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方法文章

Xenopus 口面部表型的定量分析

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DOI：

10.3791/52062

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2014年11月6日

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

本文内容

摘要

已开发出一种用于量化非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎口面部大小和形状的方法。本实验方案结合了传统的尺寸测量与几何形态测量学，以实现对口面部发育及其缺陷进行更深入的分析。

摘要

非洲爪蟾已成为解析颅面发育及其缺陷机制的重要工具。一种量化口面部发育的方法将有助于对经遗传或分子手段调控基因表达或蛋白质功能的物质处理后所产生的口面部表型进行更严谨的分析。通过胚胎头部的二维图像，可测量传统的尺寸参数，如口面部宽度、高度和面积。此外，还采用胚胎口部开口的圆形度指标来描述口部形状。同时对这些二维图像进行几何形态测量学分析，以更精细地揭示口面部区域形态的变化。在口面部区域特定位置设定标志点并生成坐标，利用主成分分析将这些标志点坐标降维至主成分，从而区分不同处理组。结果以散点图形式展示，具有相似口面部形状的个体在图中聚集在一起。进行判别函数分析也十分有用，该方法可对两组处理间的标志点位置进行统计学比较。该分析结果呈现在一个变换网格上，标志点位置的变化以矢量形式显示。将网格叠加于这些矢量之上，可展示出显著变化的标志点位置所形成的形变模式。判别函数分析中的形态变化基于统计学度量，因此可通过 p 值进行评估。该分析方法简便易行，仅需体视显微镜和免费软件即可完成，因而将成为一项有价值的研究与教学资源。

引言

在人类最常见的严重出生缺陷中，影响口腔和面部的缺陷尤为突出，例如口面裂1。患有口面结构畸形的儿童在其一生中需要接受多次手术，并面临面部畸形、言语、听力和进食障碍等问题。因此，推动颅面和口面发育领域的新研究对于预防和治疗此类出生缺陷至关重要。Xenopus laevis 已成为解析调控颅面发育机制的一种新工具（相关研究实例包括2,3,4-11）。因此，若能建立一种定量分析该物种头部和面部在发育过程中大小与形态变化的方法，将具有重要意义3。

本文介绍一种方法，该方法结合传统的尺寸测量与源自 Xenopus 研究12 以及大量分析人类面部形态的研究13-15 所采用的几何形态测量学技术。本实验方案的目标是使研究人员能够量化面部的大小和形态，以区分正常与异常发育过程中的不同口面部表型。该分析方法有助于更精确地区分细微的颅面缺陷，例如由基因之间和/或环境因素之间的协同效应所引起的缺陷。此外，这种定量方法还可能揭示口面部缺陷的轻微改善或表型挽救。因此，该方法可作为分析潜在治疗手段的有效指南。

我们在此提出的面部测量与几何形态测量学相结合的方法，能够对口面部区域的大小和形状进行比现有方案更为全面的统计分析，而现有方案在很大程度上仅单独使用其中一种方法15-18。此外，我们提出了一种简便的方法，可在无需当前研究中所依赖的复杂三维成像设备的情况下，同时评估面部的正中平面和侧方平面13,19。

我们以经视黄酸受体抑制剂处理的非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎为例展示本实验方案，该抑制剂可诱导异常的口面部发育及正中腭裂2,3。对这些胚胎口面部区域的尺寸和形态进行量化分析，揭示了其中期面部的变化，这种变化与具有类似腭裂的人类以及小鼠模型中的表现相似20,21。然而，本方案也可用于评估其他化合物对口面部发育的影响，例如天然物质、除草剂或生长因子等蛋白质。此外，通过功能缺失或功能获得实验（使用反义吗啉代寡核苷酸或CRISPRs/TALENs）干扰基因表达所引起的口面部大小和形态变化，亦可利用本方案进行量化。最后，我们开发此方法主要用于评估Xenopus的形态学特征，但该方法可轻松修改以适用于任何脊椎动物的分析。其他应用还可包括利用本方案对近缘物种进行比较，用于进化或生态学研究。尽管本文提供的示例使用该方案描述口面部区域的分析，但该方法亦可轻易修改用于其他区域、器官或结构的分析。

