞，被鉴定为CD56^–、TE7⁺细胞⁵。成纤维细胞具有快速增殖能力，且在细胞间接触时不会像成肌细胞那样发生不可逆的生长停滞和终末分化；因此，在混合细胞群体中，成纤维细胞可能过度生长并占据培养体系的主导地位。

成纤维细胞常常被视为肌肉生物学家的困扰，然而，目前人们越来越关注成纤维细胞本身作为独立研究对象的价值，尤其是研究发现它们在肌肉修复过程中与成肌细胞具有协同作用⁶。因此，在研究这两种细胞在体外培养中的固有行为时，从人类肌肉组织中分离和纯化不同细胞类型便成为一项重要的方法学考量。荧光激活细胞分选（FACS）是一种可....

方案

注意：在我们实验室开展的研究中，所有受试者均签署了书面知情同意书，同意参与研究；所有实验均获得英国国家卫生服务伦理委员会（伦敦研究伦理委员会；编号：10/H0718/10）的批准，并遵循《人体组织法》和《赫尔辛基宣言》的规定进行。

1. 肌肉活检前的初始准备（15 分钟）

1. 配制人骨骼肌生长培养基。取一个无菌的50 ml锥形离心管，加入2.5 ml补充剂混合液、10 ml胎牛血清、抗生素（青霉素/链霉素）和谷氨酰胺至相应终浓度（表1），然后用骨骼肌基础培养基定容至50 ml。
2. 取15 ml骨骼肌基础培养基加入无菌的20 ml锥形离心管中并称重。称重后将该管置于冰上，用于接收人肌肉组织样本。
3. 在另一个20 ml离心管中，用骨骼肌基础培养基溶解胶原酶D和分散酶II的储备液，配制成终浓度均为2 mg/ml的酶解液，总体积为10 ml。通过0.22 μm滤器过滤除菌。将无菌酶混合液置于37 °C孵箱或水浴中预热15分钟。
   注意：该酶混合液比胰蛋白酶更温和，更有利于维持细胞活力¹⁷。
4. 准备一个培养皿和一对无菌手术刀备用。

2. 肌肉活检操作流程（45 分钟至 1 小时）

1. 在招募参与者之前，须从所有相关管理机构、委员会和医疗保健提供方获得完整的伦....

结果

纯化的成肌细胞和成纤维细胞可在成脂分化培养基中培养三天，随后在成脂营养培养基中培养7至30天不等，以评估其成脂潜能。利用纯化的细胞群体，通过油红O染色结合成脂和成肌谱系标志物的免疫染色显示，仅有成纤维细胞组分具备成脂分化能力（图2）。成纤维细胞中大量脂肪的积聚肉眼可见（图A），其完全的转分化过程由细胞核内PPARγ的强烈表达所证实（图2 图B和C以及图3）。经15天处理后，这些细胞已将其残余的TE-7（一种结缔组织抗原）释放至基质上（图D）。相比之下，成肌细胞维持其正常表型，包括表达结蛋白（desmin）和肌球蛋白重链（myosin heavy chain）（图2 图E和F），且不上调细胞核内PPARγ的表达（图3C）。

肌源性细胞群（desmin）的定量分析示例⁺) 如图所示 图3图B显示了所分析的视野，图A显示了经背景校正后的荧光强度定量结果。该方法清晰地.......

讨论

我们已描述了一种免疫磁珠分选方法，可用于从小量肌肉活检组织样本中选择性富集人源肌肉来源前体细胞。该技术在我们的实验室中极为重要，不仅有助于克服人源肌肉来源细胞培养过程中被成纤维细胞过度生长所污染的问题，还有助于深入理解不同群体肌肉来源前体细胞的独特生物学行为。经纯化后的成肌细胞可用于蛋白质和/或基因表达变化的研究，或用于后续实验。

除了细胞纯化外，我们还详细描述了一种快速且简便的方法，用于分析荧光显微镜所得显微图像中的特定感兴趣区域。荧光显微镜的数字图像包含大量可供细胞生物学家提取的信息；实际上，像素中包含的数据并不一定都能被人眼直接识别。利用该技术，可从群体中大量单个细胞获取定量数据。与流式细胞术相比，图像分析的一个独特优势在于能够将蛋白质表达水平的变化与细胞形态变化或细胞间相互作用的变化相关联。此外，创建并保存优化且具代表性的选择掩膜的能力，使得可在多个视野中快速、准确且可重复地进行测量，从而降低人为偏差的可能性。

基于 MACS 的细胞纯化

该方法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶  D	Roche	11088866001
分散酶 II	Sigma	D4693-1G	使用前必须过滤除菌
胰蛋白酶/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm 细胞筛	BD Biosciences	352360
胶原蛋白溶液（0.1% 乙酸中含 3 mg/ml）	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 注射器滤器（0.2 μm）	Sartorius	17573ACK	聚四氟乙烯（PTFE）膜
CD56 人源微珠	Miltenyi Biotech	130-050-401	注意微珠保质期有限
抗成纤维细胞微珠，人源	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm 预分离滤器	Miltenyi Biotech	130-041-407
大细胞柱	Miltenyi Biotech	130-042-202	这些柱子配有流阻器。获得本文所述的高成肌纯度时，无需使用流阻器。
LS 柱	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs 分离器	Miltenyi Biotech	130-042-102	该分离器适用于大细胞柱，但不适用于 LS 柱。
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS 多联支架	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		使用前必须过滤除菌
油红 O	Sigma	O0625
三乙基磷酸酯	Sigma	538728
沃特曼滤纸	Sigma	Z241121-1PAK	42 号，无灰。制备滤纸时，将圆形滤纸对折成半圆，再将半圆对折一次形成圆锥形。将圆锥形滤纸放入漏斗中用于过滤。
ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	该试剂可购买含或不含 DAPI 的版本，且不会淬灭初始荧光。
AxioVision	Carl Zeiss	联系 Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe（从 Pugh Computers 购买）	ADPH16982*