从人类骨骼肌成肌原细胞和成纤维细胞的分离和定量免疫细胞化学表征

Summary

来源于人体肌肉的主要贴壁细胞类型是肌原细胞和成纤维细胞。在这里，使用基于 CD56 抗原的磁激活细胞分选来富集细胞群。随后使用特异性抗体进行免疫标记并使用图像分析技术可以量化单个细胞中的细胞质和细胞核特征。

Abstract

修理和骨骼肌的再生需要卫星细胞，这是驻地肌肉干细胞的作用。这些都可以从研究中培养用酶消化人肌肉活检样品和它们的生肌性质进行分离。定量，从酶消化获得的两个主要粘附细胞类型是：（i）卫星细胞（称为生肌细胞或肌细胞前体细胞），初步确定为CD56 ^+，后来作为CD56 ⁺ /结蛋白⁺细胞和（ii）muscle-成纤维细胞，鉴定为CD56 ^-和TE-7 ^+。成纤维细胞增殖非常有效地在文化和混合细胞群，这些细胞可能溢出肌细胞主导文化。从人的肌肉的不同类型的细胞的分离和纯化由此试图调查中培养两种细胞类型的先天行为时一个重要的考虑因素的方法。在这里，我们DESCRIBE基于使用胶原酶细胞轻柔酶消化排序和分散酶，随后通过磁性活化细胞分选（MACS）的一种系统，其不仅提供了高纯度（> 95％生肌细胞）和良好的产率（〜2.8×10 ^6±8.87 7天后在体外 ），用于在培养实验×10 ^5个细胞/ g组织。这种方法是基于孵育混合肌源性细胞群与偶联于抗CD56的抗体的磁性微球珠，然后使细胞虽然磁场。 CD56 ⁺细胞势必微珠保留的，而CD56领域^-细胞通过列畅通。从分类处理的任何阶段的细胞悬浮液可以被镀和培养。以下给定的介入​​，细胞形态，并且表达和蛋白质，包括核转录因子的定位可以通过使用免疫荧光标记用特异性抗体和图像P进行定量rocessing和分析软件包。

Introduction

骨骼肌的修复和再生，需要卫星细胞^1，肌原干细胞^2,3。的作用在体内位于每肌纤维的肌膜和基底层之间的可逆静止状态存在这些细胞中，但被活化增殖，保险丝和区分肌肉组织被破坏，修复和再生^3。卫星细胞可以使用酶消化⁴年轻人和老年人人体肌肉活检标本及其生肌性能隔离随后可以在研究原代培养^5。这种隔离方法的关于细胞群体的产量和纯度的效率取决于所使用的方法，可从样品变化进行采样。从酶消化得到的两个主要贴壁细胞类型的卫星细胞（现称为肌细胞或肌肉前体细胞），初步确定为CD56 ⁺ /结蛋白细胞，万亩SCLE衍生的成纤维细胞，鉴定为CD56 ^-和TE7 ⁺细胞^5。的成纤维细胞具有快速的增殖速率和不发生不可逆的生长停滞和终末分化时像肌原细胞的细胞 - 细胞接触;因此，在混合人群，成纤维细胞可能溢出肌细胞主导文化。

成纤维细胞经常被视为刺激肌肉生物学家，然而，现在有在成纤维细胞作为值得研究的在他们自己的权利的越来越大的兴趣，特别是因为它们已被证明在肌肉修复⁶有一个与肌细胞协同作用。从人的肌肉的不同类型的细胞的分离和纯化由此试图调查中培养两种细胞类型的先天行为时一个重要的考虑因素的方法。荧光激活细胞分选（FACS）是一种方法，通过它的细胞可以被分类为进一步研究和/或计数并....

Protocol

注：对于在我们的实验室进行的研究所有受试者给他们的书面知情同意参加，所有实验均与英国国民保健服务伦理委员会批准实施（伦敦研究伦理委员会，参考：10 / H0718 / 10），并按照人体组织法和赫尔辛基宣言。

1.初始准备之前，肌肉活检（15分钟）

1. 使人体骨骼肌生长培养基。到带刻度的无菌50ml锥形管中加入2.5毫升补充混合物，将10毫升胎牛血清，抗生素（青霉素/链霉素）和谷氨酰胺，以正确的最终浓度（ 表1），然后填充该管至50ml骨骼肌基底媒介。
2. 把15ml的所述骨骼肌基础培养基在无菌20毫升锥形管并称重。一旦称重地方该管在冰上。使用此接收人体肌肉样本。
3. 在另外20毫升管准备10米升的胶原酶D和分散酶II酶溶液至2毫克的最终浓度/ ml的每个通过在骨骼肌基础培养基中溶解的库存等份这些酶。通过一个0.22微米的过滤器将它传递滤灭菌该溶液。将此无菌酶混合物在培养箱或水浴，在37℃下进行15分钟预热。
   注：酶的这种混合物比胰蛋白酶稍微温和的和更好的维持细胞活力^17。
4. 设置一个培养皿和一对无菌解剖刀的一边。

2.肌肉活检程序（45分钟，1小时）

1. 此前招募参与者，获得所有相关的理事机构，委员会和医疗服务提供全面的道德关和程序上的批准（包括相关的疫苗实验者....