该口面部定量分析方案将成为研究领域的重要资源，同时也可作为本科生教学的优秀视频示范工具。

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方案

使用Xenopus laevis进行的所有实验均已获得IACUC批准（方案编号 #AD20261）。

1. 准备试剂和所需材料

  1. 试剂：
    1. 配制 1 L 的 10× MBS（改良 Barth 氏生理盐水）溶液22。将 NaCl（880 mM）、KCl（10 mM）、MgSO4（10 mM）、HEPES（50 mM，pH 7.8）和 NaHCO3（25 mM）加入 1 L 去离子水中。用 NaOH 调节 pH 至 7.8。
    2. 通过将 100 ml 10× MBS 溶液加入 900 ml 去离子水中，稀释配制 1 L 的 1× MBS 溶液。再加入 0.7 ml 的 1 M CaCl2 溶液。
    3. 通过将 100 ml 1× MBS 溶液加入 900 ml 去离子水中，稀释配制 1 L 的 0.1× MBS 溶液。向 1 L 0.1× MBS 溶液中加入 1 ml 的 10 mg/ml 庆大霉素溶液，用于胚胎培养。
    4. 在 100 ml 10× MBS 中溶解 4 ml 的 5 M NaCl，配制高盐 MBS 溶液，然后加入去离子水至总体积为 1 L。
    5. 使用去离子水将 100% 乙醇稀释，配制 70% 乙醇。
    6. 用二甲基亚砜（DMSO）配制 10 mM 的 BMS-543 储存液。
    7. 将 4 g 多聚甲醛粉末加入 50 ml 去离子水中，配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。在加热板上加热至约 65 °C，然后逐滴加入 5 M NaOH，直至溶液变澄清。
      1. 溶液澄清后，从热源移开，加入 50 ml 2× PBS 和 100 µl Tween-20。将溶液置于冰上冷却至室温。用 HCl 调节 pH 至 7.2–7.5。
    8. 将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶解于 800 ml 去离子水中，配制含 Tween 的磷酸盐缓冲液（PBT）。用 HCl 将 pH 调至 7.4，加入 2 ml Tween-20，最后用去离子水定容至 1 L。
    9. 将 1 g 半胱氨酸溶解于 50 ml 去离子水或 0.1× MBS 中，加入 1.5 ml 5 M NaOH，并将 pH 调至 7.8，配制半胱氨酸溶液。
    10. 将 10 g 苯佐卡因粉末加入 100 ml 100% EtOH 中，配制 10% 苯佐卡因储存液。用于安乐死成年雄性及准备固定的胚胎时，将其稀释为 0.05% 溶液。
    11. 将 1 ml 小牛血清加入 9 ml L15 缓冲液中，配制睾丸储存液。
  2. 所需工具与设备：
    1. 获取 材料与设备表 中列出的设备，如 图 1 所示。
    2. 改装移液工具。将玻璃巴斯德移液管的尖端置于本生灯火焰中，旋转移液管尖端直至其熔化并形成圆滑的封闭端。
    3. 将油灰状建模黏土压平铺于塑料培养皿底部，并抹平以覆盖整个皿底（可使用任意尺寸）（图 1Aiv）。
      1. 将直头解剖针以 45° 角轻轻压入铺有黏土的培养皿中。固定针头位置，缓慢水平移动培养皿，形成凹陷的直线（图 1Bi）。根据需要重复操作以制作多行。
      2. 使用玻璃移液管工具的末端，在黏土培养皿的每一行中制作浅的圆形凹陷，用于放置胚胎头部（图 1Bii），以便在拍照时有序排列胚胎。
      3. 拍照时，向培养皿中加入 PBT（图 1Biii）。使用后，需用无菌水彻底清洗培养皿及黏土表面，随后用 70% 乙醇冲洗。

