我们开发了一种易于定制的链特异性荧光方法 原位 结合免疫荧光的荧光原位杂交（FISH）方案。该方法可在单细胞水平上对RNA动态进行详细分析，同时深入了解染色质结构、细胞核组织及转录调控。
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方法文章
快速荧光 原位 X染色体失活中Xist RNA与组蛋白修饰免疫荧光联合杂交实验方案
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
结合RNA荧光 原位 杂交（FISH）与免疫荧光（immuno-FISH）相结合的技术可在单细胞水平上用于检测RNA定位的空间动态，同时通过免疫荧光揭示蛋白质定位、表观遗传修饰及其他相关特征。X染色体失活是长链非编码RNA（lncRNA）介导基因沉默的经典范例。在哺乳动物雌性个体的两条X染色体中，X失活特异性转录本（Xist）lncRNA在其中一条X染色体上的聚集（称为Xist云）是启动X染色体失活的关键步骤。Xist RNA直接或间接地与多种染色质修饰酶相互作用，从而在失活的X染色体（Xi）上建立独特的表观遗传景观。Xi的一个已知表观遗传标志是组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）修饰。本文介绍一种简单快速的immuno-FISH实验方案，利用针对RNA的多重寡核苷酸探针进行FISH检测Xist RNA，并结合H3K27me3的免疫荧光染色，以同时观察Xist RNA及其相关表观遗传修饰的定位情况。与传统方法相比，使用寡核苷酸探针可显著缩短孵育时间，并提高Xist RNA检测的灵敏度 体外 转录的RNA探针（核糖探针）。本方案为研究lncRNA的动态变化及其相关的表观遗传修饰、染色质结构、细胞核组织和转录调控提供了强有力的工具。
引言
哺乳动物X染色体失活（XCI）是一种用于补偿XX与XY之间X连锁基因剂量不平衡的策略，其中雌性个体的两条X染色体中的一条在转录水平上被沉默1。X染色体失活是研究长链非编码RNA（lncRNA）的理想模型系统。X染色体失活受多种lncRNA调控，在过去几十年中被广泛研究，以揭示lncRNA与转录、染色质结构及细胞核组织之间相互作用的机制2,3。
位于X染色体上的X失活中心（XIC）是一个复杂的遗传位点，包含多个产生非编码RNA的基因4。在真兽亚纲哺乳动物中，X失活特异性转录本（Xist）长链非编码RNA（lncRNA）便是其中一种，在X染色体失活过程中发挥关键作用5,6。Xist转录本围绕未来失活X染色体（Xi）的位置聚集，启动X染色体失活过程，在RNA FISH检测下呈现为云状结构，这一结构被称为“Xist云”7。由于Xist RNA可与多种染色质修饰酶相互作用，因此在X染色体失活过程中，可观察到Xist云与沉默染色质及抑制性转录相关的不同表观遗传修饰共定位8。例如，Xist RNA与多梳抑制复合物2（PRC2）相互作用，后者负责介导H3K27me3修饰，从而诱导形成抑制性染色质状态9。Xist云在Xi上的出现及其与强烈的H3K27me3修饰的共定位，代表了Xi所具有的兼性异染色质....
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方案
1. 探针制备
- 获取多个位于 Xist 基因中的独特寡核苷酸（长度为 20–30 个核苷酸，熔解温度为 63–65 ºC，表 1），5’端带有氨基修饰，并溶于水中。
- 将等摩尔量的 5’端氨基修饰寡核苷酸（总量 4.5 µg）混合，按照制造商说明书使用胺反应性荧光染料进行标记。
- 将混合后的寡核苷酸溶解于最终体积为 5 µl 的无核酸酶水中，并向寡核苷酸溶液中加入 3 µl 1 M 碳酸氢钠。
- 向胺反应性染料小瓶中加入 2 µl DMSO，并短暂涡旋振荡。
- 将寡核苷酸溶液与 DMSO 中的反应性染料混合，在室温避光条件下孵育 1 小时。
- 通过 G-25 柱层析纯化并随后进行乙醇沉淀，以纯化荧光标记的寡核苷酸探针。
- 将 G-25 柱在 750 × g 条件下离心 1 分钟，以去除多余的保存缓冲液。
- 向第 1.2.3 步中得到的标记混合物中加入 40 µl 无核酸酶水，并将其加至 G-25 柱上。在 750 × g 条件下离心 2 分钟。
- 向第 1.3.2 步获得的纯化探针中加入 50 µl 无核酸酶水、10 µl 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 250 µl 乙醇。在 -80 °C 下保存 30 分钟，然后在 4 °C 下以 21,000 × g 离心 15 分钟。 ....
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结果
快速免疫荧光原位杂交的代表性图像如图1A所示。在分化中的雌性细胞中，可检测到Xist RNA云与Xi染色体上的H3K27me3信号共定位。分化第12天时，超过90%的拟胚体细胞显示出Xist云信号（图1B）。短寡核苷酸探针可有效穿透细胞核，从而几乎可视化所有与Xist RNA共定位的H3K27me3信号（图1C；97%，n = 150）。
图 1：Xist RNA 与 H3K27me3 在分化中的小鼠胚胎体（EB）的失活 X 染色体（Xi）上共定位。
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讨论
本文介绍了一种快速的免疫荧光原位杂交（immuno-FISH）方案，可在不到5小时内完成载玻片制备、Xist RNA荧光原位杂交以及H3K27me3的免疫荧光染色。与常规用于Xist RNA检测的免疫FISH方法相比（通常需要过夜进行RNA FISH杂交），本方案不仅显著缩短了实验时间，而且通过使用寡核苷酸探针提高了免疫FISH的灵敏度。
由于Xist在X染色体失活过程中高度转录，且其转录本被发现强烈地在失活X染色体（Xi）上以顺式方式富集，因此利用相对较短的孵育时间，通过RNA FISH即可在分化及已分化细胞中轻松检测到Xist RNA信号。该免疫-FISH方案也可用于其他目标蛋白和丰度较高的RNA检测，但可能需要对免疫荧光和RNA FISH步骤进行优化。若将本方案应用于其他RNA，需考虑可设计的寡核苷酸探针数量，并通过试错法优化RNA FISH中探针的浓度、孵育时间和温度。一个其他应用的实例是，我们此前已成功使用单个LNA探针检测端粒RNA22。针对低丰度RNA靶标的探针设计与制备，请参考Raj和Tyagi的文章
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致谢
我们感谢洪在俊（Hongjae Sunwoo）在RNA FISH寡核苷酸设计方面提供的有益建议。我们还感谢塞雷妮蒂·柯蒂斯（Serenity Curtis）对稿件的编辑。N.Y. 获得了日本促进科学振兴会（JSPS）海外博士后研究奖学金的支持。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：RO1-GM102184）、March of Dimes 研究基金会（项目编号：#6-FY12-337）以及辛辛那提儿童医院医学中心发展基金和受托人基金对 Y.O. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5’-氨基修饰的寡核苷酸 | IDT | ||
| Alexa Fluor 488 活性染料 | Life Technologies | A32750 | |
| MicroSpin G-25 柱 | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 | |
| 牛血清白蛋白，分子生物学级（用于杂交缓冲液） | Roche | 10715859103 | |
| Histone H3K27me3 抗体 | Active Motif | 61017 | |
| Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠二抗，高度交叉吸附 | Life Technologies | A21424 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂 | Life Technologies | P36931 |
参考文献
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.
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