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EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。I. 病毒样品的采集

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DOI：

10.3791/52067

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2015年3月28日

 ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S Environmental Protection Agency, 2Technical Support Center, Office of Ground Water and Drinking Water, U.S Environmental Protection Agency

本文内容

摘要

EPA 方法 1615 使用带正电滤膜来浓缩环境水和饮用水中的肠道病毒和诺如病毒。本论文描述了用于方法 1615 分析的样品采集程序。

摘要

EPA 方法 1615 的制定目标是提供一种用于检测环境水和饮用水中肠道病毒和诺如病毒的标准方法。该方法的标准化采样步骤通过将至少规定体积的水样流经带正电荷的滤芯过滤器，从而实现对水中可能存在的病毒进行浓缩。地表水和处理后/地下水的最低规定采样体积分别为 300 L 和 1,500 L。该方法的一个主要局限在于，过滤器在达到所需采样体积前容易发生堵塞。采用两种不同但等效的滤芯过滤器进行的研究表明，其中一种滤芯类型在 10% 的样品中出现堵塞问题，而另一种滤芯类型的堵塞率为 6%。堵塞情况通常随浊度升高而增加，但仅凭浊度测量值无法准确预测堵塞的发生。从成本角度考虑，其中一种滤芯更具优势，但在选择过滤器时，还应综合考虑待采样水系统的水质状况及实际操作经验。

引言

人类肠道病毒在胃肠道内复制，并通过粪-口途径传播。这些病毒常以高浓度存在于污水中1-3。它们可在污水排放物4,5以及地表水6,7、地下水8-10和处理后的饮用水11中长期存活。在美国，环境水体中若存在病毒，其浓度通常过低，无法直接检测12,13。因此，需要从大量水样中浓缩病毒。在美国环境保护署（USEPA）开展的信息收集规则（ICR）监测中14，全国大型供水系统水源水中阳性样本的病毒浓度范围为每升0.009至19.7个最可能数（MPN）感染单位（MPN/L）。流动溪流水源水阳性样本的中位数和平均浓度分别为0.03和0.17 MPN/L，湖泊和水库水源水为0.01至0.07 MPN/L，地下水水源水为0.04至0.74 MPN/L11（数据来源于2000年4月25日发布的ICR Aux1十八个月访问数据库）。在USEPA一项全国地下水研究中，阳性样本的病毒浓度范围为每升0.009至2.12个感染单位，中位数和平均浓度分别为0.13和0.29个感染单位/L8。阳性地下水样本中的病毒浓度高于流动溪流中的浓度。在这些研究中，大多数使用地下水的设施其水源来自喀斯特地区的含水层。与位于其他地质环境中的水源相比，位于喀斯特地区、石灰岩地区以及结晶岩（裂隙基岩）环境中的含水层更可能具有较高的病毒浓度8,15,16。USEPA病毒检测方法规定，地表水采样体积为200 L（ICR）至300 L（方法1615），地下水采样体积为1,000 L（ICR）至1,500 L（方法1615）17,18。然而，即使采用大体积采样，大多数地表水和地下水样本的病毒检测结果仍为阴性8,11,19,20。

地表水中的病毒对饮用水消费者构成潜在健康风险。《地表水处理条例》要求所有使用地表水的水处理厂必须将病毒浓度降低至少4个对数级。即使达到4-log的削减水平，假设暴露水平和处理条件处于平均水平，并依据轮状病毒的剂量-反应参数，水源水中病毒浓度低至0.0044 MPN/L时，仍可能导致每天发生一例感染11,21。由于缺乏处理措施以及病毒的存在，未经处理的地下水中病毒带来的风险可能更高。Borchardt及其同事估计，在使用未经处理地下水的社区中，高达22%的成人急性胃肠炎病例和63%的五岁以下儿童急性胃肠炎病例可能由饮用水中的病毒引起19。

美国环保署（USEPA）方法1615是在《非管制污染物监测条例》第三轮监测周期（UCMR3）中为检测肠道病毒和诺如病毒而制定的22，作为对Borchardt及其同事19,23研究结果的全国性后续跟进。该USEPA方法主要设计用于检测未经处理的地下水系统中的病毒，但其适用范围也较为广泛，可涵盖其他类型的水基质。新方法是一种混合方法，保留了ICR期间所用前代病毒检测方法中的许多组成部分17，同时引入了基于Borchardt et al. 19,23所建立的分子检测程序，并增加了针对诺如病毒的额外引物组24。本文旨在描述采样程序以及在样品采集和运输过程中保持样品完整性的必要步骤。有关该方法整体性能的评估详见Cashdollar et al. 25。本方案适用于地表水和地下水的简单现场采样，无需使用泵和预过滤装置，且待采水样无需调节pH值或去除其中存在的消毒剂。更复杂的采样要求见Fout et al. 17,18。