2. Xenopus laevis 胚胎培养与抑制剂处理

  1. 体外受精与Xenopus卵的培养：
    1. 采用已发表的标准方法22,23获取并培养Xenopus laevis胚胎。
    2. 简言之，将成年雄性置于0.05%苯佐卡因溶液中浸没处死。解剖取出睾丸，并保存于睾丸储存缓冲液中。对成年雌性注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），在高盐MBS中收集卵子，并用解剖获得的睾丸组织进行体外受精（图2A,B）。
    3. 将胚胎在0.1x MBS中、15 °C条件下培养至所需发育阶段（根据Nieuwkoop和Faber建立的Xenopus laevis正常发育表确定胚胎阶段24,25）。
      1. 本实验中，培养胚胎至第22期（受精后24小时，hpf），在体视显微镜下使用两对尖头镊子去除卵黄膜。用标准的一次性转移移液管将胚胎转移至洁净的培养皿（直径100 mm）中，内含30–40 ml 0.1x MBS。
  2. Xenopus胚胎的抑制剂处理（见图2）：
    1. 使用校准过的移液器向24孔培养板的各孔中加入1 ml 0.1x MBS。用细头记号笔在孔外侧标记液面位置（图2D，插图）。同时用记号笔在24孔板盖上标注各孔将要添加的处理成分。将这些信息同步记录至实验记录本中的24孔板设置页。
    2. 使用标准的一次性转移移液管将5–10个胚胎转移至每个孔中（图2C）。确保每孔中胚胎数量相同。
    3. 添加或移除0.1x MBS，使液体体积与标记的1 ml刻度线齐平（图2D）。加入适当体积的DMSO（使终浓度为1%），轻轻混匀。注意避免将DMSO直接滴加在胚胎附近，并防止胚胎与缓冲液表面接触。
    4. 向指定孔中加入相应体积的化学药物，并再次轻轻混匀。本实验中，向1 ml 0.1x MBS中加入1 μl 10 mM BMS-453（视黄酸受体拮抗剂）和9 µl DMSO。
    5. 若该化学物质对光敏感，用铝箔 loosely 包裹培养板。将胚胎置于15 °C培养箱中继续培养至所需发育阶段。本示例中，处理时间为16–18小时。
  3. 将胚胎从处理液中洗出并继续培养至蝌蚪阶段：
    1. 用一次性转移移液管吸出每孔中一半至四分之三的液体，注意不要扰动胚胎。使用新的移液管向孔中补充0.1x MBS至原体积。重复此洗涤步骤3–6次。
    2. 将胚胎转移至大培养皿（直径150 mm）中，内含100 ml含庆大霉素（1 ml/L）的0.1x MBS。在15 °C下继续孵育胚胎，直至其发育至第42–45期（82–100 hpf）。
    3. 每天更换含庆大霉素的0.1x MBS溶液，并及时移除死亡胚胎，以防污染或导致其他胚胎死亡。在实验记录本中记录死亡胚胎数量。
  4. 用多聚甲醛（PFA）固定胚胎：
    1. 在胚胎发育至第42–45期之间（分别为82和100 hpf）时，将其转移至新的24孔培养板中（每孔含1–2 ml 0.1x MBS）进行固定。板盖上的标签信息应与上述处理设置（第2.2.1节）一致。
    2. 尽可能吸除各孔中的0.1x MBS，但仍保留足够液体以覆盖胚胎，并尽量减少操作接触以避免损伤。加入1–2 ml含0.05%苯佐卡因的0.1x MBS溶液，孵育至胚胎对刺激无反应为止。
    3. 加入1–2 ml 4% PFA。也可根据需要将胚胎放入已标记的微量离心管中进行固定。
    4. 将胚胎在4 °C、旋转摇床上用PFA固定24小时。随后用PBT缓冲液洗涤3–4次，每次间隔3–5小时，以去除PFA。

