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方法文章

快速荧光 原位 X染色体失活中Xist RNA与组蛋白修饰免疫荧光联合杂交实验方案

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DOI：

10.3791/52053

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2014年11月26日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们开发了一种易于定制的链特异性荧光方法 原位 结合免疫荧光的荧光原位杂交（FISH）方案。该方法可在单细胞水平上对RNA动态进行详细分析，同时深入了解染色质结构、细胞核组织及转录调控。

摘要

结合RNA荧光 原位 杂交（FISH）与免疫荧光（immuno-FISH）相结合的技术可在单细胞水平上用于检测RNA定位的空间动态，同时通过免疫荧光揭示蛋白质定位、表观遗传修饰及其他相关特征。X染色体失活是长链非编码RNA（lncRNA）介导基因沉默的经典范例。在哺乳动物雌性个体的两条X染色体中，X失活特异性转录本（Xist）lncRNA在其中一条X染色体上的聚集（称为Xist云）是启动X染色体失活的关键步骤。Xist RNA直接或间接地与多种染色质修饰酶相互作用，从而在失活的X染色体（Xi）上建立独特的表观遗传景观。Xi的一个已知表观遗传标志是组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）修饰。本文介绍一种简单快速的immuno-FISH实验方案，利用针对RNA的多重寡核苷酸探针进行FISH检测Xist RNA，并结合H3K27me3的免疫荧光染色，以同时观察Xist RNA及其相关表观遗传修饰的定位情况。与传统方法相比，使用寡核苷酸探针可显著缩短孵育时间，并提高Xist RNA检测的灵敏度 体外 转录的RNA探针（核糖探针）。本方案为研究lncRNA的动态变化及其相关的表观遗传修饰、染色质结构、细胞核组织和转录调控提供了强有力的工具。

引言

哺乳动物X染色体失活（XCI）是一种用于补偿XX与XY之间X连锁基因剂量不平衡的策略，其中雌性个体的两条X染色体中的一条在转录水平上被沉默1。X染色体失活是研究长链非编码RNA（lncRNA）的理想模型系统。X染色体失活受多种lncRNA调控，在过去几十年中被广泛研究，以揭示lncRNA与转录、染色质结构及细胞核组织之间相互作用的机制2,3。

位于X染色体上的X失活中心（XIC）是一个复杂的遗传位点，包含多个产生非编码RNA的基因4。在真兽亚纲哺乳动物中，X失活特异性转录本（Xist）长链非编码RNA（lncRNA）便是其中一种，在X染色体失活过程中发挥关键作用5,6。Xist转录本围绕未来失活X染色体（Xi）的位置聚集，启动X染色体失活过程，在RNA FISH检测下呈现为云状结构，这一结构被称为“Xist云”7。由于Xist RNA可与多种染色质修饰酶相互作用，因此在X染色体失活过程中，可观察到Xist云与沉默染色质及抑制性转录相关的不同表观遗传修饰共定位8。例如，Xist RNA与多梳抑制复合物2（PRC2）相互作用，后者负责介导H3K27me3修饰，从而诱导形成抑制性染色质状态9。Xist云在Xi上的出现及其与强烈的H3K27me3修饰的共定位，代表了Xi所具有的兼性异染色质特征10,11。