方案

1. 初步步骤

  1. 组装一个如图所示的标准过滤装置 图1 由进样模块、卡盒外壳模块和出样模块组成，具体如补充材料中所述。
  2. 在首次使用前，应在采样所用的流速下校准流量计/累计器。首次使用后以及使用一个月后应检查校准情况。如果在首次使用后或使用一个月后发现流速校准发生变化，应按照补充材料中所述确定校准检查的频率。
    1. 将排放模块连接至进水模块，然后将进水模块连接到水龙头。将流量计/累计器设置为读取流量。完全打开水龙头，然后使用青铜截止阀将流量调节至10 L/min。当流量稳定在10 L/min后，重置流量计/累计器以读取累计体积。
    2. 将排放模块的出口置于一个4升或更大容量的量筒中，同时将累计流量计归零。当量筒达到4升刻度时，记录累计流量计的读数以及达到该刻度所需的时间。将流量计/累计流量计设置恢复为流量速率模式。
      注意：如果在完成步骤 1.2.2 后，流速降至 9.95 L 以下或升至 10.05 L 以上，请等待流速稳定后重复步骤 1.2.2。校准正确的流量计应在 24 ± 1 秒时使量筒液面达到 4 L 刻度线，累计流量计读数为 4.0 ± 0.04 L。
    3. 如果总量计读数小于 3.96 L 或大于 4.04 L，需计算校正因子以校正观测到的差异。例如，当流量计/总量计在量筒 4 L 刻度处读数为 3.9 L 时，校正因子为 1.026（4 ÷ 3.9）。因此，若目标野外样品体积为 300 L，则根据流量计/总量计读数应采集的体积为 300 ÷ 1.026 = 292.4 L。
  3. 对标准过滤装置进行灭菌，并准备用于样品采集。
    1. 使用0.525%次氯酸钠对进液模块和滤筒外壳模块进行灭菌，每次使用前至少处理30分钟；可通过将模块完全浸入溶液中，或使用泵使次氯酸钠流经模块的方式完成。用无菌去离子水冲洗模块2O，然后在每升无菌试剂级水中加入50 ml 1 M硫代硫酸钠的溶液中脱氯5分钟。用无菌铝箔覆盖滤膜采样装置模块的两端。
    2. 在无菌条件下，将一个带正电荷的滤芯安装到滤器外壳模块中。
      注意：请确保滤筒式过滤器正确安装在滤壳内。正确安装的过滤器不会泄漏，且在摇动时滤芯在滤壳内不会移动。正确安装的过滤器密封圈上会留有明显的压痕，显示滤芯与密封圈的接触位置。每次将过滤器从滤壳中取出后，应立即检查密封圈是否存在压痕。
    3. 在样品数据表上记录唯一的样品编号（示例参见补充材料），然后将滤膜采样装置和样品数据表连同有关样品采集的必要说明一并交给负责采集现场样品的人员例如样本体积，采样位置 等等。).

2. 采样现场样品采集的准备工作

  1. 到达采样现场后洗手并戴上外科手套，以尽量减少样本污染的可能性。如有肠道或呼吸道症状，不得采集样本。应频繁更换手套，特别是在接触水龙头和其他可能被污染的物品后。
  2. 在样本数据表上记录相关的样本追踪信息。相关信息包括采样地点和样本编号、采样人员姓名，以及设备型号和序列号。
  3. 打开水龙头放水 2–3 分钟，以清除管道中沉积的碎屑。如有需要，可在此步骤中使用园艺软管或管路将水流引导至排水口。
  4. 若采样装置模块已连接，请先将其断开，并用无菌铝箔保护滤筒外壳模块的开口端。将排放模块连接至进水模块，然后将两者连接到水龙头。在排放模块末端接上园艺软管，并将软管的自由端放入1 L聚丙烯容器中。
  5. 打开水龙头，使至少75 L待测水样通过该装置。
    1. 在冲洗过程中，测量并记录流入聚丙烯容器的水样的水质参数——余氯、pH、温度和浊度。
    2. 关闭水龙头后，将排放模块从进水模块上断开，然后将滤筒外壳模块连接至进水模块的出口端，再将排放模块连接至滤筒外壳模块的出口端。将累计流量计读数重置为零。