3. 口面部区域的摄影 非洲爪蟾 蝌蚪

  1. 拍照前准备（如图3所示）：
    1. 将固定好的胚胎置于一个大培养皿（直径150 mm）中，内含约100 ml PBT缓冲液。
    2. 进行两次切口以将头部与身体分离（图3A，实心黑线）。首先用一对镊子夹住胚胎，用无菌手术刀在肠道后侧做第一道切口（图3B）；然后在肠道前侧、靠近心脏处做第二道切口，以完全移除头部（图3C）。
    3. 使用标准的一次性移液器将分离的胚胎头部转移至铺有黏土的培养皿（第1.2.2部分）中。
      1. 拍摄正面视图时，使用两对镊子将胚胎头部腹面朝下放置于圆形凹陷内。用镊子同时调整胚胎头部及其周围黏土的位置，使所有胚胎均朝向相机，且不向后或向两侧倾斜（图3D）。用镊子或玻璃移液工具轻轻推动头部周围的黏土，以固定头部位置。
      2. 拍摄侧面视图时，用镊子将胚胎头部侧放于圆形凹陷内，确保所有胚胎朝向一致且紧贴黏土表面。调整胚胎头部及周围黏土，使所有胚胎的胶腺均以相同角度朝下（图3E）。利用解剖针划出的参考线作为引导，确保侧面测量时的准确性。
  2. 拍摄蝌蚪头部图像：
    1. 使用配备数字相机及相应相机软件的体视显微镜拍摄蝌蚪头部图像。采用对所有胚胎均能保持恒定的最高放大倍数。
    2. 将胚胎居中并使其朝向一致。在最佳照明条件下拍摄，以获得最清晰的口面部区域图像。调整光源位置以避免产生过重阴影。将图像以最高分辨率保存为.tiff格式文件。

4. 在Xenopus 蝌蚪中测量和分析面部大小尺寸

  1. 测量口面部尺寸（总结见图4）：
    1. 确定面部宽度。找到每侧眼睛腹侧边缘与面部外周相交的点（图4A，箭头所示），测量这两个点之间的距离（图4A，红线）。
    2. 确定面部高度。首先通过测量两眼之间的距离并计算中点来确定中线。接着绘制两条水平线，分别标记眼睛最背侧的边缘和胶腺最背侧的点（图4B，白线）。在中线上测量两条水平线之间的距离（图4B，红线）。
    3. 确定口面部区域面积。使用标记眼睛和胶腺最背侧边缘的相同水平线作为面积测量的参考（图4C，白线）。从标记胶腺顶部的水平线与面部左侧外周相交的点开始（图4Ca）。
      1. 沿面部边缘绕过眼睛，直到标记眼睛顶部的水平线与面部外周相交的点（图4Cb）。继续沿此最背侧的水平线追踪，直到其与面部右侧外周相交的点（图4Cc）。
      2. 再沿面部边缘向下追踪，直到标记胶腺顶部的最腹侧水平线与面部右侧外周相交的点（图4Cd）。然后继续沿此底部水平线追踪，直至回到起始点。使用图像编辑软件计算该闭合轨迹内的面积。
    4. 确定吻部长度。在侧视图像上，画一条垂直线标记眼睛最前端。然后测量从面部与胶腺背侧边缘相交处的最前端点到标记眼睛前端的垂直线之间的水平距离（图4D）。
    5. 确定口部宽度。测量口部开口上下“唇”左右两侧交汇点之间的水平距离（图4E）。这些点可视为蛙类的口角等效位置。
    6. 确定口部圆度。将口部圆度计算为反向长宽比，公式为 (4 × [面积]) / (π × [长轴]2)。
      1. 在图像编辑软件中使用套索工具，按图4F所示追踪口部开口的边缘。在主工具栏中选择“分析”（Analyze），然后选择“测量”（Measure）。或者，也可根据口部开口的面积和直径测量值手动计算圆度。
  2. 面部尺寸的数据分析：
    1. 将面部尺寸的测量数据输入数据分析软件，以比较处理组与对照组。分别计算实验组和对照组各项测量值的平均值，用于绘制柱状图。计算标准差以生成误差线。进行Student t检验以进行组间统计学比较。
      注意：由于胚胎间发育速率存在轻微差异，该数据可能具有较大变异性。

