Xenopus 口面部表型的定量分析

摘要

已开发出一种用于量化非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎口面部大小和形状的方法。本实验方案结合了传统的尺寸测量与几何形态测量学，以实现对口面部发育及其缺陷进行更深入的分析。

摘要

非洲爪蟾已成为解析颅面发育及其缺陷机制的重要工具。一种量化口面部发育的方法将有助于对经遗传或分子手段调控基因表达或蛋白质功能的物质处理后所产生的口面部表型进行更严谨的分析。通过胚胎头部的二维图像，可测量传统的尺寸参数，如口面部宽度、高度和面积。此外，还采用胚胎口部开口的圆形度指标来描述口部形状。同时对这些二维图像进行几何形态测量学分析，以更精细地揭示口面部区域形态的变化。在口面部区域特定位置设定标志点并生成坐标，利用主成分分析将这些标志点坐标降维至主成分，从而区分不同处理组。结果以散点图形式展示，具有相似口面部形状的个体在图中聚集在一起。进行判别函数分析也十分有用，该方法可对两组处理间的标志点位置进行统计学比较。该分析结果呈现在一个变换网格上，标志点位置的变化以矢量形式显示。将网格叠加于这些矢量之上，可展示出显著变化的标志点位置所形成的形变模式。判别函数分析中的形态变化基于统计学度量，因此可通过 p 值进行评估。该分析方法简便易行，仅需体视显微镜和免费软件即可完成，因而将成为一项有价值的研究与教学资源。

引言

在人类最常见的严重出生缺陷中，影响口腔和面部的缺陷尤为突出，例如口面裂¹。患有口面结构畸形的儿童在其一生中需要接受多次手术，并面临面部畸形、言语、听力和进食障碍等问题。因此，推动颅面和口面发育领域的新研究对于预防和治疗此类出生缺陷至关重要。Xenopus laevis 已成为解析调控颅面发育机制的一种新工具（相关研究实例包括^2,3,4-11）。因此，若能建立一种定量分析该物种头部和面部在发育过程中大小与形态变化的方法，将具有重要意义³。

本文介绍一种方法，该方法结合传统的尺寸测量与源自 Xenopus 研究¹² 以及大量分析人类面部形态的研究^13-15 所采用的几何形态测量学技术。本实验方案的目标是使研究人员能够量化面部的大小和形态，以区分正常与异常发育过程中的不同口面部表型。该分析方法有助于更精确地区分细微的颅面缺陷，例如由基因之间和/或环境因素之间的协同效应所引起的缺陷。此外，这种定量方法还可能揭示口面部缺陷的轻微改善或表型挽救。因此，该方法可作为分析潜在治疗手段的有效指南。

我们在此提出的面部测量与几何形态测量学相结合的方法，能够对口面部区域的大小和形状进行比现有方案更为全面的统计分析，而现有方案在很大程度上仅单独使用其中一种方法^15-18。此外，我....

方案

使用Xenopus laevis进行的所有实验均已获得IACUC批准（方案编号 #AD20261）。

1. 准备试剂和所需材料

1. 试剂：
   1. 配制 1 L 的 10× MBS（改良 Barth 氏生理盐水）溶液²²。将 NaCl（880 mM）、KCl（10 mM）、MgSO₄（10 mM）、HEPES（50 mM，pH 7.8）和 NaHCO₃（25 mM）加入 1 L 去离子水中。用 NaOH 调节 pH 至 7.8。
   2. 通过将 100 ml 10× MBS 溶液加入 900 ml 去离子水中，稀释配制 1 L 的 1× MBS 溶液。再加入 0.7 ml 的 1 M CaCl₂ 溶液。
   3. 通过将 100 ml 1× MBS 溶液加入 900 ml 去离子水中，稀释配制 1 L 的 0.1× MBS 溶液。向 1 L 0.1× MBS 溶液中加入 1 ml 的 10 mg/ml 庆大霉素溶液，用于胚胎培养。
   4. 在 100 ml 10× MBS 中溶解 4 ml 的 5 M NaCl，配制高盐 MBS 溶液，然后加入去离子水至总体积为 1 L。
   5. 使用去离子水将 100% 乙醇稀释，配制 70% 乙醇。
   6. 用二甲基亚砜（DMSO）....