Results

纯化的肌细胞和成纤维细胞可在脂肪形成分化培养基中培养三天之后，从7-30之间的任何地方天成脂营养介质，以评估其潜力脂肪生成。使用纯化的细胞群，在与免疫染色对脂肪形成和生肌谱系标记物组合的油红O染色显示，只有在成纤维细胞级分是能够分化成脂肪细胞（ 图2）的。脂肪由成纤维细胞的大量积累可见肉眼（A组），其完整的转分化显示核PPARγ（ 图2板B＆C和图3）的很强的表现。 15天的治疗，这些细胞释放任何剩余的TE-7（结缔组织抗原）到他们的基板（面板D）。相比之下，肌细胞保持其正常的表型，包括结蛋白和肌球蛋白重表达链（ 图2板E＆F），不上调PPARγ核（ 图3C）。

肌细胞（结蛋白^+）的场的量化分析的一个例子示于图3。图B显示的字段进行分析，并面板A显示了量化荧光强度（背景校正后）。这种方法明显地示出了在各个核肌细胞生成素的表达，在该特定的接种密度和时间点的变化。.......

Discussion

我们已经描述了immunomagentic分拣过程对人类肌源性前体从肌肉活检材料小样本的选择性富集。这种技术是非常宝贵的在我们的实验室克服人类肌源性文化的流失，成纤维细胞，同时也为了解肌源性祖细胞不同群体的独特的行为。一旦纯化的生肌细胞可以追究变化的蛋白质和/或基因表达，或者用于下行实验。

除了细胞纯化，我们也详细了快速而直接的荧光显微镜分析的显微照片感兴趣的特定区域的方法。从荧光显微镜数字图像包含了丰富的信息细胞生物学家提取;的确像素持有的数据不一定可辨别人眼。利用这种技术的定量数据可在约大量获得单个细胞的人口。图像分析时相比流式细胞一个独特的特点是，以改变蛋白质表达的变化的细胞形状orcell - 细胞相互作用相关的能力。此外，有能力创建并保存了优化，代表的选择口罩可以快速，准确，重复性测量整个视许多领域，从而减少了对用户的偏见的可能性作出。

MACS型细胞纯化

这种方法的一个好处是，细胞可以立即在分离后或在培养数天（当产率会更高）可.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
胶原酶 D	罗氏
分散酶 II	Sigma	D4693-1G	使用前必须进行过滤灭菌
胰蛋白酶/EDTA	（Gibco） Invitrogen	15400-054
100 μm细胞过滤器	BD Biosciences	352360
胶原蛋白溶液（3 mg/ml，溶于0.1%乙酸）	Sigma，多塞特郡，英国	C8919
Minisart SRP15 针式过滤器 （0.2 μm）	赛多利斯	17573ACK	聚四氟乙烯 （PTFE） 膜
CD56 人微珠	Miltenyi Biotech	130-050-401	注意微珠的保质期有限
抗成纤维细胞微珠，人	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm 预分离过滤器	Miltenyi Biotech	130-041-407
大细胞色谱柱	Miltenyi Biotech	130-042-202	这些色谱柱配有流量电阻器。无需使用流量电阻即可获得此处描述的高生肌纯度。
LS 色谱柱	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs分离器	Miltenyi Biotech	130-042-102	这个分离器适合大细胞柱，但不适合LS柱。
MidiMACS	Miltenyi 生物科技	130-042-302
MACS 多功能支架	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		使用前必须进行过滤器消毒
油红 O	Sigma	O0625
磷酸三乙	酯 Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	第 42 名，无灰。要准备过滤器，请将圆形滤纸折叠成半圆，然后再次将半圆对折，形成锥形。将锥体放入漏斗中进行过滤。
ProLong Gold 抗淬灭试剂	Molecular Probes，Invitrogen	P36930	购买时可加入或不加入 DAPI，并且不会淬灭初始荧光。
AxioVision	Carl Zeiss	联系人 Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe（从 Pugh Computers 购买）	ADPH16982*