染色体技术，例如DNA/RNA荧光原位杂交（FISH），已从使用放射性标记探针的传统方法12发展到近年来采用多条寡核苷酸探针、灵敏度更高且具备荧光成像能力的先进方法13,14。DNA/RNA FISH与免疫荧光联合使用已成为常规的细胞学工具，用于研究细胞核在时空上的组织结构、RNA定位、染色质结构及其修饰。RNA FISH中最常用的探针制备方法是利用质粒或细菌人工染色体（BAC）克隆，并通过缺口平移法或随机引物标记法进行标记15。然而，小鼠中近70%的基因和人类中约40%的基因存在正义链与反义链转录本的重叠16，因此需要采用链特异性的FISH方法以区分正义和反义转录本。体外转录的RNA探针（核糖探针）常用于链特异性的RNA FISH17,18；但该方法需构建含有T7、SP6或T3启动子的质粒克隆或PCR产物，并进一步合成核糖探针。此外，来源于基因组DNA或cDNA的核糖探针常包含非特异性区域和重复元件，导致背景噪声较高。另一个问题是，长度为数百个核苷酸、末端携带多个荧光基团的核糖探针难以有效穿透细胞核。为克服这一问题，已开发出多种较短的寡核苷酸探针，每条探针仅在末端标记单个荧光基团，具有高灵敏度、信号强度均匀以及易于纯化和操作的优点14。此外，DNA寡核苷酸通常比RNA更稳定。我们采用类似策略，在Xist RNA FISH19中结合使用寡核苷酸探针与免疫荧光，以研究Xist长链非编码RNA（lncRNA）在X染色体失活过程中诱导的Xi染色体表观遗传动态变化。本实验方案详细描述了寡核苷酸探针的构建、细胞的适当制备，以及免疫荧光与RNA FISH技术的应用。若实验室需常规开展Xist RNA FISH，长期来看，使用多条寡核苷酸探针的方法具有较高的成本效益。该技术可用于在细胞中鉴定长链非编码RNA，同时绘制其与表观遗传修饰或相关因子的共定位关系。本方案的一大优势在于可根据研究需求轻松进行调整和优化。

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方案

1. 探针制备

  1. 获取多个位于 Xist 基因中的独特寡核苷酸（长度为 20–30 个核苷酸，熔解温度为 63–65 ºC，表 1），5’端带有氨基修饰，并溶于水中。
  2. 将等摩尔量的 5’端氨基修饰寡核苷酸（总量 4.5 µg）混合，按照制造商说明书使用胺反应性荧光染料进行标记。
    1. 将混合后的寡核苷酸溶解于最终体积为 5 µl 的无核酸酶水中，并向寡核苷酸溶液中加入 3 µl 1 M 碳酸氢钠。
    2. 向胺反应性染料小瓶中加入 2 µl DMSO，并短暂涡旋振荡。
    3. 将寡核苷酸溶液与 DMSO 中的反应性染料混合，在室温避光条件下孵育 1 小时。
  3. 通过 G-25 柱层析纯化并随后进行乙醇沉淀，以纯化荧光标记的寡核苷酸探针。
    1. 将 G-25 柱在 750 × g 条件下离心 1 分钟，以去除多余的保存缓冲液。
    2. 向第 1.2.3 步中得到的标记混合物中加入 40 µl 无核酸酶水，并将其加至 G-25 柱上。在 750 × g 条件下离心 2 分钟。
    3. 向第 1.3.2 步获得的纯化探针中加入 50 µl 无核酸酶水、10 µl 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 250 µl 乙醇。在 -80 °C 下保存 30 分钟，然后在 4 °C 下以 21,000 × g 离心 15 分钟。
    4. 用 1 ml 70% 乙醇洗涤沉淀的寡核苷酸一次。
    5. 将沉淀物重悬于 50 µl 无核酸酶水或 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；1 mM EDTA）中，终浓度约为 10 µM。
  4. 用杂交缓冲液（10% 甲酰胺；2× SSC [300 mM NaCl；30 mM 柠檬酸钠]；2 mg/ml BSA；10% 硫酸葡聚糖）将荧光标记的寡核苷酸探针稀释至终浓度为 250 nM。
    注：在此快速 FISH 实验方案中，Xist 基因的寡核苷酸探针设计并使用了比常规 FISH 协议更高的浓度，以缩短杂交孵育时间。

2. 载玻片制备

注意：可通过将小鼠胚胎干细胞（ES）或类胚体（EB）分化细胞直接培养在经多聚赖氨酸处理的载玻片上，或使用细胞悬液进行细胞离心涂片，制备用于免疫荧光原位杂交（immuno-FISH）的载玻片样品20,21。此处展示的是通过细胞离心涂片法制备载玻片的步骤。