5. 口面部形态的定量分析与形态测量学

  1. 放置标志点并创建标志点坐标文件（如图5A所示）。
    1. 选择标志点时，应确保其能够捕捉目标图像的形态特征，并可在所有待分析样本中重复放置于相同的相对位置。若某一结构并非存在于所有样本中，则不应在该结构上放置标志点。
      1. 此处放置24个标志点，以代表具有明显特征（如眼睛、鼻孔和嘴）的中面部区域。为保持一致性，可在先前已放置的标志点之间中点处添加新标志点（例如嘴部标志点，见图5Ai）。
    2. 获取标志点坐标并创建“标志点坐标文件”。打开一个蝌蚪面部的第一张图像（例如，第一个对照组胚胎）。
      1. 在主工具栏中选择“Plugins”选项卡，从下拉菜单中选择Pointpicker。选择“Add Points”选项卡，并在所需位置放置标志点，标志点将以多色十字形式显示（图5Ai）。
      2. 放置完成后，选择“Move crosses”工具移动标志点位置。当所有标志点均已在图像上定位后，在主工具栏中选择“Display Results”选项卡，点击“Show”（图5Aii），以显示标志点坐标，并将其复制到电子表格程序中（图5Aiii）。
      3. 将第一个胚胎的这些坐标粘贴至电子表格程序时，在数据上方留出一个空行。在该空行的B列（第1行）输入“LM= ”，后接样本中的标志点数量。此处输入“LM= 24”，因为共创建了24个标志点（图5Aiii，红框）。
      4. 在数据点下方的行中输入“ID=”，后接用于标识样本的名称。例如在图5Aiii中输入“ID=CON1”，表示这是第一个对照组胚胎的标志点坐标数据（图5Aiii，红色箭头）。
      5. 对实验中每个胚胎（实验组和对照组）的面部重复此过程，直至所有标志点坐标均已录入电子表格。
        注意：每个胚胎在“ID=”行中必须赋予唯一名称。例如，下一组标志点坐标被赋予ID“CON2”，因其为对照组中的第二个胚胎。
      6. 将第二列和第三列的全部内容复制到文本文档中，并保存为.txt文件。
  2. 设置形态测量软件以进行数据分析（如图5B所示）。
    1. 在形态测量软件的主菜单中选择“Create New Data Set”。在弹出窗口中的相应输入框中命名文件和数据集（例如分别命名为“Retinoic Acid Inhibition”和“Facial landmarks”）（图5Bi）。将文件导入为TPS格式，并选择坐标文本文件以创建数据集（图5Bi，红色箭头）。
    2. 数据对齐与Procrustes拟合：
      1. 执行Procrustes拟合与对齐。在“Project Tree”选项卡中高亮显示数据集，选择主工具栏中的“Preliminaries”，然后在下拉菜单中选择“New Procrustes Fit”。
      2. 选择“Align by Principal Axis”，并在窗口底部点击“Perform Procrustes Fit”（图5Bii，红色箭头）。返回“Preliminaries”下拉菜单，选择“Generate Covariance Matrix”（图5Biii），然后点击“Execute”。
      3. 在“Results”选项卡中查看协方差矩阵的相关性。
    3. 通过为数据集中的每个样本分配适当的分类变量，创建“分类器文件”，以区分其属于实验组还是对照组。
      1. 在电子表格中创建两列。第一列标题标记为“ID”，并填入每个样本对应的ID（例如CON1、RARINHIB1等；图5Biv）。第二列标题标记为“TREATMENT”，并在每个单元格中填入与相邻ID单元格所列样本对应的处理组。