3. 野外样本采集

  1. 记录初始累计流量计读数以及日期和时间，然后缓慢打开水龙头。
    1. 确保滤芯外壳处于直立位置，并完全充满水。某些外壳上设有排气按钮，可在填充过程中按压以排出壳体内的空气。
    2. 完全打开水龙头。使用青铜截止阀调节流速至 10 L/min，然后记录初始流速。
  2. 根据累计流量计读数（必要时进行校正），使 300 L 地表水或 1,500 至 1,800 L 地下水通过装置。如果在达到所需体积之前滤膜发生堵塞，且已收集超过一半的体积，可使用第二个滤芯外壳模块继续收集剩余样品（如有备用模块）。
  3. 当采样体积接近采样周期结束时，观察流速，然后关闭采样水龙头的水流。记录最终流速、日期、时间、最终累计流量计读数以及总采样体积。
  4. 将过滤采样装置从水龙头上断开。将滤芯外壳模块与其他模块分离。
    1. 将滤芯外壳倒置，使多余水分流出，直至进水口和出水口均无水排出为止。
    2. 将外壳恢复直立，用无菌铝箔覆盖两端的快速接头。将外壳放入一个或多个可密封的塑料袋中。
    3. 排空进水和出水模块中的水。将这些模块放入一个或多个可密封的塑料袋中。

4. 野外样品的运输

  1. 将滤膜采样装置模块放入保温储存和运输箱中。
  2. 在储存和运输用冷藏箱中加入冷冻冰袋或双层密封袋装的冰块，以确保样品在运输过程中保持在1-10 °C之间。使用两个大型或6-8个小型冰袋通常已足够。
  3. 在保温储存与运输箱内放置温度记录装置，位置应避免与冰袋或冰盒直接接触。
    注意：如果分析实验室在样本到达并打开容器后立即使用可视红外测温仪测量 cartridge 外壳温度，则温度记录装置为可选。
  4. 用填充材料填满所有空隙，然后将装在可密封塑料袋中的样本数据表放在顶部。关闭保温储存和运输箱，并用胶带封好，以防漏水。
  5. 将样品运送至分析实验室，确保样品在野外采样开始后24小时内送达分析实验室即，步骤 3.1 中记录的时间）。

结果

滤器堵塞是方法1615中可能遇到的一个主要潜在问题。堵塞会降低水通过滤器的流速。在某些情况下，可通过打开截止阀以允许更大的流量来克服这一问题。而在其他情况下，滤器会在达到所需体积之前完全堵塞。表1显示了滤器类型、水体类型和浊度对样品体积减少比例的影响。地下水和地表水样品均出现了堵塞现象，对于地下水样品，基于氧化铝纳米纤维的滤器表现优于基于季铵盐的滤器，而地表水样品的情况则相反。总体而言，使用基于季铵盐的滤器采集的样品中有6%未能达到规定体积，而使用基于氧化铝纳米纤维的滤器采集的样品中有10%因堵塞未能达到规定的最小指定体积。通常情况下，堵塞随浊度增加而加剧，但导致浊度的成分多种多样，其中一些成分并不会引起堵塞。例如，在ICR研究期间发生的所有堵塞事件中，有43%仅局限于两个河流系统（数据未显示）。在ICR研究中，地表水的最低目标采集体积为200 L。研究期间的平均采集体积为217 ± 32 L，中位体积为208 L（数据来自2000年4月25日的ICR Aux1 18个月访问数据库）。因此，即使在浊度较高的水体中，仍可从许多水源中成功采集到完整体积的样品。

ICR 要求在浊度超过 75 NTU 时使用预滤器，但即使使用预滤器，在浊度超过 75 NTU 的水体中采集的样本仍有 34% 发生堵塞。方法 1615 建议在浊度超过 50 NTU 的水体中使用预滤器；然而，自方法 1615 发布以来，除该方法列出的预滤器外，已测试了多种其他预滤器选项。这些选项均未显著提高采样体积（数据未显示）。

显示进水、滤芯外壳和排水模块的水过滤系统示意图。
图1. 标准过滤装置。标准过滤装置由进水模块、滤芯外壳模块和排水模块组成（各模块的描述详见补充材料）。请点击此处查看该图的放大版本。

总样本数 a缺陷样本数 b缺陷样本百分比浊度 (NTU)
使用 NanoCeram 滤膜的地下水 c
11311< 20
使用 NanoCeram 滤膜的地表水 c
831214< 20 d
845020 - < 50
6583≥ 50 d
NanoCeram 总计 c
2102210≥ 0
使用 1MDS 滤膜的地下水 c
3747520< 20
使用 1MDS 滤膜的地表水 c
2,693271 e< 20 e
505367 f20 - < 50 f
1221916 e50 - < 75 g
1756034 e,f≥ 75 e,f,g
1MDS 总计 c
3,8692176≥ 0