  1. 吸弃6孔板中的培养基，用PBS（室温）洗涤一次，彻底吸弃。
  2. 向6孔板中加入0.5 ml胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育5–10分钟。
  3. 加入5 ml培养基，通过轻柔吹打数次使细胞充分重悬。
  4. 将细胞转移至15 ml离心管中，于室温下以200 × g离心5分钟。
  5. 弃去上清液，用2 ml PBS轻柔重悬细胞沉淀。
  6. 使用血细胞计数板计数细胞，并用PBS将细胞悬液稀释至4 × 105 个细胞/ml。
  7. 将载玻片、滤纸卡和样品室用夹子组装好，放入细胞离心涂片机（cytospin）对应的插槽中。在每组组装好的样品室中加入250 μl步骤2.6制备的细胞悬液，于室温下以1,500 rpm离心10分钟。
  8. 在冰上准备3个科卜林染色缸（coplin jars），分别加入40 ml预冷的PBS、CSK缓冲液（10 mM PIPES，pH 6.8；100 mM NaCl；300 mM蔗糖；3 mM MgCl2）和CSKT缓冲液（含0.5% Triton X-100的CSK缓冲液）。
  9. 细胞离心涂片完成后，迅速将载玻片转移至冰上预冷的PBS中，孵育5分钟。
  10. 将载玻片转移至冰上预冷的CSK缓冲液中，孵育1分钟。
  11. 将载玻片转移至冰上预冷的CSKT缓冲液中，孵育5分钟。
  12. 将载玻片再次转移回冰上预冷的CSK缓冲液中，孵育1分钟。
  13. 将载玻片转移至含4%多聚甲醛的PBS溶液中，于室温孵育10分钟。

3. 免疫荧光

  1. 将载玻片放入盛有PBST（1x PBS含0.1% Tween-20）的考普林瓶中，浸泡数秒。
  2. 将载玻片倾斜放置，使残留缓冲液沿玻片流下。小心擦去多余液体，将载玻片放入装有水的移液枪头盒中。在玻片上覆盖40 μl封闭液（1x PBS，1% BSA，0.1% Tween-20），轻轻加盖盖玻片，室温孵育10分钟。
  3. 移除盖玻片，除去封闭液，加入40 μl组蛋白H3K27me3一抗，用封闭液按1:500比例稀释。重新盖上盖玻片，室温孵育30分钟。
    注意：在此RNA FISH实验流程中，若使用多克隆抗体，封闭液中添加RNase抑制剂可能有助于保护RNA。
  4. 将载玻片在盛有PBST的考普林瓶中洗涤2次，每次5分钟，洗涤时轻轻振荡。
  5. 将载玻片倾斜放置，使残留缓冲液沿玻片流下。小心擦去多余液体，将载玻片放回枪头盒中。加入40 μl用封闭液按1:500比例稀释的二抗，覆盖盖玻片，避光孵育15分钟。后续所有步骤均需始终避光操作。
  6. 参照步骤3.4，在盛有PBST的考普林瓶中洗涤2次。