      2. 此处使用“CONTROL”和“RAR INHIBITOR”作为分类标签（图5Biv）。将其复制到文本文档中并保存为.txt文件。在形态测量软件中导入分类变量，选择“Match by Identifier”，并打开该文本文件（图5Bv）。
  3. 通过选择“Variation”下拉菜单并点击“Principal Component Analysis”来创建主成分分析（PCA）散点图（图6Ai）。接着选择“Graphics”选项卡，将出现三个附加选项卡：PC形状变化、特征值和PC得分（图6Aii）。“PC scores”选项卡显示Procrustes拟合标志点数据的双变量主成分散点图（图6Aii）。
    1. 如需更改所绘制的主成分，可在绘图区域调出弹出菜单，并选择要更改的坐标轴（图6Aiii，红色箭头）。
    2. 选择“Color Data Points”工具（图6Aiii）。在出现的第二个弹出菜单中选择先前导入的分类器（第5.2.2节），以确定每个类别的颜色（图6Aiv）。
    3. 在“Results”选项卡中查看各主成分所解释的方差量（图6Av）。将图形导出为.bmp文件。
  4. 在形态测量软件中，通过在“Comparison”选项卡下选择“Discriminant Function Analysis”来创建判别函数分析（DFA）变换网格（图6Bi）。在弹出菜单中，确保已选择正确的数据集，且数据类型为Procrustes拟合坐标。
    1. 高亮选择需比较的组别对，并运行1,000次置换检验（图6Bii）。
    2. 在“Graphics”下，于“Shape Difference”选项卡中查看坐标向量图（图6Biii）。若图像倒置，可在绘图区域调出弹出菜单，将图翻转至正确方向（图6Biii）。
    3. 向量的方向表示第一组相对于第二组的形态差异，该信息在运行分析前可在判别函数菜单中查看（图6Bii）。如需反转向量方向，可在绘图区域调出弹出菜单，将比例因子的符号更改为负值（图6Biii,iv）。比例因子的数值通常设为10的倍数，以最佳反映两组间标志点位置的统计学差异且不产生形变，一般保留默认值（图6Biv）。
    4. 同样在弹出菜单中，将图形更改为变换网格，以将向量叠加至网格上（图6Biii,v）。
    5. 在弹出菜单中指定网格的水平线和垂直线数量（图6Biii,v）。
    6. 将图形导出为.bmp文件。
    7. 在“Results”选项卡下查看Procrustes距离、Mahalanobis距离及p值（图6Bvi）。
  5. 适用于评估多个处理组的其他形态测量分析
    1. 创建主成分分析变换网格。“PC Shape Changes”选项卡显示解释各组内变异的形态变化向量图。使用绘图区域的弹出菜单正确调整图像方向，并将向量叠加至变换网格上。将比例因子设置为PC得分图x轴上对应于对照组估计中心的数值。将图像导出为.bmp文件。
    2. 创建CVA散点图。在主工具栏的“Comparison”选项卡下选择“Canonical Variate Analysis”，并高亮显示先前导入的分类变量集（参见第5.2.3节）。设置置换检验的迭代次数为1,000次，点击“Execute”。选择“CV scores”选项卡以查看双变量CVA散点图。该图根据上传的分类器进行颜色编码。通过调出绘图区域的弹出菜单更改配色方案（参见第5.3.3节）。导出为.bmp文件。
    3. 创建CVA变换网格。在比较超过两组时，可生成CVA结果的变换网格。在“Graphics”选项卡下选择“CV Shape Changes”，以可视化标志点坐标的变换网格。调出绘图区域的弹出菜单，更改向量方向，将结果叠加至变换网格，并指定网格线数量。将图形导出为.bmp文件。