结果

在此，通过对面部大小和形状进行定量分析，比较了经视黄酸受体抑制剂（RAR抑制剂）处理的胚胎与未经处理的对照组胚胎。胚胎在发育第24至30期（26–35 hpf）期间，用1 μM浓度的该化学抑制剂处理，随后洗去抑制剂，并在第42期（82 hpf）固定。然后按照本方案所述方法进行处理和分析。结果为原始数据，但与先前发表的研究结果一致^2,3。对照组胚胎使用溶剂DMSO处理，发育正常（图7Ai,ii）。经1 μM浓度RAR抑制剂处理的胚胎则表现出面部轻微变窄、眼部异常，以及形态畸形的胚胎口裂，其形状更趋于三角形（图7Aiii,iv）。

首先，测量了传统的口面部尺寸，结果总结于图7B中。通过学生t检验（假设抑制剂处理胚胎组与对照组之间方差不等）确定统计学显著性。我们发现，与对照组相比，RAR抑制剂处理的胚胎其吻部长度和面部宽度均显著减小（p值分别为0.0062和0.0058；图7Bi,ii）。而面部高度和口部圆形度则显著增加（p值分别为.......

讨论

Xenopus laevis 已成为解析口面部发育潜在发育机制的有用工具；然而，目前尚无描述青蛙该区域大小和形状变化的实验方案。本文所述方法将通过实现对 Xenopus 及其他脊椎动物口面部表型更严格的量化，显著推动口面部发育领域的发展。

正确执行本方案的第一个、也是最关键的方面，是能够准确且可重复地测量面部尺寸并确定标志点的位置。为此，必须以相同的角度、方向和放大倍数对胚胎面部进行拍照。在测量吻部长度时需特别小心，因为很难从侧面操作胚胎并实现一致的摆放位置。由同一个人在同一天完成所有测量，可最大限度地减少此类误差，同时提高结果的可重复性。确保获得良好结果的第二个最关键方面是减少不必要的变异性，例如发育差异或遗传背景差异。在评估细微缺陷之间的统计学显著性时，这一点尤为重要。因此，胚胎在处理和拍照时应处于相同的发育阶段。此外，应确保各处理组之间及内部的发育速率相当。为降低此类变异性问题，需确保所有胚胎来自同一对亲本，并在实验开始时进行发育阶段匹配。同时应减少外部变异来源，例如不同的缓冲液来源和体积、不同数量的胚胎，以及培养皿中胚胎分布的差异（例如，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖显微镜	Zeiss		配备 AxioCamICC1 相机
Dumont #5 Inox 镊子	精细科学工具公司	11251-10
无菌一次性手术刀	Sklar	06-2015
24孔板	费希尔科技公司	087721
标准一次性移液管	费希尔科技公司	13-711-7M
150 mm × 15 mm 培养皿	Falcon	351058
培养箱	Ectotherm		设定为 15 °C 或 20 °C
造型黏土	Premo 或其他无毒造型黏土		黑色或白色
直头解剖针	赛默飞世尔科技公司	19010
毛细管（用于制针）	FHC	30-30-1	硼硅酸盐，外径 1.0 mm × 内径 0.5 mm / 纤维，每根 100 mm
针式拉制仪，型号 P-97	Sutter Instrument Co.	针式拉制仪：P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪；灯丝：FB300B	灯丝使用 Sutter 3.00 mm 方形盒装灯丝，宽度 3.0 mm。
移液器	Gilson	F144802, F123600, F123602
BMS-453	Tocris	3409
DMSO	美国生物分析公司	AB00435-01000
半胱氨酸	Sigma-Aldrich	52-90-4
多聚甲醛粉末	Sigma-Aldrich	158127
培养皿	Falcom	353003, 351058	直径分别为 100 mm 和 150 mm
100% 乙醇	VWR	89125-170