4. 使用寡核苷酸探针进行RNA FISH

  1. 在步骤 4.3 的 RNA FISH 实验前，将底部装有水的移液器吸头盒在 37 °C 预热，以防止载玻片干燥。
  2. 将载玻片倾斜放置，使残留缓冲液沿玻片流下。小心擦去步骤 3.6 中多余的液体，将载玻片放入底部装有水的预热移液器吸头盒中。在载玻片上加入 500 μl FISH 洗涤缓冲液（含 10% 甲酰胺的 2x SSC），室温孵育 5 分钟。
  3. 移除 FISH 洗涤液，在载玻片上加入 8 μl 寡核苷酸探针，盖上盖玻片，将载玻片转移至底部装有水的预热移液器吸头盒中；在 37 °C 孵育 1–2 小时。
  4. 将 3 个已预热的考兰罐（coplin jar）置于 37 °C 水浴中，分别装有 FISH 洗涤缓冲液、含 DAPI 的 FISH 洗涤缓冲液和 2x SSC。
  5. RNA FISH 孵育 1–2 小时后，将载玻片放入预热的 FISH 洗涤缓冲液中。
  6. 孵育数分钟，直至盖玻片从载玻片上脱落。
  7. 将载玻片重新放入洗涤缓冲液中，继续孵育 5 分钟。
  8. 将载玻片转移至另一装有预热的含 0.5 ng/ml DAPI 的 FISH 洗涤缓冲液的考兰罐中，孵育 5 分钟。
  9. 将载玻片转移至另一装有预热的 2x SSC 的考兰罐中，孵育 5 分钟。
  10. 将载玻片倾斜放置，使残留缓冲液流下。小心擦去多余液体，将载玻片放回干燥的吸头盒中。在载玻片上加入 4 μl 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片。
  11. 用指甲油密封盖玻片，置于显微镜下观察。载玻片可在避光条件下于 4 °C 保存数月。

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结果

快速免疫荧光原位杂交的代表性图像如图1A所示。在分化中的雌性细胞中，可检测到Xist RNA云与Xi染色体上的H3K27me3信号共定位。分化第12天时，超过90%的拟胚体细胞显示出Xist云信号（图1B）。短寡核苷酸探针可有效穿透细胞核，从而几乎可视化所有与Xist RNA共定位的H3K27me3信号（图1C；97%，n = 150）。

Xist RNA 定位、H3K27me3 染色、DAPI 标记的细胞核；荧光显微镜结果。
图 1：Xist RNA 与 H3K27me3 在分化中的小鼠胚胎体（EB）的失活 X 染色体（Xi）上共定位。

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讨论

本文介绍了一种快速的免疫荧光原位杂交（immuno-FISH）方案，可在不到5小时内完成载玻片制备、Xist RNA荧光原位杂交以及H3K27me3的免疫荧光染色。与常规用于Xist RNA检测的免疫FISH方法相比（通常需要过夜进行RNA FISH杂交），本方案不仅显著缩短了实验时间，而且通过使用寡核苷酸探针提高了免疫FISH的灵敏度。

由于Xist在X染色体失活过程中高度转录，且其转录本被发现强烈地在失活X染色体（Xi）上以顺式方式富集，因此利用相对较短的孵育时间，通过RNA FISH即可在分化及已分化细胞中轻松检测到Xist RNA信号。该免疫-FISH方案也可用于其他目标蛋白和丰度较高的RNA检测，但可能需要对免疫荧光和RNA FISH步骤进行优化。若将本方案应用于其他RNA，需考虑可设计的寡核苷酸探针数量，并通过试错法优化RNA FISH中探针的浓度、孵育时间和温度。一个其他应用的实例是，我们此前已成功使用单个LNA探针检测端粒RNA22。针对低丰度RNA靶标的探针设计与制备，请参考Raj和Tyagi的文章

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致谢

我们感谢洪在俊（Hongjae Sunwoo）在RNA FISH寡核苷酸设计方面提供的有益建议。我们还感谢塞雷妮蒂·柯蒂斯（Serenity Curtis）对稿件的编辑。N.Y. 获得了日本促进科学振兴会（JSPS）海外博士后研究奖学金的支持。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：RO1-GM102184）、March of Dimes 研究基金会（项目编号：#6-FY12-337）以及辛辛那提儿童医院医学中心发展基金和受托人基金对 Y.O. 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5’-氨基修饰的寡核苷酸IDT
Alexa Fluor 488 活性染料Life TechnologiesA32750
MicroSpin G-25 柱GE Healthcare27-5325-01
Cytospin 2Shandon59900102
牛血清白蛋白，分子生物学级（用于杂交缓冲液）Roche10715859103
Histone H3K27me3 抗体Active Motif61017
Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠二抗，高度交叉吸附Life TechnologiesA21424
ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂Life TechnologiesP36931

参考文献

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