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结果

在此，通过对面部大小和形状进行定量分析，比较了经视黄酸受体抑制剂（RAR抑制剂）处理的胚胎与未经处理的对照组胚胎。胚胎在发育第24至30期（26–35 hpf）期间，用1 μM浓度的该化学抑制剂处理，随后洗去抑制剂，并在第42期（82 hpf）固定。然后按照本方案所述方法进行处理和分析。结果为原始数据，但与先前发表的研究结果一致2,3。对照组胚胎使用溶剂DMSO处理，发育正常（图7Ai,ii）。经1 μM浓度RAR抑制剂处理的胚胎则表现出面部轻微变窄、眼部异常，以及形态畸形的胚胎口裂，其形状更趋于三角形（图7Aiii,iv）。

首先，测量了传统的口面部尺寸，结果总结于图7B中。通过学生t检验（假设抑制剂处理胚胎组与对照组之间方差不等）确定统计学显著性。我们发现，与对照组相比，RAR抑制剂处理的胚胎其吻部长度和面部宽度均显著减小（p值分别为0.0062和0.0058；图7Bi,ii）。而面部高度和口部圆形度则显著增加（p值分别为...

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讨论

Xenopus laevis 已成为解析口面部发育潜在发育机制的有用工具；然而，目前尚无描述青蛙该区域大小和形状变化的实验方案。本文所述方法将通过实现对 Xenopus 及其他脊椎动物口面部表型更严格的量化，显著推动口面部发育领域的发展。

正确执行本方案的第一个、也是最关键的方面，是能够准确且可重复地测量面部尺寸并确定标志点的位置。为此，必须以相同的角度、方向和放大倍数对胚胎面部进行拍照。在测量吻部长度时需特别小心，因为很难从侧面操作胚胎并实现一致的摆放位置。由同一个人在同一天完成所有测量，可最大限度地减少此类误差，同时提高结果的可重复性。确保获得良好结果的第二个最关键方面是减少不必要的变异性，例如发育差异或遗传背景差异。在评估细微缺陷之间的统计学显著性时，这一点尤为重要。因此，胚胎在处理和拍照时应处于相同的发育阶段。此外，应确保各处理组之间及内部的发育速率相当。为降低此类变异性问题，需确保所有胚胎来自同一对亲本，并在实验开始时进行发育阶段匹配。同时应减少外部变异来源，例如不同的缓冲液来源和体积、不同数量的胚胎，以及培养皿中胚胎分布的差异（例如，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

VCU 提供给 A. Dickinson 的启动资金支持了本项工作。

作者谨此感谢 Dan Nacu 凭借其艺术才华创作了示意图。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
解剖显微镜Zeiss配备 AxioCamICC1 相机
Dumont #5 Inox 镊子精细科学工具公司11251-10
无菌一次性手术刀Sklar06-2015
24孔板费希尔科技公司087721
标准一次性移液管费希尔科技公司13-711-7M
150 mm × 15 mm 培养皿Falcon351058
培养箱Ectotherm设定为 15 °C 或 20 °C
造型黏土Premo 或其他无毒造型黏土黑色或白色
直头解剖针赛默飞世尔科技公司19010
毛细管（用于制针）FHC30-30-1硼硅酸盐，外径 1.0 mm × 内径 0.5 mm / 纤维，每根 100 mm
针式拉制仪，型号 P-97Sutter Instrument Co.针式拉制仪：P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪；灯丝：FB300B灯丝使用 Sutter 3.00 mm 方形盒装灯丝，宽度 3.0 mm。
移液器GilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSO美国生物分析公司AB00435-01000
半胱氨酸Sigma-Aldrich52-90-4
多聚甲醛粉末Sigma-Aldrich158127
培养皿Falcom353003, 351058直径分别为 100 mm 和 150 mm
100% 乙醇VWR89125-170

参考文献

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
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