表1. 滤膜承载能力。a 样本来源于以下研究，这些研究提供了体积和浊度数据：1）美国环保署（USEPA）ICR 研究（数据来自2000年4月25日发布的ICR Aux1 18个月访问数据库），2）USEPA 地下水研究8，3）USEPA 劳伦斯和洛威尔（马萨诸塞州）研究（未发表数据），4）USEPA 密西西比河研究（未发表数据），5）USEPA 饮用水处理厂研究（未发表数据），6）USEPA 方法1615评估研究25，以及7）UCMR3监测的前三个月（未发表数据）。b 在达到各研究规定的最低取样体积前滤膜已堵塞的样本。地表水的最低体积为200 L，地下水为1,500 L；但在USEPA ICR研究中，对于被归类为“受地表水影响的地下水”的水源，最低体积为200 L，而在USEPA地下水研究中为1,893 L。c 使用NanoCeram滤膜与1MDS滤膜采集样本时，能够完成规定最低体积采集的能力存在显著差异（P = 0.002）；总体而言，地表水与地下水之间也存在显著差异（P < 0.001），且对每种滤膜类型分别进行比较时亦均存在显著差异（P < 0.001），采用Mann-Whitney秩和检验进行分析。d–g 具有相同上标字母的组别之间差异显著（P < 0.05），依据Kruskal-Wallis秩次单因素方差分析及Dunn's成对多重比较程序确定。所有统计检验中的因变量均为通过滤膜的水量占规定最低体积的比例，最大值设为1.0。

讨论

多年来，已使用多种类型的滤膜从环境水体中浓缩病毒26。目前常用的方法包括超滤膜27、负电荷滤膜13,28,29、玻璃棉滤膜23和正电荷滤膜30。负电荷滤膜曾被广泛使用多年，但在采样前或采样过程中需在野外添加盐类并调节水样的pH值，这一要求限制了其适用性13。对于野外采样而言，最实用的选择是正电荷滤膜。这类滤膜可在无需对水样进行预处理的条件下，以高流速采集大量水样。玻璃棉滤膜成本最低，但其流速较正电荷滤膜慢，且目前无商业化产品供应。超滤膜在较宽范围的水质条件下可实现最高的病毒回收率，但采样所需设备不易携带至野外，且采样耗时显著更长27。近年来已开发出使用预处理负电荷滤膜的方法，以避免在野外进行调节操作，但这些方法可能不适用于采集大体积水样28,29。

EPA 方法 1615 使用带正电荷的滤筒过滤器，其正电荷来源于氧化铝纳米纤维或季铵盐。前者相较于后者的优势在于成本更低，并且能在更广泛的天然 pH 值范围内高效地从水中收集病毒30,31；然而，每种滤筒以及 Borchardt 及其同事所使用的玻璃棉滤器，对水中肠道病毒和诺如病毒的回收率相似23,31,32（Cashdollar，未发表数据）。滤筒被安装在一个简单的采样装置中，该装置的设计旨在简化样品采集过程，并减少采样期间的污染。

当多个分析实验室开展大规模研究时，标准方法具有重要价值。美国环保局方法1615（EPA Method 1615）提供了标准操作程序和指导，以尽量减少影响研究数据的两个主要采样问题：一是采样过程中因污染或设备部件消毒不充分导致的假阳性结果，二是被采水样中的组分堵塞滤膜孔隙的问题。

与肠道病毒因卫生条件不佳而发生人际传播类似，病毒也可能通过未彻底清洗的手或戴有受污染手套的手引入样品中33。采样人员必须了解潜在的污染途径，并在采样过程中采用无菌技术。采样人员应认识到，手套的主要作用是保护操作者免受暴露，而非防止设备受到污染。在开始采样前应洗手，并在佩戴手套时格外小心，以避免手部对手套造成污染。患有胃肠炎或呼吸道症状的采样人员不得进行样品采集，因其可能正在大量排出肠道病毒或诺如病毒。

其次，必须注意防止来自先前采样事件的病毒残留。为了尽量减少这一潜在污染源，方法1615对ICR中的采样装置进行了改进，去除了进样口与滤芯外壳模块之间的压力调节器和压力表。这些组件被移除的原因是在采样过程中观察到的压力始终低于外壳的最高额定压力（例如，5英寸滤筒外壳为125 psi），且难以进行消毒。后续ICR研究中通过设备空白对照的使用揭示了后一问题。 6,20其对ICR数据的影响程度尚不明确，但可能较小；研究期间仅出现两个假阳性的阴性性能评估样本（数据未显示）。为进一步降低交叉污染的可能性，建议每次采样后更换进样模块的管路。若仪器曾用于接种病毒的质量或性能对照，则尤其需要确保充分的消毒。在进行消毒前，应检测游离氯浓度，以确认储存过程中是否存在损失。除上述仪器配置的调整外，还必须定期运行设备空白样，以证明消毒的有效性。方法1615规定，设备空白应使用在接种病毒对照后已进行消毒的仪器来执行，从而简化流程，避免在消毒前需将接种病毒的溶液通过仪器。方法1615将消毒剂浓度提高至0.525%次氯酸盐，因为该浓度既能灭活设备上可能存在的活病毒，又能降解核酸。因此，设备空白必须同时采用细胞培养和qPCR检测进行分析。

在表1所报告的研究中，两种类型的带正电滤膜均出现了堵塞现象。部分样本体积减少的原因尚不明确，可能与采样误差有关，例如对累计流量计读数错误，或为满足其他时间要求而提前终止采样，尤其是在水体浊度低于20 NTU的情况下。堵塞程度取决于滤膜类型及水质参数。使用预滤膜可在一定程度上改善堵塞情况，但若使用预滤膜，应将其与带正电滤膜分开处理和分析。目前针对UCMR3的建议是：若使用第一张氧化铝纳米纤维滤膜至少能够采集到一半的样本体积，则应不使用预滤膜，并采用两张基于氧化铝纳米纤维的滤膜进行采样。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢众多美国环境保护署（EPA）工作人员的贡献，使得信息收集规则（ICR）和第三次未规管污染物监测规则（UCMR3）期间的监测工作得以实施；同时感谢以下其他EPA研究的主要研究人员：Daniel Dahling、Alfred Dufour、Andrey Egorov、Susan Glassmeyer、Asja Korajkic、Richard Lieberman、Robert Safferman 和 Tim Wade；感谢Shannon Griffin和Michael Ware对本文稿的严格审阅。作者感谢Indian Hill水务公司提供其泵房之一，用于演示样品采集过程。尽管本研究已通过美国环境保护署（USEPA）的审查并获准发表，但其内容不一定反映该机构的官方政策。提及商品名称或商业产品并不构成对其使用之认可或推荐。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-L 聚丙烯瓶Nalgene2104-0032
铝箔片Cole-Parmer06275-40
高压灭菌器SterisAmsco Lab Series
气泡膜U.S. Plastics50776
可封口袋UlineS-12283
可封口袋Fisher ScientificS31798C
商用冰袋Cole-Parmer06345-20
冷藏安全箱Diversified BiotechCSF-BOX
纱布海绵Fisher Scientific22-415-469
量筒Cole-Parmer06135-904-L 或更大
Hype WipeFisher Scientific14-412-56
iButtons 温度数据记录仪MaximDS1921G
保温储存与运输箱Fisher Scientific11-676-12
封箱胶带U.S. Plastics50083
便携式氯比色计 II 试剂盒Hach5870062
便携式 pH 与温度探针OmegaPHH-830
便携式浊度计OmegaTRB-2020-E
聚四氟乙烯（PTFE）螺纹密封带Cole-Parmer08270-34所有螺纹连接处均需使用
泵，磁力驱动离心泵Cole-Parmer72010-20
变径管接头Cole-Parmer06349-87
次氯酸钠（NaClO）使用本地可得的家用漂白剂
硫代硫酸钠（Na2S2O3）Sigma Aldrich217247
外科手套Fisher Scientific19-058-800
防水记号笔Fisher Scientific22-290546
培养基成分
0.525% 次氯酸钠（NaClO）通过将家用漂白剂用去离子水（dH2O）按 1:10 比例稀释，配制 0.525% 的 NaClO 溶液。  0.525% NaClO 溶液可在室温下储存最多 1 周。 
 
 
 
 
[header]
1 M 五水合硫代硫酸钠（Na2S2O3）将 248.2 g 的 Na2S2O3 溶解于 1 L 去离子水（dH2O）中，配制成 1 M 溶液。  硫代硫酸钠溶液可在室温下储存最多 6 个月。

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病毒采样正电性滤膜水过滤肠道病毒检测诺如病毒检测流速校准无菌操作滤膜堵塞样品体积
EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。I. 病毒样品的采集
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